Applied Biosystem
Sau khi thu được RNA tổng số thì tiến hành kiểm tra hàm lượng RNA tổng số thu được của các mẫu nghiên cứu bằng hệ thống NanoDrop 3300 của Thermo Scientific. Tiếp đó, tiến hành tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA thu được ở trên với bộ High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystem) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Theo đó, lượng mẫu RNA tổng số cho phản ứng là 1 µg trong 10 µl master mix (10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
X RT buffer; 2 X dNTP mix 10 mM; 10 X random primer; Multiscribe reverse transciptase và Nuclease free H2O).
Sau khi có sản phẩm cDNA, tiến hành phản ứng RT-PCR. Quá trình được tiến hành trên mẫu tế bào MCF7 có knock-down ST3Gal-I bằng siRNA, mẫu tế bào MCF7 đối chứng sử dụng scramble RNA. Gene đối chứng được sử dụng là Hprt1. Phản ứng RT-PCR được thực hiện bằng kit TagmanGene Expression Assay (Applied Biosystem) trên hệ thống Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System. Hỗn hợp phản ứng gồm:
- 1,25 µl primer
- 6,25 µl master mix (từ kit) - 0,5 µl cDNA
- 12 µl DEPC H2O
- Tm của mẫu MCF7-siST3GalI-ST3GalI là 68.60C; của mẫu MCF7- scrambleRNA-ST3GalI là 71.30C; của mẫu MCF7-siST3GalI-Hprt.1 là 760C; của mẫu MCF7-scrambleRNA-Hprt.1 là 71.60
C.
- Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: 50°C - 2 phút; 95°C - 10 phút; 95°C - 15 giây; 60°C - 1 phút; 95°C - 15 giây; 60°C - 1 phút; 95°C - 15 giây; 60°C - 15 giây; 4°C- 24 giờ; Primer cho ST3GAL-I là: forward, 5’-GGACCCTGAAAGTGCTCA-3’; reverse, 5’- TCTCCAGCATAGGGTCCA-3’ và HPRT1 là forward, 5’- TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’; reverse, 5’- GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’.