Phân tích bằng phổ khối là một kĩ thuật dùng để đo đạc tỉ lệ khối lượng/điện tích của ion. Khối phổ MALDI-TOF-MScó rất nhiều ứng dụng,
10 15 25 35 55 70 100 130 250 kDa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đặc biệt là ứng dụng trong công nghệ sinh học để xác định sự biểu hiện của protein. Các protein nếu được ion hóa theo phương pháp MALDI-TOF-MS này thì những protein ở dạng dư thừa nhiều sẽ có xu hướng giảm tín hiệu so với những protein ít dư thừa hơn.
Sau khi nhuộm bạc, chúng tôi tiến hành in-gel digestion và gửi đi phân tích khối phổ. Các kết quả phân tích phổ khối (Mass spectrophotometer - MS) giúp nhận dạng sự sai khác của các glycoprotein trên màng tế bào khi gene ST3Gal-I bị knock-down. Kết quả phân tích khối phổ chúng tôi thu được một kho dữ liệu khổng lồ về sự biểu hiện của các glycoprotein này. Tuy nhiên, trong luận văn này chúng tôi chỉ trình bày kết quả phân tích khối phổ của 3 glycoprotein (DAG1, CD46, LAMP2) trên màng tế bào MCF7.
Bảng 4.5 Kết quả phân tích khối phổ protein
Mass: 97381 Score: 49 Queries
matched: 4 emPAI: 0.07 Tax_Id=9606 Gene_Symbol=DAG1 Dystroglycan Query Observed Mr(expt) Mr(calc) ppm Miss Score Expect Rank Peptide
1803 400.5628
1198.6666 1198.6670 -0.33 1 39 0.0098 1 K.LREQQLVGEK .S 1802 1804 1805 Mass: 44209 Score: 63 Queries
matched: 2 emPAI: 0.07
Tax_Id=9606 Gene_Symbol=CD46 Isoform B of Membrane cofactor protein
Query Observed Mr(expt) Mr(calc) ppm Miss Score Expect Rank Peptide 2512 687.8132 1373.6118
1373.6099 1.41 0 41 0.005 1 K.ADGGAEYATY QTK.S 2511 Mass: 44932 Score: 69 Queries
matched: 2 emPAI: 0.07
Tax_Id=9606 Gene_Symbol=LAMP2 Isoform LAMP-2A of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2
Query Observed Mr(expt) Mr(calc) ppm
Miss Score Expect Rank Peptide
903 494.2806 986.5466 986.5549 -8.37 0 61 8e-005 1 R.IPLNDLFR.C 9 04
Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy 3 protein này đều có sự sai khác giữa mẫu đối chứng và mẫu knock-down gene ST3Gal-I. Các protein này ở mẫu bị knock-down gene ST3Gal-I không thấy xuất hiện hoặc xuất hiện với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hàm lượng thấp hơn nhiều so với ở mẫu đối chứng (không bị knock-down gene ST3Gal-I là: (i) protein DAG1 - Dytroglycan, khối lượng phân tử 37,73 kDa (từ băng 35 kDa); (ii) CD46 - Isofrom B của membrane cofactor protein khối lượng phân tử 55-65 kDa (từ băng 60 kDa); (iii) và LAMP2 - Isoform LAMP-2 của Lysosome-associated membrane glycoprotein 2, khối lượng phân tử 100 kDa (từ băng 105 kDa)). Sư sai khác của 3 protein này giữa mẫu đối chứng và mẫu knock-down là có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
Cac protein DAG1, CD46, LAMP2 đều là những glycoprotein nằm trên màng tế bào và đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình di căn của tế bào ung thư. Tuy nhiên, hiện tại chưa có báo cáo nào đề cập đến mối liên quan giữa ST3Gal-I với các glycoprotein này nghiên cứu trên ung thư vú MCF7. Do vậy, mối liên quan này có thể là một mắt xích trong chuỗi phản ứng tác động của gene ST3Gal-I đến sự tăng cường di căn của tế bào ung thư và cần được nghiên cứu sâu hơn nữa.
Có rất nhiều báo cáo nghiên cứu sự biểu hiện của một số protein thông qua việc chuyển nhiễm bằngsiRNA.
Wang Yi-hua và cộng sự (2005) đã sử dụng siRNA để làm giảm biểu hiện của c-Myc trong tế bào MCF-7. Biểu hiện của c-Myc cao là một dấu hiệu bất thường và thường thấy trong bệnh ác tính. c-Myc cũng giữ một vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư vú. Kết quả cho thấy, siRNA đã làm giảm biểu hiện của c-Myc trong tế bào MCF-7 lên đến 80% làm giảm tỷ lệ tăng trưởng của tế bào MCF-7, ức chế đáng kể sự phát triển khối u ở chuột nude. Đồng thời, thúc đẩy quá trình apoptosis của tế bào MCF-7 (Wang Yi-hua et al, 2005).
Trong một nghiên cứu khác, Zhang Y và cộng sự (2006) đã tiến hành xây dựng một plasmid siRNA để chống lại gene X-gene liên kết với chất ức chế apoptosis (XIAP), sau đó sử dụng tế bào ung thư vú MCF-7 để đánh giá chức năng của chúng. Kết quả cho thấy, sau khi siRNA được chuyển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vào tế bào MCF-7, sự biểu hiện của gene XIAP bị ức chế đáng kể (90%). Các hoạt động tăng trưởng trong tế bào MCF-7 được chuyển siRNA chống lại plasmid XIAP giảm rõ rệt, đã bắt giữ chu kỳ tế bào trong giai đoạn G1, ức chế tăng sinh tế bào một cách đáng kể, và có xu hướng thúc đẩy sự tự hủy diệt tế bào. Nghiên cứu này cũng cho thấy, tế bào MCF7 được chuyển siRNA chống lại plasmid thể hiện quá trình apoptosis 72.2%, rất nhiều mô hoại tử được quan sát thấy trong các siRNA chống lại plasmid XIAP đã được chuyển. Tuy nhiên, không có tác dụng ức chế siRNA tương tự ở nhóm đối chứng. Đây có thể được xem là một phương pháp đầy triển vọng trong điều trị ung thư (Zhang Y et al., 2006).
Nghiên cứu của Bernard-Gallon DJ và cộng sự (2010) đã sử dụng siRNA để knock-down gene BRCA2 trên các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7, MDA-MB-231, MCF-10a). Vì gene BRCA2 có liên quan rất nhiều đến tính di truyền và không liên tục trong ung thư vú. Đồng thời, sau khi ức chế sự biểu hiện BRCA2, các tế bào được duy trì trong các điều kiện khác nhau và được xử lí bằng daidzein hoặc geneistein hoặc không xử lí gì. Phân tích các mRNA sau khi gene BRCA2 bị knock-down vào tế bào MCF-7, MDA-MB-231 và MCF-10a bằng phương pháp Microarray. Kết quả cho thấy 35 gene có sự thây đổi đáng để so với đối chứng (Bernard- Gallon DJ et al, 2010).
Năm 2010, Yuchao Gu và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế phân tử cơ bản của quá trình di cư và xâm lấn của GM3S qua trung gian tế bào, cũng như một số con đường tín hiệu liên quan đến quá trình di căn. Vì GM3S thúc đẩy các tế bào ung thư vú di cư và xâm lấn thông qua các PI3K/Akt. Kết quả cho thấy, GM3S đã tăng cường đáng kể lượng Akt. Yuchao Gu và cộng sự (2008) cũng đã chứng minh rằng PI3K, đặc biệt là chất ức chế LY294002 (2 mmol/l) đã phục hồi mức độ phosphoryl hóa Akt bởi các tế bào 4T1-siMock, đồng thời sự ức chế tế bào di cư/xâm lấn bị giảm đi khi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
GM3S bị knock-down. PTEN không được coi là một dấu hiệu lớn của con đường tín hiệu PI3K/Akt. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, khi gene GM3S bị knock-down nó đã ức chế sự biểu hiện của PTEN trong tế bào 4T1. Những phát hiện này gợi ý rằng sự ức chế biểu hiện PTEN có thể là yếu tố để kích hoạt của con đường PI3K/Akt trong tế bào 4T1 khi GM3S bị knock-down (Yuchao Gu et al, 2010).
Li Xu Yan và cộng sự (2011) đã knock-down gene miR-21 vào tế bào ung thư vú dòng MCF-7 và dòng MDA-MB-231. Gene miR-21 là một gene chìa khóa trong bệnh ung thư, quy định sự phát triển của bệnh ung thư. Kết quả cho thấy, khi gene miR-21 bị knock-down vào tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 nó đã ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư vú này trên cả in vitro và in vivo. Đồng thời, khi gene miR-21 bị knock- down đã làm tăng đáng kể sự biểu hiện của protein ANKRD46, điều này mở ra hướng quan trọng trong điều trị ung thư (Li Xu Yan et al, 2011).
Sproviero D và cộng sự (2012) cũng sử dụng siRNA để knock-down COX-2 và phân tích sự biểu hiện của COX-2 trong tế bào ung thư vú dòng MDA-MB-231. Kết quả chỉ ra rằng COX-2 đã làm giảm biểu hiện của ST3Gal-I ở 74 bệnh nhân ung thư (Sproviero D et al, 2012).
Các nghiên cứu trên đều cho thấy khi sử dụng siRNA để knock- down gene trên các dòng tế bào ung thư khác nhau sẽ làm giảm biểu hiện của gene nào đó. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về sự biểu hiện của một số protein khi gene ST3Gal-I bị knockdown là hoàn toàn phù hợp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1. Đã thành công trong việc chuyển nhiễm siRNA vào tế bào ung thư vú MCF7 để knock-down gene ST3Gal-I với hiệu quả 91,95% và không làm ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào.
2. Khi gene ST3Gal-I bị knock-down hình thái tế bào và sự biểu hiện của các protein: Akt, P42/44, actin, GSK3β, PODCL đã bị ảnh hưởng.
3. Gene ST3Gal-I có thể tác động tới quá trình di căn của tế bào ung thư thông qua việc tác động tới sự biểu hiện của glycoprotein màng tế bào như DAG1, CD46 và LAMP2.
2. KIẾN NGHỊ
Những kết quả chúng tôi thu được mới chỉ là những kết quả bước đầu. Chúng tôi nhận thấy cần có những nghiên cứu sâu hơn nữa về mối liên quan giữa gene ST3Gal-I với sự di căn của tế bào ung thư, cụ thể là tế bào ung thư vú MCF7, để có thể phần nào nhận dạng cơ chế di căn của căn bệnh ung thư, căn bệnh nguy hiểm hiện nay.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đái Du y Ban , Lữ Thị Cẩm Vân , Đái Thị Ng ân Hà , Đái Thị Hằng Nga (2000) Phòng bệnh ung thư. Nxb Y học Hà Nội.
2. Nguyễn Chân Hùng (1994) Tìm hiểu bệnh ung thư. NXB thành phố Hồ Chí Minh.
3. Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA gây bất hoạt gene và tiềm năng ứng dụng to lớn.Tạp chí Công nghệ sinh học 5(3): 265-275.
Tài liệu tiếng Anh
4. Bernard-Gallon DJ, Satih S, Chalabi N, Rabiau N, Bosviel R, Fontana L, Bignon YJ (2010) Phytoestrogenes regulate the expression of genes involved in different biological processes in BRCA2 knocked down MCF-7, MDA-MB-231 and MCF-10a cell lines. Oncol Rep 23(3): 647-653.
5. Burgering BM and Coffer PJ (1995) Nature 376: 599-602.
6. Cazet A, Julien S, Marie Bobowski M, Krzewinski-Recchi M A, Harduin-Lepers A, Groux-Degroote S, Delannoy P (2010) Consequences of the expression of sialylated antigenes in breast cancer. Carbohydrate Research 345: 1377-1383.
7. Crocker PR (2002) Siglecs: sialic-acid-binding immunoglobulinlike lectins in cell-cell interactions and signalling. Curr Opin Struct Biol
12: 600-615
8. Darnell J, Losdish H, Baltimore D (1990) Molecular cell biology.
Scientific American Books 5: 151-186.
9. Drickamer K (1993) A conserved disulphide bond in sialyltransferases. Glycobiology 3: 2-5.
10.Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, and Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
11.Franke TF, Kaplan DR, Cantley LC (1997) PI3K: downstream AKTion blocks apoptosis. Cell 88(4): 435-437
12.Fukuda M (1995) Carbohydrate-dependent cell adhesion. Bioorg Med Chem 3: 207-215.
13.Geremia RA, Harduin-Lepers A and Delannoy P (1997) Identification of two novel conserved amino acid residues in eukaryotic sialyltransferases: implications for their mechanism of action. Glycobiology 7: 5-7.
14.Ghildiyal M and Zamore PD (2009) Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet 10: 94-108.
15.Guo S, and Kemphues K J (1995) Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81: 611- 620. 16.Gillespie W, Kelm S and Paulson JC (1992) Cloning and expression
of the Galβ1-3GalNAc α2,3-sialyltransferase. J Biol Chem 267: 21004-21010.
17.Haltiwanger RS, Lowe JB (2004) Role of glycosylation in development. Annu Rev Biochem 73: 491-537
18.Hanahan D, Weinbeirg RA (2000) The hallmark of cancer. Cell
100(1): 57-70.
19.Harduin-Lepers A, Recchi M.-A, Delannoy P (1995) 1994, the year of sialyltransferases. Glycobiology 5: 741-758.
20.Ishii A, Ohta M, WatanabeY, Matsuda K, Ishiyama K, Sakoe K, Nakamura M, Inokuchi J, Sanai Y and Saito M (1998) Expression cloning and functional characterization of human cDNA for ganglioside GM3 synthase. J Biol Chem 273: 31652-31656.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21.Kannagi R, Izawa M, Koike T (2004) Carbohydrate-mediated cell adhesion in cancer metastasis and angiogenesis. Cancer Sci 95: 377- 384
22.Kanoelani TP, Mahal LK (2007) Deciphering the glycocode: the complexity and analytical challenges of glycomics. Curr Opin Chem Biol 11: 300-305.
23.Kelm S and Schauer R (1997) Sialic acids in molecular and cellular interactions. Int Rev Cytol 175: 137-240.
24.Kitagawa H and Paulson JC (1993) Cloning and expression of human Galβ1,3(4) GlcNAc α2,3-sialyltransferase. Biochem Biophys Res Commun 194: 375-382.
25.Kitagawa H and Paulson JC (1994a) Cloning of a novel α2,3- sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J Biol Chem 269: 1394-1401.
26.Kitagawa H and Paulson JC (1994b) Differential expression of five sialyltransferase genes in human tissues. J Biol Chem 269: 17872- 17878.
27.Klattenhoff C, Theurkauf W (2008) Biogenesis and germline functions of piRNAs. Development 135: 3-9.
28.Koji Higai, Saki Ishihara, and Kojiro Matsummoto (2006) NFk kB- p65 Dependent Transcriptional Regulation of Glycosyltransferases in Human Colon Adenocarcinoma HT-29 by Stimulation with Tumor Necrosis Factor α. Biol Pharm Bull 29(12): 2372-2377.
29.Kurosawa N, Hamamoto T, Inoue M and Tsuji S (1995) Molecular cloning and expression of chick Galβ1-3GalNAc α2,3- sialyltransferase. Biochim Biophys Acta 1244: 216-222.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30.Kurosawa N, Hamamoto T, Lee Y C, Nakaoka T, Kojima N and Tsuji S (1994) Molecular cloning and expression of GalNAc α2,6- sialyltransferase. J Biol Chem 269: 1402-1409.
31.Lee YC, Kurosawa N, Hamamoto T, Nakaoka T and Tsuji S (1993) Molecular cloning and expression of Galβ1-3GalNAcα2,3- sialyltransferase from mouse brain. Eur J Biochem 216: 377-385.
32.Li Xu Yan, Qi Nian Wu, Yan Zhang, Yang Yang Li, Ding Zhun Liao, Jing Hui Hou, Jia Fu, Mu Sheng Zeng, Jing Ping Yun, Qiu Liang Wu, Yi Xin Zeng and Jian Yong Shao (2011) Knockdown of
miR-21 in human breast cancer cell lines inhibits proliferation, in vitro migration and in vivo tumor growth. Breast Cancer Research
13(1).
33.Lowe JB (2002) Glycosylation in the control of selectin counterreceptor structure and function. Immunol Rev 186: 19-36. 34.Marcos NT et al (2004) Role of the Human ST6GalNAc-I and
ST6GalNAc-II in the synthesis of the cancer-associated Sialyl-Tn Antigene. Cancer Res 64: 7050-7057
35.Moody A M et al (2003) Sialic Acid Capping of CD8_Core 1-O-
Glycans Controls Thymocyte-Major Histocompatibility Complex Class I Interaction. Journal of Biological Chemistry 278(9): 7240-
7245.
36.Morris KV and Vogt PK (2010) Long antisense non-coding RNAs and their role in transcription and oncogenesis. Cell Cycle 9(13): 2544-547.
37.Napoli C, Lemieux C, and Jorgenesen R (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co- suppression of homologous genes in trans. Plant Cell2: 279-289.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
38.Okajima T, Fukumoto S, Miyazaki H, Ishida H, Kiso M, Furukawa K, Urano T and Furukawa K (1999) Molecular cloning of a novel α2,3-sialyltransferase (ST3Gal VI) that sialylates type II lactosamine structures on glycoproteins and glycolipids. J Biol Chem 274: 11479- 11486.
39.Paulson JC and Colley KJ (1989) Glycosyltransferases: structure, localization and control of cell type-specific glycosylation. J Biol Chem 264: 1761-1768.
40.Pestka S, Daugherty BL, Jung V, Hotta K, Pestka RK (1984) Anti- mRNA: specific inhibition of translation of single mRNA molecules.
Proc Natl Acad Sci USA 81: 7525-7528.
41.Pezzuto JM (1995) Natural produce cancer chemopreventive agenets. Phytochemistry of medicinal Plants. Plenum Press, New York 2: 19-45.
42.Sasaki K, Watanabe E, Kawashima K, Sekine S, Dohi T, Oshima M, Hanai N, Nishi T and Hasegawa M (1993) Expression cloning of a novel Gal (β1-3/1–4)GlcNAc α2,3-sialyltransferase using lectin resistance selection. J Biol Chem 268: 22782-22787.
43.Schauer R (2000) Achievements and challenges of sialic acid research. Glycoconj J 17 (7-9): 485-499.
44.Schneider F, Kemmner W, Haensch W, Franke G, Gretschel S, Karsten U, Schlag PM (2001) Overexpression of sialyltransferase CMP-sialic acid:Galbeta1,3GalNAc-R alpha6-Sialyltransferase is related to poor patient survival in human colorectal carcinomas.
Cancer Res 61(11): 4605-4611.
45.Sproviero D, Julien S, Burford B, Taylor-Papadimitriou J, Burchell JM (2012) Cyclooxygenease-2 induces the expression of the alpha 2,3 sialyltransferase-3 (ST3Gal-I) in breast cancer. J Biol Chem
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
46.Timmons L, Fire A (1998) Specilec interference by ingested dsRNA.
Nature 395: 854
47.Tsuji S (1998) Sialyltransferase superfamily: structure and function.
Tanpakushitsu Kakusan Koso 43: 2338-2348.