Để kiểm tra hiệu quả của quá trình knock-down gene ST3Gal-I bằng chuyển nhiễm siRNA, chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen, sau đó tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA tổng số thu được ở trên với bộ High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystem) và chạy phản ứng Real time PCR (RT-PCR). Hai mẫu tế bào MCF7 chuyển nhiễm siRNA và scramble RNA được chúng tôi tách chiết RNA tổng số rồi đo hàm lượng thu được bằng hệ thống NanoDrop. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.3
Bảng 4.2. Hàm lượng RNA tổng số của các mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
siRNA 274.18 ng/µl scramble RNA 333.41 ng/µl.
Hình 4.3. Định lượng RNA tổng số của các mẫu thu được bằng hệ thống NanoDrop của Thermo Scientific
Kết quả ở hình 4.3 và bảng 4.2 cho thấy lượng RNA tổng số ở mẫu MCF7-siST3Gal-I đạt 274.18 ng/µl và mẫu MCF7-scrambleRNA đạt 333.41 ng/µl. Như vậy, lượng RNA tổng số thu được là lớn, tinh sạch và phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo của chúng tôi.
Sau khi định lượng RNA tổng số, 1 µg RNA tổng số của mỗi mẫu được đưa vào để tổng hợp cDNA theo như đã được trình bày ở phần phương pháp. Sau khi có mẫu cDNA, chúng tôi tiến hành phản ứng RT- PCR để kiểm chứng hiệu quả knock-down gene ST3Gal-I trong các mẫu thí nghiệm. Với 2 mẫu này, chúng tôi sử dụng bộ mồi cho gene ST3Gal-I và bộ mồi cho gene housekeeping Hprt1 (bộ mồi cho gene housekeeping Hprt1 được xem là gene đối chứng) để kiểm tra. Kết quả được chúng tôi trình bày ở bảng 4.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 4.3. Hiệu quả knock-down gene ST3Gal-I sau khi chuyển nhiễm siRNA
Các chỉ số so sánh
Gene Mẫu đối chứng
Mẫu knock-down
St3gal1 21.7174 25.0197
Hprt1 21.332 21 Sự sai khác giữa hai bộ mồi trong cùng
một mẫu(Delta t) Dt 0.3854 4.0197 Sự sai khác giữa mẫu có gene knock-
down và mẫu đối chứng (Delta delta T) Ddt 3.6343 % tế bào còn lại không bị knock-down
gene Fold 100%
0.080531667 (8.05%) Kết quả bảng 4.3 cho thấy số tế bào MCF7 không bị knock-down bằng chuyển nhiễm siRNA chỉ còn lại 8,05%. Như vậy, siRNA đã được chuyển nhiễm thành công vào tế bào MCF7 với hiệu quả knock-down gene là 91,95% (gần 92%) so với đối chứng. Hay nói cách khác, quy trình chuyển nhiễm bằng siRNA để knock-down gene ST3Gal-I trên tế bào ung thư vú MCF7 thông qua bộ chuyển nhiễm LipofectaminTM
RNAiMAX là hoàn toàn phù hợp và cho hiệu quả cao, điều này cho thấy có thể ứng dụng để nghiên cứu trên các loại tế bào ung thư khác nữa.
Peter Hahn và cộng sự đã tiến hành knock-down gene CDC2 vào tế bào MCF-7 và HeLa S3. Kết quả cho thấy hiệu quả của quá trình này chỉ khoảng 15-18% trên cả 2 dòng tế bào
(http://mms.technologynetworks.net/posters/0144.pdf).
Như vậy, quy trình chuyển nhiễm siRNA vào tế bào MCF7 để knock-down gene ST3Gal-I của chúng tôi đã đạt hiệu quả cao so với kết quả của Peter Hahn và cộng sự.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn