Một số đặc điểm hình thái noãn và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm

Nguyễn Thị Phương Dung MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Xá đ nh ảnh hưởng của đặ điểm hình thái thể cực, khoang quanh noãn, màng trong suốt và các yếu tố trong tế bào chất đến kết quả điều tr thụ tinh

Trang 1

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG

KHẢO SÁT MỐI LIÊN HỆ GIỮA MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI NOÃN

VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh lý Động vật

Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TƯỜNG ANH

TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2011

Trang 2

Để thực hiện luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được nhiều quan tâm và ủng hộ nhiệt tình từ nhiều người Nhân đây tôi xin cảm ơn đến:

Ba, Mẹ đã sinh thành và nuôi dưỡng con, luôn là nguồn động viên, là điểm tựa cho con trên mỗi bước đường Anh Hai và em Duy cùng những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm, yêu thương và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong học tập và cuộc sống

Thầy- PGS.TS Nguyễn Tường Anh đã nhiệt tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Các thầy cô trong khoa Sinh học-bộ môn Sau đại học, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô thỉnh giảng khác đã giảng dạy, cung cấp cho tôi những kiến thức mới và phương pháp học tập, nghiên cứu khoa học

Ban lãnh đạo Đơn vị hỗ trợ sinh sản Bệnh viện An Sinh thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn tại Đơn vị

Các anh/chị và các bạn đồng nghiệp công tác tại Đơn vị hỗ trợ sinh sản, bệnh viện An Sinh thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là chị Thu Lan, đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác, học tập và thực hiện luận văn

Các anh/chị và các bạn trong tập thể lớp Sinh lý Động vật khóa 18 đã giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011

Nguyễn Thị Phương Dung

Trang 3

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Dịch nghĩa tiếng Việt

CLG Centrally located granule Hạt thô tập trung ở giữa noãn

GVBD Germinal Vesicle Breakdown Tan biến túi mầm

HCG Human chorionic gonadotropin màng đệm n

ng ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection m n ng ào ào ng

no n

IVF In vitro fertilization n ong ng ng ệm

PVP Polyvinyl Pyrrolidone

SER Smooth Endoplasma Reticulum Thể l ới nội chấ n

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

Trang 4

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn người in vivo 3

1.2 Sự trưởng thành của noãn .4

1.3 Thụ tinh trong ng nghi m in vitro fertilization) 7

1.3.1 .7

1.3.2 Kỹ thuậ .7

1.3.3 ết quả in vitro 9

1.3.4 ết quả phôi in vitro 12

.12

1.3.4.2 Tiêu chuẩ n phân cắt 15

1.4 Đánh giá chất lượng noãn trong thụ tinh ng nghi m 16

1.4.1 Vai trò c ng noãn .16

1.4.2 Các yếu t ng noãn 16

ong -ZP) 17

ả -PVS) 18

1 .20

ắ .21

ế ế .23

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật li u 29

ng nghiên c u 29

2.1.2 D ng c - Thiết b - Hóa ch t 30

2.1.2.1 D ng c .30

Trang 5

ơ ẩn b tinh trùng (theo WHO2010) 35

ơ .35

ơ ) 35

) 35

ê ù ơ ) 40

2.2.6 Ki m tra kết quả th tinh ( ) 40

2.2.7 Ki m tra phôi và chọn phôi chuy n ( ) 41

2.2.8 Chuy n phôi 42

9 ơ x lý s li u 42

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của hình thái màng trong su t ZP) đến kết quả ICSI 43

3.2 Ảnh hưởng của hình thái thể cực thứ nhất đến kết quả ICSI 46

3.3 Ảnh hưởng của hình thái khoang quanh noãn đến kết quả ICSI 49

3.4 Ảnh hưởng của hình thái bào tương noãn đến kết quả ICSI 51

ộ h t (granularity) và màu sắ ơ 51

3.4.2 Th h t nâu (brown particle-BP) 54

3.4.3 Không bào (Vacuole) 56

ới nội ch ơ S oth endoplasma reticulum-SER) 59

3.4.5 Th vùi (inclusion) 62

3.5 Tương quan giữa chất lượng chung của noãn và kết quả ICSI 64

3.6 Tương quan giữa chất lượng chung của noãn và kết quả thai 66

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 69

4.2 ĐỀ NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 77

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 2.1 Danh sách d ng c đựng và x lý tinh trùng 30

Bảng 2.2 Danh sách d ng c tìm và x lý noãn 31

Bảng 2.3 Danh sách d ng c s d ng trong ICSI và thao tác trên phôi 31

Bảng 2.4 Danh sách thiết bị s d ng 32

Bảng 2.5 D n á mô ng s d ng 33

Bảng 2.6 Tiêu chuẩn phân loại chấ l ợng chung của noãn 40

Bảng 2.7 Tiêu chuẩn phân loại chấ l ợng phôi ngày 2 tại IVFAS 41

Bảng 3.1 Đặ đ ểm các chu kỳ đ ều trị TTON trong nghiên cứu 43

Bảng 3.2 Kết quả ICSI giữa các nhóm noãn theo phân loại hình thái ZP 44

Bảng 3.3 Kết quả ICSI của các nhóm noãn theo hình thái thể cực thứ nhất 46

Bảng 3.4 Kết quả ICSI theo các nhóm hình thái khoang quanh noãn 49

Bảng 3.5 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm phân loại noãn eo độ hạt và màu sắ ào ng 52

Bảng 3.6 Kết quả sau ICSI giữ á n óm no n eo đặ đ ểm thể hạt nâu trong ào ng 54

Bảng 3.7 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm noãn dự ào đặ đ ểm không bào 56

Bảng 3.8 Kết quả ICSI giữ á n óm no n eo đặ đ ểm l ới nội chấ n 59

Bảng 3.9 Kết quả sau ICSI giữ á n óm no n eo đặ đ ểm thể vùi 62

Bảng 3.10 Kết quả sau ICSI theo chấ l ợng của noãn 64

Bảng 3.11 Đặ đ ểm chu kỳ đ ều trị theo kết quả thai 67

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình.1.1 Quá trình phân chia giảm phân tạo noãn 4

Hình.1.2 Cá g đoạn ởng thành về nhân của noãn 5

Hình.1.3 Quá trình th tinh tự n n à p á đồ TTON cổ đ ển 8

Hình.1.4 Kỹ thuậ m n ng ào ào ng no n 9

Hình.1.5 Noãn th n ìn ng 9

Hình 1.6 Phân loại hợp t theo tiêu chuẩn của Scott và cộng sự 11

Hình.1.7 Hình thái t ủa hợp t theo mô tả của Tesarik, Greco và Garello 12

Hình.1.8 Cá g đoạn phát triển của phôi in vitro theo th i gian 14

Hình.1.9 Cấu trúc phôi nang 15

Hình.1.10 Đán g á ìn á ể cực thứ nhất 21

Hình 1.11 Vị trí khác nhau của thoi vô sắc trong noãn 22

Hình.1.12 Noãn có thể hạt phân tán và tập ng ong ào ng 23

Hình.1.13 Noãn có hạt nâu trong tế bào chất với mứ độ khác nhau 25

Hình.1.14 Sự hiện diện của thể vùi ở noãn 25

Hình.1.15 Sự hiện diện của không bàoởnoãn 26

Hình.1.16 Sự hiện diện của SER ở noãn 27

Hình 2.1 S đồ quy trình th tinh ng nghiệm tại IVFAS 34

Hình 2.2 Tiêu chuẩn phân loại hình thái ZP của noãn (200X) 36

Hình 2.3 Tiêu chuẩn phân loại hình thái khoang quanh noãn (200X) 36

Hình 2.4 Tiêu chuẩn phân loại hình thái thể cực thứ nhất (200X) 37

Hình 2.5 Tiêu chuẩn phân loại hình thái thể hạt nâu ong ào ng no n (200X) 37

Trang 8

Hình 2.6 Tiêu chuẩn phân loạ ìn á độ mịn ào ng no n (200X) 38

Hình 2.7 Tiêu chuẩn phân loại sự xuất hiện thể vùi ở noãn (200X) 38

Hình 2.8 Tiêu chuẩn phân loại sự xuất hiện thể nội chấ n ở noãn (200X) 39

Hình 2.9 Tiêu chuẩn phân loại sự xuất hiện không bào ở noãn (200X) 39

Hình 2.10 Chấ l ợng phôi ngày 2 42

Hình 3.1 Tỷ lệ phân loại hình thái ZP ở noãn trong nghiên cứu 44

Hình 3.2 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm noãn theo hình thái ZP 45

Hình 3.3 Tỷ lệ hình thái thể cực thứ nhất ở noãn trong nghiên cứu 47

Hình 3.4 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm noãn theo hình thái thể cực thứ nhất 47

Hình 3.5 Phân b tỷ lệ hình thái PVS ở noãn trong nghiên cứu 50

Hình 3.6 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm hình thái PVS của noãn 50

Hình 3.7 Phân b tỷ lệ phân loại noãn về ìn á độ hạt và màu sắ ào ng 52 Hình 3.8 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm noãn dựa theo hình thái hạt và màu sắ ào ng no n 53

Hình 3.9 Phân b tỷ lệ hình thái thể hạt nâu ở noãn trong nghiên cứu 55

Hình 3.10 Kết quả sau ICSI giữ á n óm no n eo đặ đ ểm thể hạt nâu ong ào ng 55

Hình 3.11 Phân b tỷ lệ hình thái không bào ở noãn trong nghiên cứu 57

Hình 3.12 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm noãn dự ào đặ đ ểm không bào 57

Hình 3.13 Phân b tỷ lệ hình thái SER ở noãn trong nghiên cứu 60

Hình 3.14 Kết quả sau ICSI giữa các nhóm noãn dựa vào hình thái SER 60

Hình 3.15 Phân b tỷ lệ noãn xuất hiện thể vùi 62

Hình 3.16 Kết quả sau ICSI giữ á n óm no n eo đặ đ ểm thể vùi 63

Hình 3.17 Phân b tỷ lệ chất l ợng noãn trong nghiên cứu 65

Hình 3.18 Kết quả sau ICSI theo chấ l ợng noãn 65

Trang 9

MỞ ĐẦU

Trang 10

MỞ ĐẦU

Thụ tinh trong ống nghiệm trên người đã phát triển mạnh mẽ và rộng rãi trong hơn hai thập kỷ qua Cùng với tiến trình phát triển, có nhiều phác đồ kích thích buồng trứng hiệu quả hơn, cải thiện tỷ lệ thụ tinh cũng như kỹ thuật nuôi cấy phôi Nhờ đó, bệnh nhân có được nhiều phôi chất lượng tốt hơn Tuy nhiên, tỷ lệ làm tổ của từng phôi đơn lẻ vẫn còn thấp nên bệnh nhân thường được chuyển nhiều hơn một phôi trong các chu kỳ thụ tinh ống nghiệm Nhằm nâng cao tỷ lệ thai và hạn chế đa thai thì cần giảm số lượng phôi chuyển mà vẫn đảm bảo phôi chuyển có khả năng làm tổ Do đó, việc chọn phôi tiềm năng để chuyển trở thành một trong những thách thức góp phần quan trọng vào kết quả của chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm

Cho đến gần đây, tại hầu hết các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm thì việc chọn phôi chuyển vẫn dựa trên yếu tố hình thái phôi vào ngày chuyển phôi Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu đã mở rộng phạm vi đánh giá nhằm chọn phôi có chất lượng tốt hơn Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm mối tương quan giữa chất lượng phôi và hình thái hợp tử cũng như noãn, kết quả là vẫn còn nhiều tranh cãi Riêng tại Việt Nam, nghiên cứu về hình thái noãn, hợp tử và mối liên hệ của chúng với chất lượng phôi trong các chu kỳ hỗ trợ sinh sản vẫn còn hạn chế Trên cơ sở

đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “KHẢO SÁT MỐI LIÊN HỆ GIỮA

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI NOÃN VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM”

Trang 11

 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Xá đ nh ảnh hưởng của đặ điểm hình thái thể cực, khoang quanh noãn, màng trong suốt và các yếu tố trong tế bào chất đến kết quả điều tr thụ tinh trong

ống nghiệm

 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát tá động của các yếu tố hình thái noãn đến:

 Tỷ lệ thụ tinh

 Tỷ lệ tạo hợp tử tốt

 Tỷ lệ phân chia tạo phôi

 Tỷ lệ tạo phôi tốt

 Kết quả thai sau chuyển phôi tươi

Chúng tôi hy vọng kết quả của nghiên cứu này sẽ cung cấp dữ liệu cho việc chọn phôi chuyển trong các chu kỳ thụ tinh ống nghiệm hiệu quả hơn

Trang 12

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 13

1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn người in vivo

Sự phát triển của noãn bao gồm sự hình thành, lớn lên và trưởng thành của noãn Quá trình này bắt đầu từ khoảng tuần thứ tư của thai và chấm dứt vào tuổi mãn kinh của phụ nữ, có 4 giai đoạn:

 Nguồn gốc ngoài cơ quan sinh dục của tế bào mầm nguyên thủy và sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục

 Sự gia tăng số lượng các tế bào mầm bằng nguyên phân

 Sự giảm vật chất di truyền bằng giảm phân

 Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của noãn

Ở người, các tế bào mầm nguyên thủy được định hình vào tuần thứ 4 của bào thai trong túi noãn hoàng Từ tuần thứ 4 đến 6, các tế bào mầm nguyên thủy di chuyển vào gờ sinh dục, nơi hình thành cơ quan sinh dục sau này Trên đường di chuyển, các tế bào mầm tiếp tục phân chia nguyên nhiễm để gia tăng nhanh về số lượng Các tế bào mầm đang phân chia nguyên nhiễm tại cơ quan sinh dục được gọi là noãn nguyên bào (oogonium) Các noãn nguyên bào chứa 2n nhiễm sắc thể Quá trình phân chia nguyên nhiễm của noãn nguyên bào kéo dài từ tháng thứ 2 đến tháng thứ 5 của phôi thai Trong thời gian này, số lượng tế bào mầm tăng lên đến 7 triệu, sau đó số lượng này giảm một cách nhanh chóng đến còn 2 triệu lúc sinh do quá trình thoái hóa của các noãn nguyên bào và sự chấm dứt phân chia gián phân của các tế bào mầm [2]

Vào tháng thứ 3 đến tháng thứ 5 của phôi thai, quá trình phân bào giảm nhiễm đã bắt đầu để tạo ra các noãn có n nhiễm sắc thể (NST) để khi kết hợp với tinh trùng sẽ hình thành hợp tử chứa 2n nhiễm sắc thể Quá trình giảm phân tế bào mầm diễn ra không liên tục, bao gồm hai pha: giảm phân I và giảm phân II Có 2 giai đoạn tạm dừng (block) xảy ra trong quá trình giảm phân của tế bào mầm: lần thứ nhất khi tế bào mầm bước vào kỳ trước (prophase) của giảm phân I, tế bào mầm lúc này được gọi là noãn sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (germinal vesicle-GV)

Trang 14

Đến khi sinh, buồng trứng của bé gái chỉ chứa các noãn phát triển ở giai đoạn GV Các noãn chỉ vượt qua được giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH (Luteinizing Hormone), bắt đầu vào tuổi dậy thì Tuy nhiên, chỉ vài giờ sau đỉnh

LH, noãn bước vào lần tạm dừng thứ hai khi ở kỳ giữa (metaphase) của giảm phân

II (MII) Noãn trưởng thành và phóng noãn ở giai đoạn MII Noãn chỉ vượt qua được giai đoạn MII khi có sự xâm nhập của tinh trùng và tiếp tục phát triển thành hợp tử [2]

Hình.1.1 Quá trình phân chia giảm phân tạo noãn

Nguồn: Sardul S Guraya, 2008

1.2 Sự trưởng thành của noãn

Khi có sự xuất hiện của đỉnh LH, noãn ở giai đoạn túi mầm hiện diện trong nang trước phóng noãn sẽ trải qua quá trình trưởng thành về nhân và tế bào chất

Trang 15

Trưởng thành về nhân

Trưởng thành về nhân là những thay đổi về nhân, xảy ra trong suốt quá trình giảm phân tái diễn (resumption of meiosis) của noãn để tạo nên giao tử chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội Noãn bị tạm dừng phát triển ở kỳ trước I (prophase I), có sự hiện diện của túi mầm (Germinal Vesicle – GV), sẽ bắt đầu chuyển sang giai đoạn tiêu biến túi mầm (Germinal Vesicle Break Down- GVBD) sau đỉnh LH Trong giai đoạn GVBD, màng nhân biến mất, sợi nhiễm sắc thể nén chặt, các cặp nhiễm sắc thể tương đồng sắp xếp trên mặt phẳng thoi vô sắc ở kỳ giữa của giảm phân I (metaphase I - MI) Trong suốt kỳ sau (anaphase) và kỳ cuối (telophase) của giảm phân I, các cặp nhiễm sắc thể tương đồng phân chia đồng đều và noãn dừng lại ở kỳ giữa II (metaphase II - MII), có sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (first polar body-PB1) Quá trình giảm phân của noãn hoàn tất khi xảy ra hiện tượng thụ tinh, có sự xuất hiện của thể cực thứ hai (second polar body-PB2) Ở người,noãn GV qua giai đoạn GVBD khoảng 15 giờ sau đỉnh LH, MI khoảng 20 giờ sau đỉnh LH và MII khoảng 35 giờ sau đỉnh LH Do đó, ở người sự phóng noãn xảy ra trong vòng 34-38 giờ sau đỉnh LH [2]

Hình.1.2 Các giai đoạn trưởng thành về nhân của noãn

A Noãn chưa trưởng thành, ở giai đoạn túi mầm (noãn GV)

B Noãn ở giai đoạn túi mầm tan biến (noãn GVBD)

C Noãn ở kỳ giữa II (noãn MII)

g: germinal vesicle (túi mầm); p: perivitelline space (khoảng không quanh noãn); z: zona pellucida (màng trong suốt); f: first polar body (thể cực thứ nhất)

(Nguồn Veeck LL An atlas human gametes and conceptuces

New York: Partheno Publishing, 1999.)

Trang 16

Sự trưởng thành về tế bào chất

Quá trình trưởng thành về tế bào chất diễn ra ngay sau đỉnh LH, đồng thời với

sự trưởng thành về nhân Tuy nhiên, sự biểu hiện về mặt hình thái trong quá trình trưởng thành về tế bào chất không rõ nét như quá trình trưởng thành về nhân Trong quá trình này, tế bào chất có nhiều biến đổi cần thiết để chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và phát triển phôi về sau

Về siêu cấu trúc, trong tế bào chất diễn ra sự sắp xếp các bào quan cùng với sự

di chuyển của hệ thống lưới nội chất, ty thể, thể hạt vỏ hướng ra vùng vỏ noãn Bộ máy Golgi biến mất nên khả năng tổng hợp protein mới ở noãn trưởng thành giảm đáng kể Đồng thời, sợi nhiễm sắc thể cũng di chuyển về vùng thể hạt vỏ, noãn trở nên bất đối xứng Bộ khung tế bào (cytoskeleton) bị biến đổi, vỏ actin của sợi thoi

vô sắc của noãn ở giai đoạn MII dày hơn Vi sợi trên màng tế bào chất cũng tiêu giảm, hạn chế khả năng tinh trùng đi vào vùng thoi vô sắc để cản trở quá trình giảm phân bình thường [26]

Về mặt phân tử, quá trình trưởng thành về tế bào chất còn là sự tích lũy ARN thông tin, cần thiết để dịch mã, tổng hợp protein Ví dụ như tích lũy các ARN thông tin mã hóa protein đóng vai trò là yếu tố nội mô (tissue plasminogen factor), Mos và thụ thể inositol triphosphate loại I (IP3R-I) Mos hoạt hóa các protein trong chu trình tế bào, cần thiết trong quá trình trưởng thành về nhân Nghiên cứu gần đây chứng minh rằng ở noãn chuột trưởng thành tăng protein IP3R-I, có vai trò quan trọng trong hoạt hóa noãn, biểu hiện các kênh Ca2+ [26].

Cơ chế phân tử của việc tích lũy các ARN thông tin là sự gắn kết phân tử adenyl trong tế bào chất vào vùng trình tự không mã hóa ở đầu 3’ của ARN thông tin Quá trình này giúp ARN thông tin liên kết với chuỗi ribosome để dịch mã và tăng mức biến đổi sau dịch mã của các protein ở tế bào chất diễn ra trong suốt quá trình trưởng thành của noãn Chẳng hạn như các vi ống trải qua nhiều thay đổi về acetyl hóa trong quá trình noãn chuyển từ trạng thái MI sang MII Ngoài ra, sự phosphoryl hóa và dephosphoryl hóa các protein trong tế bào chất giữ vai trò điều

Trang 17

hòa chu trình tế bào cũng rất cần thiết để hoàn tất quá trình trưởng thành về tế bào chất [26]

1.3 Thụ t n tr ng ng ng in vitro fertilization)

Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình cho noãn và tinh trùng kết hợp với nhau ngoài cơ thể để tạo thành hợp tử và phát triển thành phôi Phôi được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm từ 2 đến 5 ngày rồi chuyển vào tử cung của người phụ

nữ Tỷ lệ thành công trung bình của kỹ thuật này thay đổi từ 30-40% [3]

vô sinh Cho đến nay, đã có trên 3 triệu trẻ em ra đời từ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trên toàn thế giới Theo ước tính, 1% số trẻ em ra đời ở châu Âu nhờ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm [13]

Riêng tại Việt Nam, thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện đầu tiên vào năm 1997 tại bệnh viện Từ Dũ Sau đó, 3 em bé đầu tiên đã chào đời vào năm 1998 Cho đến nay, đã có gần 10 nghìn em bé được ra đời từ thụ tinh trong ống nghiệm tại Việt Nam [3]

1.3.2 Kỹ thuật t ụ t n tr ng ng ng

Có hai kỹ thuật cơ bản trong thụ tinh trong ống nghiệm hiện nay là IVF cổ điển và ICSI IVF cổ điển là kỹ thuật được giáo sư Robert Edwards và cộng sự thực hiện thành công đầu tiên khi thụ tinh ống nghiệm, em bé ra đời vào năm 1978

Trang 18

Trong kỹ thuật này, tinh trùng tốt được chọn lọc để tiếp xúc với noãn trong môi trường nuôi cấy, quá trình thụ tinh diễn ra tương tự như trong cơ thể

Hình.1.3 Quá trình thụ tinh tự nhiên trong cơ thể (A) và thụ tinh trong ống

nghiệm cổ điển (B)

Kỹ thuật ICSI thành công đầu tiên trên người vào năm 1992 đã tạo nên tiến

bộ vượt bậc của lĩnh vực thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) Với sự hỗ trợ của hệ thống vi thao tác, một tinh trùng được chọn, được tiêm vào bào tương noãn Kỹ thuật này vượt qua trở ngại về khả năng tinh trùng xâm nhập và thụ tinh với noãn,

Trang 19

chỉ cần một tinh trùng sống có bộ nhân nguyên vẹn được tiêm vào noãn là đã có khả năng thụ tinh Chính vì vậy, ICSI có thể được sử dụng cho hầu hết các trường hợp điều trị vô sinh do vợ, do chồng hoặc chưa rõ nguyên nhân Nhờ tính ưu việt này mà ngày nay ICSI được áp dụng trong hầu hết các trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm

Hình 1.4 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

Nguồn: ART Cosulting

1.3.3 n g kết quả t ụ t n in vitro

Việc đánh giá kết quả thụ tinh thường được tiến hành vào thời điểm 16 đến 18 giờ sau IVF hoặc ICSI Kết quả thụ tinh cung cấp thông tin về tình trạng thụ tinh của noãn cũng như chất lượng của hợp tử hình thành, cơ sở cho việc chọn phôi tốt

để chuyển vào tử cung Noãn được thụ tinh bình thường có 2 nhân nguyên và 2 thể cực vào thời điểm kiểm tra Vì vậy, việc đánh giá kết quả thụ tinh thường căn cứ vào các yếu tố về nhân nguyên và thể cực [10]

Hình.1.5 Noãn thụ tinh bình thường sau ICSI

Nguồn: http://www.cpma.ch/en/treatments/ivf-icsi/zygote-identification.html

Trang 20

Vào năm 1990, Van Blerkom là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa

sự cân xứng về vị trí, kích thước các nhân nguyên cũng như số lượng và vị trí phân

bố của các tiểu hạch (nucleoli) với tỷ lệ mang thai Sau đó, trong hai nghiên cứu độc lập của các tác giả Terasik và Greco (1999); Scott và cộng sự (2000) đã tập trung phân tích sự phân bố của tiểu hạch trong nhân nguyên ở các hợp tử tao nên phôi được chuyển trong các chu kỳ có thai và không có thai Kết quả cho thấy ở 100% các phôi làm tổ đều có đặc điểm là số lượng tiểu hạch ở hai nhân nguyên không khác biệt quá 3 và tiểu hạch phân bố cân xứng ở hai nhân nguyên Đồng thời, chu

kỳ có chuyển ít nhất một phôi có đặc điểm như trên thì tỷ lệ thai đạt 50% (22/44) so với kết quả 9% (2/23) ở các chu kỳ chuyển phôi hoàn toàn không có đặc điểm tốt như đã đề cập [10] Từ đó, có nhiều nỗ lực trong chuẩn hoá các chỉ tiêu đánh giá phôi giai đoạn nhân nguyên Trong đó, tiêu chuẩn do Scott và cộng sự (2000) đề xuất được áp dụng rộng rãi nhất Đã có nhiều báo cáo chứng tỏ tính hữu ích của tiêu chuẩn này trong việc chọn phôi có chất lượng tốt, tỷ lệ làm tổ cao sau chuyển phôi (Magdalana và cs., 2007) [21] Nhìn chung, các tiêu chuẩn đánh giá nhân nguyên dựa trên các thông số sau:

 Kích thước và sự cân xứng của nhân nguyên

 Số lượng, kích thước, sự cân xứng và vị trí của của các tiểu hạch trong nhân nguyên

Scott và cộng sự đã phân loại hợp tử thành 4 nhóm dựa trên hình thái nhân nguyên tương ứng với chất lượng của chúng như sau:

 Z1 – Kích thước hai nhân nguyên bằng nhau Số lượng, kích thước các tiểu hạch bằng nhau ở hai nhân nguyên Các tiểu hạch xếp thẳng hàng tại vị trí tiếp giáp giữa hai nhân nguyên Số lượng các tiểu hạch trong mỗi nhân nguyên dao động trong khoảng từ 3 đến 7

 Z2 - Kích thước hai nhân nguyên bằng nhau Số lượng, kích thước các tiểu hạch bằng nhau ở hai nhân nguyên Các tiểu hạch phân bố rải rác ở cả hai

Trang 21

nhân nguyên Số lượng các tiểu hạch ở mỗi nhân nguyên dao động trong khoảng từ 3 đến 7

 Z3 - Kích thước hai nhân nguyên bằng nhau Số lượng và kích thước các tiểu hạch bằng nhau nhưng các tiểu hạch ở một trong hai nhân nguyên sắp xếp tại vùng tiếp giáp hai nhân nguyên còn ở nhân nguyên còn lại thì tiểu hạch phân

bố rải rác Hoặc các tiểu hạch trong hai nhân nguyên không cân bằng nhau

về số lượng và kích thước Số lượng các tiểu hạch ở mỗi nhân nguyên dao động trong khoảng từ 3 đến 7

 Z4 – Kích thước các nhân nguyên không bằng nhau hoặc các nhân nguyên phân tán, không tiếp xúc với nhau

Hình 1.6 Phân loại hợp tử theo tiêu chuẩn của Scott và cộng sự, 2000

(A: Z1; B: Z2; C: Z3; D: Z4)

Nguồn: M Depa-Martynów và cộng sự (2007)

Bên cạnh đó, số lượng, vị trí và hình thái của thể cực cũng là vấn đề đáng quan tâm vào thời điểm đánh giá kết quả thụ tinh Hợp tử bình thường có hai thể cực tròn, đều và không phân mảnh Bởi vì noãn bị phân cực, vị trí đúng của thể cực thứ hai nằm trên trục của hai nhân nguyên Đồng thời, sự tái phân bố các bào quan ảnh hưởng đến sự phân chia của hợp tử về sau Các thể hạt và vòng sáng quanh nhân nguyên là dấu hiệu của sự phân cực trong hợp tử Bất thường về vị trí các nhân nguyên và thể cực gây ảnh hưởng đến sự phân chia của phôi, thường tạo phôi bào không đều hoặc quá trình phân chia phôi bào chậm [10]

Trang 22

1.3.4 n g kết quả phôi in vitro

Việc đánh giá phôi nhằm lựa chọn phôi tốt, có tiềm năng phát triển và làm tổ cao Đây là mục tiêu quan trọng trong các chu kỳ điều trị bằng thụ tinh trong ống nghiệm Đặc biệt, việc giảm số lượng phôi chuyển, thậm chí một phôi, trong một chu kỳ nhằm giảm đa thai đang trở thành xu hướng thì việc chọn phôi tốt càng có ý nghĩa hơn Nhằm chọn được phôi tốt để chuyển, các chuyên viên phôi học cần dựa trên các tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi qua các giai đoạn phát triển của phôi trước làm tổ

1.3.4.1 g n t tr ển ủ

Sau khi thụ tinh, hợp tử bắt đầu quá trình phân chia để tạo các tế bào nhỏ gọi

là phôi bào Sự phát triển phôi in vitro diễn ra qua các giai đoạn tương tự in vivo Tuy nhiên, sự phân chia của phôi in vitro chậm hơn in vivo Quá trình phát triển của

phôi giai đoạn trước làm tổ diễn ra tuần tự, qua giai đoạn phôi phân cắt (cleaving embryo) và phôi nang (blastocyst embryo)

G n phôi phân cắt

Sự phân cắt của phôi thực chất là quá trình nguyên phân liên tiếp của hợp tử

để tạo nhiều phôi bào (blastomere) Trong quá trình phân chia, kích thước phôi bào

(i) Số hạch nhân trong cả hai nhân nguyên không không khác biệt quá 3

(ii) Các hạch nhân luôn phân cực hoặc không phân cực ở cả hai nhân nguyên nhưng không bao giờ phân cực ở một nhân nguyên này và không ở nhân nguyên còn lại

(iii) Góc ß tạo giữa trục hai nhân nguyên và thể cực thứ hai phải nhỏ hơn 50°

Hình.1.7 Hình thái tối ưu của hợp tử có khả năng sống cao theo mô tả của

Tesarik và Greco (1999), Garello và cs (1999), Scott và Smith (1998)

Trang 23

giảm nhưng kích thước của phôi không đổi Khối phôi bào mới tạo thành có kích thước bằng với hợp tử ban đầu và được màng trong suốt bao bọc Trong giai đoạn này, chu trình tế bào chỉ có pha S và M mà hầu như không có pha G1 và G2

Sau khi noãn được thụ tinh khoảng 16 giờ sẽ xuất hiện 2 nhân nguyên, ở một

số bệnh nhân có thể xuất hiện sớm 12- 14 giờ hoặc muộn hơn 20- 22 giờ Mỗi nhân nguyên chứa bộ NST đơn bội, 1 của bố và 1 của mẹ Sau đó, hai nhân nguyên hòa hợp, hợp tử bắt đầu tiến trình phân cắt đầu tiên tạo phôi 2 tế bào Trong lần phân cắt đầu tiên, hợp tử sử dụng trung thể của tinh trùng nhân đôi và tạo thoi vô sắc, nhiễm sắc thể kép tách nhau ở tâm động và phân ly về hai cực, hợp tử phân cắt hình thành hai nguyên bào phôi có kích thước tương đương nhau

Các lần phân cắt tiếp theo thường không đồng thời và không cân đối Do đó, trong thực tế ta có thể thấy phôi có số phôi bào lẻ và các phôi bào có thể có kích thước không đồng đều nhau Ở giai đoạn này, ta có thể đã nhìn thấy các biểu hiện của phôi kém chất lượng như phân mảnh tế bào chất (fragmentation), phôi bào đa nhân (multinucleation) Thời gian trung bình cho một lần phân chia của phôi bào là

24 giờ, tương ứng với khoảng cách giữa các lần đánh giá phôi trong quá trình nuôi

cấy in vitro Tiến trình phát triển phôi in vitro qua các giai đoạn theo thời gian (time

line) thể hiện ở Hình 1.8

Khi phôi đạt đến 32 tế bào, phôi giống như quả dâu nên được gọi là phôi dâu (morula) Phôi dâu có kích thước bằng hợp tử ban đầu Các phôi bào bắt đầu phân tách trong giai đoạn phôi dâu tạo thành các nguyên bào phôi (embryoblast) và các nguyên bào nuôi (trophoblast) Các phôi bào có hướng phát triển khác nhau sẽ được phân tách dần trong suốt quá trình phân cắt của phôi dâu Trong quá trình này có sự tái sắp xếp của các tế bào lớp ngoài và lớp trong, kết quả dẫn đến sự hình thành khối tế bào ở trung tâm của phôi, sau này sẽ trở thành mầm phôi, và lớp tế bào ở phía ngoài là nguồn gốc của lá nuôi phôi nên được gọi là nguyên bào nuôi

Trang 24

Giai n phôi nang (blastocyst)

Phôi nang hình thành vào khoảng ngày thứ 5- 6 sau thụ tinh Lúc này phôi có khoảng 60 tế bào Đầu tiên, ở giữa khối tế bào phôi dâu xuất hiện khoang chứa dịch Dịch do bơm Na+/K+- ATP hoạt động, bơm Na+ từ trong khối nguyên bào phôi ra khoảng gian bào, làm tăng áp lực thủy tĩnh ở khoảng gian bào, kéo nước ra gian bào, hình thành khối dịch giữa khối tế bào lớp trong Khoang chứa dịch tăng nhanh

về thể tích hình thành một khoang rộng trong phôi gọi là khoang phôi nang (blastocyst cavity) Cuối giai đoạn này, khoang phôi nang chiếm gần hết thể tích phôi Phôi lúc này được gọi là phôi nang (blastocyst) [10]

Hình.1.8 Các giai đoạn phát triển của phôi in vitro theo thời gian

Theo Veeck và Zaninovic, 2003

Trang 25

Hình.1.9 Cấu trúc phôi nang

Khối tế bào lớp ngoài biến đổi cấu trúc thành lớp biểu mô đơn bao bọc bên ngoài, phân biệt và tách ra khỏi đám tế bào lớp trong Đây là nguồn gốc của lá nuôi phôi Khối tế bào lớp trong tập trung thành một khối đặc, phân bố lệch về một phía của khoang phôi tạo mầm phôi (inner cell mass) Mỗi tế bào lớp trong được gọi là nguyên bào phôi (embryoblast), sau này biệt hoá thành các mô, cơ quan cấu trúc cơ thể Sự tăng dần thể tích của khoang phôi nang làm màng ZP mỏng lại Tới ngày thứ 7, 8 phôi nang thoát màng sẵn sàng làm tổ trong nội mạc tử cung Những phôi không thể thoát màng sẽ thoái hóa

1.3.4.2 Tiêu chuẩn n g ất ư ng ở g n phân cắt

Hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản thường tiến hành chuyển phôi vào giai đoạn phôi phân cắt (ngày 2 hoặc ngày 3) để hạn chế nguy cơ ngưng phát triển của phôi do nuôi cấy dài ngày Hiện tại, có nhiều hệ thống đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phân cắt Tuy nhiên, nguyên tắc chung để đánh giá chất lượng phôi phân cắt là dựa trên tốc độ phân chia của phôi, độ đồng đều của các phôi bào và độ phân mảnh

tế bào chất Phôi tốt là phôi có tốc độ phân chia phù hợp, phôi bào đồng đều, có ít hoặc không phân mảnh Cụ thể, các phôi tốt có 4 đến 6 phôi bào vào ngày 2 và ít nhất 7 phôi bào vào ngày 3 sau thụ tinh, các phôi bào đều, đơn nhân, độ phân mảnh không quá 10% thể tích phôi Do đó, phôi thường được đánh giá vào thời điểm 42-

44 giờ (ngày 2) hoặc 66-68 giờ (ngày 3) sau ICSI Phôi được phân loại thành các nhóm dựa trên các thông số về hình thái (số phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào, độ phân mảnh của tế bào chất) vào thời điểm đánh giá [32]

Trang 26

1.4 n g ất ư ng noãn khi t ụ t n trong ng ng

1.4.1 Vai trò của vi c n g ất ư ng noãn

Noãn không những cung cấp một nửa thông tin di truyền mà còn là nguồn dự trữ năng lượng, các yếu tố cần thiết cho quá trình thụ tinh và giai đoạn phát triển đầu của phôi Hoạt động của bộ máy di truyền của phôi người bắt đầu vào khoảng giai đoạn phôi có 4 đến 8 tế bào Do đó, chất lượng noãn đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sức sống của phôi Việc đánh giá chất lượng noãn trước khi tiến hành IVF hoặc ICSI có vai trò quan trọng trong quá trình điều trị [10] Cụ thể, các vai trò của việc đánh giá noãn thể hiện như sau:

 Cung cấp thông tin quan trọng về khả năng phát triển của phôi xuất phát

từ noãn đó

 Giảm số lượng noãn được dùng để thụ tinh nhân tạo, hạn chế số phôi dư (đặc biệt có ý nghĩa ở các quốc gia cấm việc trữ hoặc loại bỏ phôi dư sau điều trị)

 Tránh việc thụ tinh với noãn có chất lượng kém, có nguy cơ bất thường

cổ điển, chất lượng noãn được khảo sát dựa trên cấu trúc phức hợp noãn-tế bào hạt quanh noãn Chất lượng và độ giãn nở của khối tế bào hạt quanh noãn có thể là dấu hiệu cho thấy trạng thái trưởng thành của noãn Tuy nhiên, dấu hiệu này không chắc chắn và phụ thuộc vào phác đồ kích thích buồng trứng Trong kỹ thuật ICSI,

Trang 27

thao tác tách lớp tế bào hạt bao quanh noãn giúp việc đánh giá các yếu tố hình thái noãn dễ dàng hơn Nhìn chung, hình thái noãn được quan tâm về các yếu tố ngoài

tế bào chất (extracytoplasmic) như màng trong suốt, khoảng không quanh noãn và các yếu tố bên trong tế bào chất (intracytoplasmic) như thể cực thứ nhất, thoi vô sắc, tế bào chất [10]

1.4.2.1 ng tr ng t (zona pellucida-ZP)

Màng trong suốt (zona pellucida - ZP) là cấu trúc đặc biệt thuộc lớp nền ngoại bào bao quanh noãn.Sự phát triển của nang noãn và noãn diễn ra bình thường nhờ sự hiện diện và tính nguyên vẹn của ZP Trong quá trình phát triển noãn, hoạt động của bộ máy Golgi và lưới nội chất tiết ra các glycoprotein tạo thành màng trong suốt bao quanh noãn, bao gồm ZP1, ZP2 và ZP3 ZP bắt đầu xuất hiện khi có một lớp tế bào hạt bao quanh noãn, trở thành cầu nối giữa tế bào hạt và noãn ZP chứa các thụ thể chuyên biệt theo loài đối với tinh trùng và thúc đẩy phản ứng thể đỉnh (acrosome) của tinh trùng trước thụ tinh Khi noãn được thụ tinh, cấu trúc ZP thay đổi, làm ZP trở nên cứng hơn, ngăn chặn sự xâm nhập của các tinh trùng khác vào noãn, hạn chế hiện tượng thụ đa tinh Ngoài ra, ZP cũng bảo vệ phôi trong suốt quá trình phát triển Vai trò của ZP kết thúc khi phôi thoát màng và làm tổ trong nội mạc tử cung [25]

Kỹ thuật ICSI ra đời cho phép điều trị không những ở trường hợp vô sinh nam mà cả trường hợp thất bại thụ tinh có nguyên nhân từ bất thường cấu trúc ZP Việc loại bỏ lớp tế bào hạt bao quanh noãn trước khi tiến hành ICSI cho phép quan sát hình ảnh của ZP rõ nét sau khi thu nhận noãn và trước khi noãn thụ tinh Tính chất ZP rất đa dạng về hình dạng, màu sắc, độ dày, thành phần cấu trúc Việc đánh giá ZP thường dựa trên độ dày và màu sắc của màng Độ dày của ZP thay đổi từ 10

đến 31 μm, không tương quan với đường kính của tế bào chất Độ dày của ZP ảnh hưởng đến sự xâm nhập của tinh trùng vào noãn Noãn thụ tinh in vitro tốt nhất khi

ZP có độ dày ít hơn 18,6 μm Khi noãn có ZP dày (>22 μm ) thì nên sử dụng kỹ

thuật ICSI [8]

Trang 28

Các nghiên cứu gần đây có sử dụng hệ thống kính phân cực để phát hiện thành phần cấu trúc của ZP, cho thấy nó có liên quan đến kết quả phôi, thai lâm sàng Hệ thống kính PolScope cho phép khảo sát màu sắc, độ dày 3 lớp trong ZP Việc đánh giá ZP vào ngày chọc hút cho thấy có mối tương quan dương giữa độ dày lớp trong ZP và tỷ lệ phôi tốt cũng như nâng cao tỷ lệ đậu thai Ngoài ra, tính chất của ZP cũng thay đổi theo giai đoạn trưởng thành của noãn Việc quan sát siêu cấu trúc của ZP dưới kính hiển vi điện tử cho thấy ở noãn trưởng thành thì ZP có cấu trúc dạng lưới, nhiều khe Trong khi đó, ở noãn chưa trưởng thành thì các sợi glycoprotein trong ZP bện chặt vào nhau Thực tế, trong suốt quá trình sinh noãn, cấu trúc ZP có sự sắp theo trình tự thời gian lẫn không gian Điều này cho phép chúng giữ một vai trò nhất định trong suốt quá trình phát triển của noãn và phôi Chính vì vậy, ZP trở thành một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng noãn [33]

Hơn thế nữa, ZP còn giữ vai trò then chốt trong quá trình phát triển phôi ở giai đoạn trước làm tổ Bất thường về hình dạng noãn do ZP gây ra ảnh hưởng đến cách phân bào, bất lợi trong liên kết giữa các phôi bào, cuối cùng dẫn đến sự giảm khả năng phát triển của phôi Tầm quan trọng của ZP được duy trì cho đến giai đoạn phôi nang, thời điểm phôi cần thoát màng và làm tổ trong nội mạc tử cung Như đã

đề cập ở trên, sự biểu hiện của ZP dày có thể phản ánh tiềm năng phát triển phôi đến giai đoạn phôi nang và làm tổ thành công Mặc dù vẫn còn những tranh cãi nhưng rõ ràng có mối liên hệ giữa việc phôi làm tổ thất bại và khả năng phôi không thoát màng bình thường Đối với thụ tinh trong ống nghiệm, kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng là nhằm tạo điều kiện để phôi thoát màng dễ dàng hơn Các nghiên cứu ngẫu nhiên có đối chứng không ủng hộ quan điểm hỗ trợ thoát màng ở tất cả các bệnh nhân Tuy nhiên, trong một số trường hợp đặc biệt thì việc hỗ trợ thoát màng vẫn là giải pháp tốt [33]

ảng k ng n n n r t n -PVS)

Khoảng không quanh noãn (PVS) là không gian giới hạn giữa màng nguyên sinh chất của noãn và ZP PVS thể hiện rõ ở noãn trưởng thành, khi thể cực thứ nhất

Trang 29

được phóng thích Kích thước của khoảng không quanh noãn có liên quan với độ trưởng thành của noãn Ở noãn GV, khoảng không quanh noãn hẹp và bắt đầu tăng khi noãn bước vào quá trình phục hồi giảm phân Khoảng không quanh noãn của noãn có kích thước khác nhau (rộng hoặc hẹp) và có thể có hoặc không sự hiện diện các hạt Vài tác giả nghiên cứu thấy khoảng 33-47% noãn có PVS rộng [31] Ngoài

ra, đặc điểm hình thái hay quan sát thấy là xuất hiện nhiều hạt ở khoảng không quanh noãn Đôi khi, khó phân biệt giữa phân mảnh của thể cực và hạt trong khoảng không quanh noãn Nguồn gốc của hạt này vẫn chưa rõ ràng Tuy nhiên, có hai giả thuyết về nguồn gốc của các hạt trong PVS Thứ nhất, chúng xuất phát từ các siêu cấu trúc, vi sợi hiện diện ở nền ngoại bào giữa noãn và màng ZP (Dandekar và cs., 1992) Giả thuyết thứ hai cho rằng các tế bào vành tia (corona) đã xuyên qua màng

ZP trong giai đoạn đầu của quá trình trưởng thành noãn (Sathanathan, 1997) Hanssan và cộng sự (1998) đã nghiên cứu tần suất xuất hiện của thể hạt trong PVS

và độ trưởng thành của noãn Cụ thể là noãn ở giai đoạn GV không thấy có hạt ở PVS, nhưng chúng xuất hiện ở noãn MI (4%) và noãn MII (34,3%) Sự hiện diện của các hạt này cũng có thể phụ thuộc vào liều lượng kích dục tố (gonadotropin) Nếu ít nhất 30 ống thuốc tiêm được sử dụng để kích thích buồng trứng thì ở 17,4% noãn xuất hiện dạng bất thường này so với 45,4% noãn thu được ở bệnh nhân sử dụng liều cao (hơn 45 ống) [31]

Trong một công trình hồi cứu của Xia và cộng sự (1997) cho thấy có sự tương quan giữa độ rộng của PVS và sự giảm khả năng thụ tinh và chất lượng phôi [35] Trong khi đó, các nghiên cứu khác không tìm thấy mối tương quan giữa các yếu tố này [11], [7] Gần đây, Ten và cộng sự (2007) đã báo cáo là kích thước của PVS không ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh, nhưng chất lượng phôi cải thiện ở noãn có PVS rộng [29] Các nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn cho thấy đặc tính PVS rộng thường xuyên xuất hiện ở noãn, 23% noãn được chọc hút, 11% ở các chu

kỳ xin noãn, 50% ở hợp tử [23] Tuy nhiên, vẫn chưa có sự đồng thuận về việc có nên đánh giá riêng yếu tố PVS để dự đoán chất lượng noãn

Trang 30

Hiện tại, có rất ít thông tin lý giải về ảnh hưởng của PVS hẹp so với PVS rộng Một mặt PVS rộng có thể phá vỡ hoặc gây ảnh hưởng đến tương tác giữa tế bào hạt quanh noãn và noãn, đặc biệt là thông qua các cầu nối, kênh thông tin xuyên

ZP Mặt khác, PVS rộng có thể tạo không gian thuận lợi cho sự tương tác giữa các phôi bào khi phân chia Và có thể có cơ chế nhất định mà PVS ảnh hưởng đến khả năng phát triển của noãn Có giả thuyết cho rằng PVS chứa các hợp chất cần thiết cho sự phát triển của tế bào hạt quanh noãn và noãn nhưng nguồn gốc của các chất này vẫn chưa được làm rõ Tuy nhiên, có một số tác giả cho rằng thể hạt vỏ tồn tại trong PVS Chính vì vậy, PVS có thể ảnh hưởng đến sự xâm nhập của tinh trùng vào noãn, sự thụ tinh và ngăn chặn hiện tượng thụ đa tinh [28], [9]

1.4.2.3 T ể ự t n ất

Sự xuất hiện của thể cực thứ nhất ở khoảng không quanh noãn là dấu hiệu cho thấy noãn trưởng thành về nhân Thể cực thứ nhất là kết quả của sự phân chia không đồng đều về tế bào chất trong quá trình giảm phân tạo noãn Vì vậy, thể cực thứ nhất có kích thước nhỏ hơn noãn nhưng chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội giống noãn Vào năm 1995, Einchenlaub và cộng sự đã đưa ra giả thuyết hình thái thể cực thứ nhất có thể phản ánh thời gian tồn tại của noãn sau khi phóng noãn Thể cực thứ nhất phân mảnh chứng tỏ noãn quá trưởng thành (aged oocyte) [12] Một vài tiêu chuẩn về hình thái của thể cực thứ nhất dùng để đánh giá chất lượng của noãn như: hình dạng thể cực (tròn hay bầu dục), kích thước (to hay nhỏ), bề mặt (trơn hay nhám) và thể cực nguyên vẹn hay phân mảnh [27]

Hiện tại, có một số nghiên cứu kết luận rằng hình thái, kích thước, độ nguyên vẹn của thể cực thứ nhất phản ánh chất lượng noãn (Xia và cs., 1997; Ebner và cs., 2000) Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại không cho thấy có sự tương quan giữa hình thái thể cực thứ nhất và khả năng phát triển về sau của noãn (Ciotti và cs., 2004; De Santis và cs., 2005; Chamayou và cs., 2006; Ten và cs., 2007) cũng như cấu trúc bộ gen của phôi (Verlinsky và cs., 2003) [33]

Trang 31

Hình.1.10 Đánh giá hình thái thể cực thứ nhất

a Thể cực nguyên vẹn, bề mặt trơn; b Thể cực nguyên vẹn, bề mặt nhám

c Thể cực phân mảnh; d Thể cực có kích thước lớn hơn bình thường

Nguồn:Ebner và cộng sự., 2000

T ắ

Thoi vô sắc có ảnh hưởng đến sự sắp xếp và phân ly của nhiễm sắc thể trong suốt quá trình giảm phân Sự phân bố của thoi vô sắc cũng là một chỉ tiêu trong đánh giá chất lượng noãn Trong quá trình ICSI, kim ICSI cần đặt đúng vị trí để tránh tổn thương thoi vô sắc và nhiễm sắc thể, thường kim đặt vào vị trí 3 hoặc 9 giờ so với vị trí của thể cực Tuy nhiên, thực tế cho thấy vị trí của thể cực thứ nhất không phản ánh chắc chắn vị trí thoi vô sắc Đặc biệt, ở phụ nữ lớn tuổi (> 40 tuổi) thì nguy cơ tạo noãn bất thường thoi vô sắc cao Bất thường thoi vô sắc gây sai sót

vị trí một hoặc vài nhiễm sắc thể trong giảm phân, gây lệch bội ở phôi bào Vị trí thoi vô sắc trong noãn có thể quan sát được nhờ kính hiển vi phân cực (Polscope, Cambridge, MA, USA)

Trang 32

Hình 1.11 Vị trí khác nhau của thoi vô sắc trong noãn

A – Thoi vô sắc nằm ngay dưới thể cực thứ nhất (PB1)

B – Thoi vô sắc nằm trong khoảng lệch 60 o so với PB1

C – Thoi vô sắc nằm trong khoảng lệch 60° và 120° so với PB1

D – Thoi vô sắc nằm trong khoảng lệch 120° và 180° so với PB1

E – Thoi vô sắc nằm đối diện với PB1 (180°)

F – Noãn không có thoi vô sắc

Nguồn: Moon JH và cộng sự, 2003

Ở người, noãn có thể cực thứ nhất nhưng không có thoi vô sắc có thể tồn tại

vào giai đoạn telophase I hoặc prometaphase I (Eichenlaub-Ritter và cs , 2002; De Santis và cs., 2005) Do vậy, ICSI noãn ở giai đoạn prometaphase I, khi nhiễm sắc

thể chưa được sắp xếp, có thể tiên lượng xấu đến kết quả thụ tinh và phát triển của phôi Gần đây, các nghiên cứu cho thấy ở noãn không có thoi vô sắc được thụ tinh

thì khả năng phát triển giảm (Wang và cs., 2001; Moon và cs., 2003; Rienzi và cs.,

2003) Vào năm 2003, Cooke và cộng sự đã chứng minh rằng việc biết chính xác vị trí của thoi vô sắc trong quá trình ICSI có thể cải thiện chất lượng phôi Nếu không

phát hiện thoi vô sắc thì khả năng tạo phôi tốt giảm đáng kể (Wang và cs., 2001; Moon và cs., 2003) Mặc dù vậy, mối tương quan này vẫn còn nhiều tranh cãi (Rienzi và cs., 2003; Cohen và cs., 2004) Nghiên cứu này cũng đã đưa ra sự tương

Trang 33

quan giữa sự hiện diện của thoi vô sắc và khả năng phát triển phôi trước làm tổ đến

giai đoạn phôi nang (Wang và cs., 2001) Kết quả cho thấy tỷ lệ phát triển của phôi

nang vào ngày 5 tăng ở nhóm noãn có hiện diện thoi vô sắc (51%) so với nhóm

không có thoi sắc (30%) [18]

1.4.2.5 ế t n t tế ất

Sự trưởng thành của noãn có vai trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào chất Theo đó thì noãn MII có hình thái tốt là noãn có tế bào chất rõ và sáng, có thể hạt (granularity) trung bình, không có thể vùi (inclusion) Hơn một nửa noãn người

được thu nhận là noãn sơ cấp, có ít nhất một bất thường về hình thái (Ebner và cs., 2003a; Suzuki và cs., 2004) Sự khiếm khuyết về tế bào chất có thể quan sát dưới

kính hiển vi [18]

 ộ h t trong tế bào chất - Granularity

Đối với thụ tinh trong ống nghiệm, bào tương noãn có hạt thô là đặc điểm thường gặp Thông thường các hạt thô phân bố khắp trong nền bào tương Trong một số trường hợp biểu hiện rõ hơn thì các hạt thô tập trung thành từng đám (Centrally located granular – CLG) trong nền bào tương Nguyên nhân xuất hiện và thành phần cấu tạo các hạt thô trong bào tương noãn hiện vẫn chưa rõ Theo Kahraman và cộng sự (2000) thì noãn xuất hiện CLG có thể chưa trưởng thành về tế bào chất [24]

Hình.1.12 Noãn có thể hạt phân tán và tập trung trong bào tương

Nguồn: Thomas Ebner, ESHER Campus Tours 2008

Trang 34

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của độ hạt và màu sắc bào tương noãn đến kết quả thụ tinh trong ống nghiệm của các tác giả trên thế giới cũng còn nhiều tranh cãi Nghiên cứu của Wilding và cộng sự (2007) khẳng định những noãn có bào tương hạt thô có tỷ lệ thụ tinh cao hơn noãn hoàn toàn không có hạt trong bào tương Trong khi đó, theo Loutradis và cộng sự (1999), Ten và cộng sự (2007) thì noãn sậm màu (dark cytoplasm) phát triển thành phôi có chất lượng kém hoặc noãn có bào tương hạt thô phân bố rải rác sẽ ảnh hưởng đến chất lượng hợp tử (Rienzi và cs., 2008) Các nghiên cứu trên noãn có hạt bào tương tập trung cũng cho thấy điều này có ảnh hưởng xấu đến hình thái nhân nguyên, chất lượng phôi cũng như sức sống của phôi sau trữ và rã đông (Ebner và cs., 2008; Rienzi và cs., 2008; Balana và

cs., 2008)

 Kết cấu tế bào chất (cytoplasmic texture)

Áp lực nội bào và trạng thái của tế bào chất có thể được ước đoán nhờ sự đàn hồi của tế bào chất lúc ICSI (injection) Một yếu tố khác cho thấy tế bào chất có tính

nhớt là độ dính kim trong lúc ICSI (Ebner và cs., 2001) Khả năng chịu đựng áp lực

của kim sau ICSI có thể phản ánh sự khiếm khuyết về kết cấu của tế bào chất chính xác Ở những noãn bị ảnh hưởng, đặc điểm của dòng của tế bào chất bị thay đổi, noãn không thể phục hồi lại hình dạng ban đầu Hậu quả là tổn thương bên trong tế bào chất nên ảnh hưởng bất lợi đến khả năng phát triển về sau, thậm chí noãn sẽ bị thoái hóa sau ICSI Hợp tử cũng như phôi tạo từ noãn có tế bào chất dính (sticky)

cho thấy có chất lượng không tốt và phôi nang bị khiếm khuyết nặng (Ebner và cs.,

2003b)

Những đặc điểm khác trong kết cấu và phân bố của tế bào chất noãn cũng đã

được nhiều tác giả mô tả (Kahraman và cs., 2000; Meriano và cs., 2001) Các hạt

nâu trong tế bào chất (brown particle) có thể phân bố khắp tế bào chất, ảnh hưởng đến toàn bộ tế bào chất hoặc chỉ tập trung ở vùng trung tâm Các nghiên cứu cho thấy có sự tương quan bất lợi về tỷ lệ mang thai dựa trên mức độ của hạt trong tế

bào chất (Kahraman và cs., 2000) Do đó, không nên chuyển một phôi duy nhất phát

triển từ noãn có khiếm khuyết về tế bào chất [18]

Trang 35

Hình.1.13 Noãn có hạt nâu trong tế bào chất với mức độ khác nhau

Nguồn: Thomas Ebner, ESHER Campus Tours 2008

 Thể vùi (inclusion)

Thể vùi là túi có kích thước nhỏ, nằm trong bào tương noãn và nổi lên trên nền bào tương khi quan sát dưới kính hiển vi Chính vì đặc điểm này mà thể vùi còn được gọi là thể có tính khúc xạ (refractile body) Thành phần và nguyên nhân xuất hiện thể vùi ở noãn vẫn chưa rõ ràng Đồng thời, ở bệnh nhân hơn 35 tuổi thì noãn xuất hiện thể vùi với tần suất cao hơn Nghiên cứu của Otsuki và cộng sự (2007) cho thấy thể vùi “lipofusin inclusion” chủ yếu chứa hỗn hợp lipid và các hạt cô đặc Noãn có thể vùi > 5µm thì giảm đáng kể tỷ lệ thụ tinh và không có khả năng phát triển thành phôi nang [17]

Hình.1.14 Sự hiện diện của thể vùi trong tế bào chất của noãn

 Không bào (vacuole)

Không bào là các túi nằm trong tế bào chất, chứa đầy dịch giống như dịch ở khoảng không quanh noãn (Van Blerkom, 1990) Không bào có số lượng và kích thước khác nhau trong tế bào chất Chúng có thể xuất hiện một cách tự phát (Van

Trang 36

Blerkom, 1990) hoặc bằng cách dung hợp các túi từ lưới nội chất nhám hoặc hệ thống Golgi trước khi xuất bào (El Shafie và cs., 2000) Các nghiên cứu trước đây cho thấy sự xuất hiện không bào trong noãn giai đoạn MII dao động trong khoảng 5,7% (De Sutter và cs., 1996) và 12,4% (Alikani và cs., 1995), sự hiện diện nhiều không bào chỉ chiếm một phần nhỏ xấp xỉ 1% (De Sutter và cs., 1996; Loutradis và cs., 1999)

Hình.1.15 Sự hiện diện của không bào trong tế bào chất của noãn

Ảnh hưởng của không bào ở noãn đến kết quả thụ tinh ống nghiệm đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu Theo De Sutter và cộng sự vào năm 1996 thì

tỷ lệ thụ tinh khi ICSI noãn có không bào giảm (40%) so với noãn bình thường (69,6%) Đồng thời, nghiên cứu của Van Blerkom (1990) đã cho thấy các không bào lớn có thể thay đổi vị trí của thoi vô sắc so với thể cực của noãn Điều này có thể dẫn đến sai hỏng trong thụ tinh và phân chia của phôi (Nayudu và cs., 1989; Van Blerkom và cs., 1990) Một nghiên cứu gần đây (Ebner và cs., 2005) cho thấy

có sự tương quan nhất định giữa đường kính không bào và sự xuất hiện hai nhân nguyên trong hợp tử, không có trường hợp nào được thụ tinh ở noãn có không bào với đường kính trên 14μm [18].

 ưới nội chất trơn S t nd lasma reticulum-SER)

Lưới nội chất trơn (SER) hiện diện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của noãn

Có hai dạng lưới nội chất trơn là dạng túi và dạng ống Lưới nội chất trơn có liên kết với hệ thống Golgi và giữ vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói, vận

Trang 37

chuyển và biến đổi protein sau dịch mã Ở giai đoạn noãn GV, lưới nội chất trơn có dạng túi nhỏ và phân bố rải rác Khi noãn ở giai đoạn MI thì chúng tăng về số lượng lẫn kích thước Lưới nội chất trơn xuất hiện dưới dạng đĩa tròn ở tế bào chất noãn vào cuối giai đoạn MI Cơ chế dẫn đến sự tập trung của SER vẫn chưa được hiểu rõ Các SER có thể phân biệt dễ dàng với không bào bởi vì chúng không tách biệt khỏi

tế bào chất bởi màng

Hình.1.16 Sự hiện diện của SER trong noãn

Theo nghiên cứu của Otsuki và cộng sự (2004) thì nguy cơ tạo noãn có SER tăng ở bệnh nhân có nồng độ estradiol cao vào ngày tiêm HCG Ở người, bơm Ca2+

được định vị ở các túi nhỏ nằm dưới hệ thống SER Ở hợp tử và phôi đang phân chia thì túi Ca2+ không hiện diện lâu gần vùng màng bào tương Do đó, ở vùng rìa của noãn chứa các bào quan nghèo Ca2+ trong khi ở vùng xung quanh nhân thì dư thừa (Sousa và cs., 1996, 1997) Bởi vì việc giải phóng Ca2+ có vai trò then chốt trong quá trình trưởng thành của noãn, sự thụ tinh và phát triển của phôi (Homa và cs., 1993; Terasik, 1997), các nghiên cứu về dòng tín hiệu Ca2+ giúp hiểu rõ nguyên nhân và ảnh hưởng của việc hình thành SER ở noãn Việc vận chuyển Ca2+ qua kênh ở noãn GV được trợ giúp bởi 17-β estradiol còn androtendiol là chất ức chế (Terasik và Mendoza, 1997) Điều này phần nào giải thích được sự xuất hiện của SER ở noãn trong chu kỳ có nồng độ estradiol cao vào ngày tiêm HCG Việc sử dụng phác đồ ngắn đã cung cấp nhiều thông tin về SER của noãn được thu nhận Điều đó, chứng tỏ việc kích thích buồng trứng có ảnh hưởng đến hình thái và chất lượng của noãn [17]

Trang 38

Nhiều nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của sự xuất hiện SER ở noãn đến kết quả thụ tinh và tạo phôi trong các chu kỳ thụ tinh ống nghiệm Theo nghiên cứu của Otsuki và cộng sự (2004) thì việc tránh tiêm tinh trùng vào SER thì vẫn cho kết quả thụ tinh bình thường, tuy nhiên chỉ 18,2% noãn thụ tinh phát triển đến giai đoạn phôi nang vào ngày 5 Mặc dù tốc độ phân chia của phôi tương tự nhau giữa nhóm

có SER và đối chứng, tỷ lệ thai sinh hoá ở nhóm đối chứng cao hơn đáng kể (22,2%) so với nhóm có SER (3,5%) SER có tác động tương tự lên tỷ lệ thai lâm sàng bởi vì giảm con số này từ 28,2% ở nhóm đối chứng xuống còn 5,6% ở nhóm

noãn có SER [22]

Nhìn chung, sự phát triển về sau của noãn bị ảnh hưởng bởi những bất thường nhất định của tế bào chất Ví dụ, bất thường về tổ chức ở tế bào chất trong quá trình trưởng thành của noãn có thể liên quan với những sai hỏng trong thụ tinh và lệch bội Trong khi đó, nếu sự bất thường xảy ra sau quá trình trưởng thành thì sự thụ tinh vẫn bình thường nhưng có vấn đề trong phát triển phôi Noãn có kích thước quá

to (giant) hoặc có hạ sậm tập trung ở giữa (dark center granularity), sự bất thường khi hình thành thoi vô sắc có thể xảy ra sớm trong quá trình trưởng thành Những noãn này có nguy cơ lệch bội Trong khi đó, sự hình thành không bào và SER xảy

ra muộn hơn nên có thể gây bất thường trong quá trình phát triển về sau [18]

Trang 39

Chương 2

VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP

Trang 40

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là noãn người Noãn của bệnh nhân được điều trị bằng thụ tinh trong ống nghiệm tại Đơn vị hỗ trợ sinh sản Bệnh viện An Sinh Tp Hồ Chí Minh từ tháng 9/2010 đến tháng 4/2011

Địa chỉ: số 10 Trần Huy Liệu, Phường 12, Quận Phú Nhuận, Tp Hồ Chí Minh

Chỉ tiêu chọn mẫu

 Tuổi vợ ≤ 38 tuổi

 Độ dày niêm mạc tử cung ≥ 10mm; không có bất thường về cấu trúc

tử cung

 Chồng có tinh dịch đồ với tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới ≥10%, hình

dạng bình thường ≥ 1% (theo tiêu chuẩn WHO 2010)

Chỉ tiêu loại trừ mẫu

 Các chu kỳ có xin noãn, xin tinh trùng

 Chu kỳ sử dụng noãn hoặc tinh trùng trữ lạnh

 Chu kỳ sử dụng tinh trùng thu nhận từ phẫu thuật

 Chu kỳ trữ phôi toàn bộ

 Chu kỳ điều trị với noãn trưởng thành trong ống nghiệm

Định dạng
Số trang	91
Dung lượng	4,74 MB