Phương pháp định lượng vitamin a trong thực phẩm

Định lượng vitamin a

Trường ĐH Công Nghiệp Thực PhẩmTp HCM

Khoa Công Nghệ Thực Phẩm



Bài Tiểu Luận

Đề tài: Phương pháp định lượng Vitamin A trong thực phẩm.

GVHD: Vũ Hoàng Yến.

Nhóm:

Buổi sáng thứ 4 - tiết 5, 6.

Bảng Phụ Lục

Phương Pháp Định Lượng Vitamin A

Trong Thực Phẩm.

1. Tổng Quan Về Vitamin A

1.1 Lịch sử phát triển

Năm 1909, Step đã cho chuột ăn thực phẩm đã bị rút hết chất béo bằng hỗn hợp este – rượu Bằng cách này chuột bị sụt cân nhanh chóng và chết, nếu thêm vào thực phẩm yếu tố đã bị rút ra thì động vật hồi phục sức khỏe và tiếp tục phát triển Step đã đưa ra nhận xét rằng: ‘Trong thực phẩm có các yếu tố hòa tan trong chất béo cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể gọi là yếu tố A, sau này gọi là Vitamin nhóm A’.

Năm 1913, Maccollins và Davis chiết xuất được Vitamin A từ bơ và lòng đỏ trứng gà.

Năm 1920, Osborn và Mendel cùng một số tác giả khác đã phát hiện thấy có một số hợp chất tương tự ở thực vật và sau đó tới Eiler (1929), Mur (1930) đã đưa

ra ý kiến cho rằng các hợp chất tương tự đó, các Caroten chính là tiền thân của Vitamin A hay còn gọi là Provitamin A.

Năm 1928 – 1930, Karrer dung phương pháp sắc ký để phân chia để phát hiện

ra cấu trúc của Vitamin A và Caroten.

Năm 1947, Ister thực hiện quá trình tổng hợp Vitamin A.

Năm 1959, nhiều nhà khoa học trong đó có Karrer tổng hợp thành công chất β –Caroten là một trong số 3 dạng đồng phân quan trọng của Vitamin A.

1.2 Cấu tạo

Vitamin A được gọi là chất chống lồi mắt hay axerophtol gồm có 3 đồng phân Al, A2, A3 và chất provitamin (tiền vitamin) có màu vàng gọi là carotene

Hình 1.1 Cấu tạo Vitamin A1, Vitamin A2 và Vitamin A3.

Trong đó, có 2 dạng đồng phân quan trọng là Vitamin A1 và Vitamin A2.

Vitamin A1 : thường gặp nhiều ở gan cá nước mặn, có tên khác là Retinol là một ancol bậc một có công thức phân tử là C 20 H 30 O Retinol dễ dàng bị Oxi hóa chuyển thành dạng andehyde có tên là Retinal (retinaldehyde) Hoặc oxi hóa tiếp chuyển thành dạng acid (acid Retinoic).

Hình 1.2 Các chất chuyển hóa từ Retinol.

Vitamin A2 : thường gặp nhiều ở gan cá nước ngọt, có công thức phân tử là

C 20 H 28 O khác với Vitamin A1 là có thêm một nối đôi ở vị trí C 3 và C 4 của vòng ionon, nhưng hoạt tính lại thấp hơn Vitamin A1 từ 2-3 lần Công thức cấu tạo cũng có 3 dạng gần tương tự như Vitamin A1.

Hình 1.3 Các chất chuyển hóa từ Vitamin A2.

Ngoài ra, Vitamin A1 có quang phổ hấp thu tối đa ở bước sống 610nm đến 620

nm, Vitamin A2 có bước sóng từ 692nm đến 696nm Ta có thể dùng quang phổ để định lượng Vitamin A.

Gần đây người ta đã phân lập được vitamin A3 ở gan cá voi (công thức còn nghiên cứu)

Tiền chất β – caroten: có 3 loại caroten α, β, γ khác nhau ở cấu tại vòng ionnon, β

- caroten có 2 vòng β - ionnon nên khi thuỷ phân cho 2 vitamin A còn α và γ (caroten chỉ có 1 vòng β - ionon (ngoài ra là α - ionon) nên chỉ cho một phân tử vitamin

Hình 1.4 Một phân tử β – caroten sẽ chuyển hóa thành 2 phân tử Vitamin A

1.3 Tính chất

− Không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi của lipit, ete, ethanol…

− Bền trong điều kiện yếm khí, bền với acid và kiềm ở nhiệt độ không quá cao.

A.

− Dưới tác dụng của enzyme dehyrogenase thì retinol chuyển sang dạng retinal.

− Phản ứng với SbCl 3 cho phức chất màu xanh.

− Phản ứng với H 2 SO 4 cho phức chất màu nâu

1.4 Vai trò

Vitamin A là một loại vitamin tan trong dầu, rất cần thiết đối với cơ thể.Chi phối nhiều quy trình sinh lý của cơ thể, có thể minh họa một cách tóm lược chức năng

đa dạng của Vitamin A như sau :

− Bảo vệ cấu trúc của da niêm trong toàn cơ thể.

− Yểm trợ thị giác trong quy trình phân biệt vùng sáng và bóng tối.

− Xúc tác sự phóng thích kích tố sinh dục và hưng phấn trong quá trình thụ thai.

− Ức chế độc tố sinh ung thư và gây xơ cứng tế bào.

Vitamin A có vai trò đặc biệt quan trong đối với sự phát triển của trẻ nhỏ và phụ nữ mang thai.

Bốn chức năng cơ bản của Vitamin A đối với cơ thể người:

- Đối với mắt: Giúp cho các tế bào trong một loạt cấu trúc của mắt luôn khỏe mạnh.

Ngoài ra, nó còn rất quan trọng đối với sự biến đổi ánh sáng thành các tín hiệu thần kinh trong võng mạc, trong máu vitamin A dưới dạng retinol sẽ chuyển thành retinal Trong bóng tối, retinal kết hợp với opsin (là một protein) để cho rhodopsin là sắc tố nhạy cảm với ánh sáng ở võng mạc mắt, giúp võng mạc nhận được các hình ảnh trong điều kiện thiếu ánh sáng Sau đó, khi ra sáng rhodopsin lại bị phân huỷ cho opsin và trans-retinal, rồi trans-retinal vào máu để cho trở lại cis-retinol. Nhờ quá trình này giúp võng mạc nhận biết được các hình ảnh khi thiếu ánh sáng Nếu thiếu vitamin A, khả năng nhìn của mắt lúc ánh sáng yếu sẽ bị giảm Hiện tượng này thường xuất hiện vào lúc trời nhá nhem tối, được gọi là chứng “quáng gà”

Hình 1.5 Cơ chế phát sinh bệnh quáng gà

- Đối với mô và tổ chức da: Vitamin A cần thiết cho sự bảo vệ toàn vẹn của biểu mô

giác mạc và các tổ chức biểu mô dưới da, khí quản, các tuyến nước bọt, ruột non, tinh hoàn Khi thiếu vitamin A, sự sản xuất các niêm dịch bị giảm, da bị khô và xuất hiện

sừng hóa, biểu hiện này thường thấy ở mắt, lúc đầu là khô kết mạc rồi tổn thương đến giác mạc, nặng hơn sẽ làm thủng giác mạc và dẫn đến mù lòa

- Đối với sự tăng trưởng và phát triển của thai nhi và trẻ nhỏ: Vitamin A có ảnh

hưởng tới những gen quyết định sự phát triển liên tiếp của một số cơ quan trong quá trình phát triển phôi thai Với trẻ em, vitamin A giúp phát triển chiều cao và cân nặng, thiếu vitamin A làm xương mềm và mảnh hơn bình thường, quá trình vôi hóa bị rối loạn Thiếu vitamin A, trẻ sẽ chậm phát triển về thể chất hơn so với trẻ bình thường cùng lứa tuổi

Đối với hệ miễn dịch: Vitamin A cần cho chức năng của tế bào võng mạc, biểu mô

-hàng rào quan trọng bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhập của vi khuẩn từ bên ngoài Hai hệ thống đáp ứng miễn dịch của cơ thể con người (miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào) đều chịu ảnh hưởng của vitamin A và các chất chuyển hóa của chúng

Ngoài ra, vitamin A còn cần thiết cho chức năng sinh sản, vì nó gây ảnh hưởng lên chức năng và sự phát triển của tinh trùng, buồng trứng và nhau thai

Như vậy với mọi lứa tuổi, đặc biệt với phụ nữ có thai và trẻ em thì vitamin A là rất cần thiết

1.5 Nhu cầu

Thiếu hay thừa vitamin A đều gây bệnh

− Trẻ em dưới 3 tuổi: 600 mcg/ngày (2000 IU/ngày)

− Trẻ em từ 4-8 tuổi: 900 mcg/ngày (3000 IU/ngày)

− Trẻ em từ 9-14 tuổi: 1700 mcg/ngày(5666 IU/ngày)

− Người lớn: 3000 mcg/ngày (10000 IU/ngày)

− Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú: 3000 mcg/ngày

Thiếu Vitamin A:

Một trong những biểu thị đầu tiên của thiếu hụt vitamin A là thị lực suy giảm,

chiếu sáng thấp) Thiếu hụt liên tục sẽ sinh ra một loạt các thay đổi, có tính chất hủy hoại nhiều nhất diễn ra ở mắt Các thay đổi về thị giác được gọi chung là bệnh khô mắt Đầu tiên là sự khô đi của màng kết do biểu mô của tuyến tiết nước mắt và nước nhầy bị thay thế bằng biểu mô keratin hóa Tiếp theo là sự tích tụ các mảnh vụn

toàn phần Các thay đổi khác còn có suy giảm miễn dịch, giảm chiều dày lớp vảy ở da

(các bướu nhỏ màu trắng ở nang tóc), bệnh da gà (Keratosis pilaris) và squamous metaplasia của biểu mô ở bề mặt của lối vào phía trên của hệ hô hấp và bàng quang , với lớp biểu mô bị keratin hóa.

Thừa Vitamin A:

Do vitamin A hòa tan trong chất béo, việc thải lượng dư thừa đã hấp thụ vào từ

ăn uống là khó khăn hơn so với các vitamin hòa tan trong nước như các vitamin B và

C (các vitamin tan trong nước khi dư thừa thì được cơ thể tự đào thải qua bài tiết hoặc tiêu hoá) Do vậy, quá liều có thể dẫn tới ngộ độc vitamin A Nó có thể gây buồn nôn, vàng da, dị ứng, chứng biếng ăn, nôn mửa, nhìn mờ, đau đầu, tổn thương cơ và bụng, uể oải và thay đổi tính tình Trong các trường hợp kinh niên, rụng tóc, khô

thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêm trọng

1.6 Nguồn gốc

Từ động vật: có nhiều trong gan, trong cơ thịt có màu sẫm (thịt bò), trong lòng

đỏ trứng

Tên thực phẩm VitaminA (Retinol

tương đương mcg)

Tên thực phẩm VitaminA (Retinol

tương đương mcg)

2 Gan heo 6000 9.Sữa bột toàn phần 318

6 Trứng vịt lộn 875 13 Phó mát 275

Bảng 1.1 Hàm lượng vitamin A trong 100g thực phẩm ở một số thực phẩm

Từ thực vật: có chứa nhiều tiền vitamin A là carotene có nhiều ở cà rốt, đu đủ, gấc, bí đỏ…

Hình 1.6 Các thực phẩm chứa nhiều Vitamin A Ngoài ra, hiện nay có rất nhiều sản phẩm vitamin A ở dạng thuốc hay thực phẩm chức năng được tổng hợp từ thiên nhiên hay hóa học

Hình 1.7 Một số sản phẩm Vitamin A ở dạng thuốc (hay thực phẩm chức năng)

2.Các phương pháp định lượng Vitamin A trong thực phẩm.

Hoạt lực của vitamin A được tính theo đơn vị quốc tế (ký hiệu IU) 1 IU vitamin

A tương đương với 0,300μg retinol; 0,344 μg retinyl acetat; 0,359 μg retinyl propionat hoặc 0,550 μg retinyl palmitat.

Vitamin A rất dễ bị oxy hoá nên điều kiện tiến hành chung là phải nhanh chóng, tránh ánh sáng và sử dụng kèm theo chất chống oxy hoá.

Một số phương pháp dùng để xác định hàm lượng Vitamin:

• Phương pháp Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

• Phương pháp so màu

• Phương pháp hóa học

2.1 Phương pháp sắc kí lỏng HPLC

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách và phân tích các thành phần cấu tử của một hỗn hợp cấu tử dựa vào tính chất hóa học, vật lý, hóa lý của các chất cần phân tích với pha động và pha tĩnh

2.1.1 Pha tĩnh trong HPLC

• Sắc ký pha thường:

− pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực

− pha động:các dung môi hữu cơ không phân cực như

 tách các chất không phân cực hay ít phân cực

• Sắc ký pha ngược:

− pha tĩnh là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37

− pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril

 tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

2.1.2 Pha động trong HPLC

− Pha động có độ phân cực thấp: xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluen

− Pha động có độ phân cực cao: nước(MeOH, ACN)

2.1.3 Detector (hệ thống chuyển tính hiệu quang sang tín hiệu điện) trong HPLC.

− Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

− Detector huỳnh quang RF

− Detector độ dẫn

2.1.4 Chuẩn bi.

• Nguyên tắc: Mẫu được xà phòng hóa với dung dịch kali hydroxit trong etanol và

vitamin A được tách chiết trong dầu nhẹ Loại bỏ dầu nhẹ bằng cách cho bay hơi

và phần cặn được hòa tan trong 2-propanol Nồng độ vitamin A trong dịch chiết 2-propanol được xác định bằng sắc ký lỏng pha đảo dưới các điều kiện cho pic đơn lẻ đối với tất cả các đồng phân retinol

• Thiết bị:

− Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS của Thermo bao gồm: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS

− Cột sắc ký C18 của Water (150mm × 4,6mm × 5μm)

− Máy lắc vortex

− Máy đồng nhất mẫu

− Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg)

− Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g)

• Dụng cụ:

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm các bộ phận sau:

nhóm octadecyl (C18) liên kết với silica.

− Cột có ít nhất 4 000 đĩa lý thuyết và giá trị k' = 0,6, cả hai cho thấy thỏa mãn đối với all-trans-retinol Cỡ hạt không được nhỏ hơn 5 µm và không lớn hơn

10µm Có thể sử dụng các hệ thống khác với điều kiện là tách hết được vitamin

A ra khỏi các chất chiết cùng khác.

phân/hệ thống xử lý dữ liệu.

xác định trong 9.6, được trang bị các cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 10 mm.

+ ống chiết hình trụ dung tích 1 lít có cổ bằng thủy tinh mài và có nút đậy;

điều chỉnh đi qua tâm.

sao cho lớp chất lỏng phía trên trong ống chiết có thể được chuyển sang phễu chiết dung tích 1 lít.

− Có thể sử dụng các dụng cụ chiết khác như các bình nón và các phễu chiết thay cho thiết bị nêu trong Hình 1 với điều kiện là đạt được các độ thu hồi vitamin A.

− Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 µm, để lọc pha động và các dung dịch mẫu thử.

• Dung môi, hóa chất

− Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết.

− Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích.

− Hòa tan 500 g kali hydroxit trong nước và pha loãng bằng nước đến 1 lít.

nghiệp tương đương.

− 2-propanol (C 3 H 7 OH).

− Dầu nhẹ, có điểm sôi trong khoảng từ 40 0 C đến 60 0 C.

khiết ít nhất 90%.

− All-trans-retinol, ancol vitamin A (C20H30O), 286,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.

− Trộn metanol với nước theo tỷ lệ 770:30 (theo thể tích).

− Dung dịch natri ascorbat, ρ = 100 g/l.

− Khí trơ, ví dụ: nitơ.

• Lưu ý:

thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

mẫu.

− Vì vitamin A nhạy với bức xạ tia cực tím và không khí, nên cần thực hiện tất cả các thao tác nhanh tránh ánh sáng huỳnh quang tự nhiên và mạnh Sử dụng dụng cụ thủy tinh màu nâu khi có thể Hoàn thành phép thử trong một ngày làm việc Thực hiện việc xà phòng hóa và chiết all-trans-retinyl axetat chuẩn và các mẫu thức ăn chăn nuôi cùng một lúc.

2.1.5 Cách tiến hành

− Thực hiện phản ứng xà phòng hóa:

vào bình nón 1 lít.

để trộn.

+ Lắp bình ngưng hồi lưu vào bình cầu và nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi.

bình.

dưới dòng nước lạnh

− Chiết xuất Vitamin A:

công nghiệp và chuyển nước tráng sang ống chiết hình trụ.

phần 250 ml nước ,mỗi lần tráng chuyển nước rửa sang ống chiết hình trụ.

giải phóng áp suất.

pha lỏng, trước khi tháo bỏ nắp.

+ Khi đã tách lớp, tháo bỏ nắp, rửa mặt trong nắp bằng một vài mililit dầu nhẹ và chèn ống có thể điều chỉnh ,chỉnh vị trí đầu dưới sao cho chỉ hơi trên mức phân lớp.

lớp dầu nhẹ phía trên sang phễu chiết 1 lít

+ Thêm 125 ml dầu nhẹ vào ống chiết hình trụ, đậy nắp và lắc đều 1 phút.

ống có thể điều chỉnh như trên.

phút.

dụng ống điều chỉnh như trên.

đầu chỉ nhẹ nhàng đảo ngược sau đó lắc nhẹ để giữ cho việc hình thành nhũ tương ở mức tối thiểu.

natri sulfat khan vào một bình cầu thích hợp để bay hơi chân không.

rửa qua bộ lọc vào bình cầu làm bay hơi.

bình làm bay hơi.

không quá 40 0 C.

+ Khôi phục lại áp suất khí quyển bằng cách nạp khí trơ.

− Sắc ký lỏng HPLC:

sang bình định mức 20 ml.

rửa vào bình định mức Pha loãng đến vạch bằng 2-propanol và trộn Đối với vật liệu có chứa trên 100 000 IU/kg, thì có thể cần phải pha loãng tiếp.

+ Chú thích: IU = Đơn vị quốc tế; 1 IU vitamin A = 0,300 µm của all-trans-retinol.

+ Nếu không thể tránh khỏi việc trì hoãn, thì bảo quản dịch chiết dưới khí trơ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 0 C và sau đó đưa trở lại nhiệt độ phòng ở nơi tối.

retinol.

+ Tính diện tích pic trung bình thu được từ các lần bơm lặp lại dịch chiết mẫu và xác định nồng độ retinol của dịch chiết bằng cách so sánh với diện tích pic trung bình tìm được của các lần bơm lặp lại của chuẩn retinol có nồng độ tương tự Thời gian lưu của retinol là khoảng 5 phút Thực hiện các lần bơm thay thế của dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn

+ Thủy phân all-trans-retinyl axetat để hiệu chuẩn

ml chứa khoảng 15 000 IU vitamin A

+ Dùng buret 5 ml với vạch chia 0,02 ml, chuyển 2,5 ml ± 0,02 ml dung dịch này sang bình cầu 150 ml.

ascorbat

và để hồi lưu trong 60 phút.

lượng chứa trong bình sang phễu chiết.

tráng sang phễu chiết.

mỗi lần 50 ml dầu nhẹ

+ Gộp tất cả các dịch chiết bằng dầu nhẹ, sau đó rửa hai lần mỗi lần 50 ml nước Thêm 2 g natri sulfat khan

+ Chuyển dịch chiết dầu nhẹ sang bình định mức 250 ml và pha loãng đến vạch Nồng độ retinol của dung dịch này (dung dịch 1) là khoảng 150 IU/ml

− Chuẩn hóa dung dịch retinol để hiệu chuẩn:

và loại bỏ dung môi ở nhiệt độ môi trường bằng dòng khí trơ

bước sóng 310 nm, 325 nm và 334 nm Các giá trị độ hấp thụ phải xấp xỉ

từ 0,7 đến 0,8 Có thể sử dụng dung dịch trung gian, nếu cần.

+ A 325, corr = 6,815 x A 325 - 2,555 x A 310 - 4,26 x A 334

+ Nếu A 325,corr /A 325 nhỏ hơn 0,97, thì sử dụng giá trị A 325,corr để chuẩn hóa, nếu không sử dụng A 325

+ nồng độ (IU/ml) = A 325 x 183 IU/ml, hoặc

+ nồng độ (IU/ml) = A 325,corr x 183 IU/ml.

− Chuẩn bị chuẩn retinol cho sắc ký:

độ dự kiến trong dịch chiết mẫu Đối với mỗi 1 000 IU vitamin A trên kilogam mẫu, thì nồng độ retinol dự kiến có trong dịch chiết là 2,5 IU/ml.

bằng dòng khí trơ Hòa tan cặn trong một lượng thích hợp của 2-propanol để có được nồng độ retinol theo yêu cầu và trộn.

2.1.6 Biểu thị kết quả:

Tính hàm lượng vitamin A của mẫu thử, bằng công thức sau:

W A = 20 000 x Trong đó:

w A là hàm lượng vitamin A của mẫu thử, tính bằng đơn vị quốc tế trên kilogam (IU/kg);

c là nồng độ retinol của dịch chiết, tính bằng đơn vị quốc tế trên mililit (IU/ml);

m là khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam (g).

2.1.7 Ưu nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm:

− Độ phân giải cao (nhiều loại pha tĩnh)

− Độ nhạy cao (kết hợp nhiều loại Detector)