Bài viết mô tả biến đổi hình thái cấu trúc noãn người sau đông lạnh và đánh giá kết quả thụ tinh trong ống nghiệm của noãn sau rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa.
Tạp chí y - dợc học quân số 6-2018 BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI NỖN VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA NỖN SAU ĐƠNG LẠNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HĨA Lê Thanh Huyền*; Quản Hồng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* CS TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá biến đổi hình thái nỗn khả phát triển nỗn sau rã đơng (tỷ lệ sống, khả thụ tinh, chất lượng phôi trước chuyển phôi, tỷ lệ có thai, tỷ lệ làm tổ) phương pháp thuỷ tinh hoá Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 211 nỗn trưởng thành đơng lạnh phương pháp thủy tinh hóa rã đơng (tương ứng với 34 chu kỳ có nỗn đơng lạnh 34 chu kỳ rã đông - chuyển phôi) Viện Mô phôi Lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y Kết quả: hình thái nỗn đường kính bào tương độ dày màng suốt sau rã đông không thay đổi so với trước đông lạnh Thoi vô sắc quan sát thấy 100% nỗn rã đơng sau ni cấy Tỷ lệ nỗn sống sau rã đơng 89,09%, tỷ lệ thụ tinh 71,28%, tỷ lệ phôi tốt ngày 38,71%, tỷ lệ có thai lâm sàng 29,41%, tỷ lệ làm tổ 12,94% Kết luận: đơng lạnh thủy tinh hóa giúp bảo quản tốt nỗn người, nỗn sau rã đơng có tiềm phát triển cao * Từ khóa: Thụ tinh ống nghiệm; Đơng lạnh thủy tinh hóa Morphological Changes and Outcomes of IVF of Human Oocytes Cryopreserved by Vitrification Summary Objectives: To evaluate morphological changes and developmental competence of oocyte after vitrification (i.e survival rate, fertilization ability, embryo quality, clinical pregnancy rate, implantation rate) by using vitrification method Subjects and methods: 211 mature oocytes had vitrified and thawed in Military Morphological Institute of Vietnam Military Medical University Results: Vitrified oocyte did not change in terms of morphology, repolymerization of the meiotic spindle occurs in 100% of the oocytes surviving cryopreservation after hours Observed survival rate was 89.09%, fertilization rate of vitrified oocyte was 71.28%, good quality embryo on day was 38.71%, clinical pregnancy rate was 29.41% and implantation rate was 12.94% Conclusion: Vitrification is an efficient method for human oocyte cryopreservation, vitrified - thawed oocytes have good quality and highly developmental competence * Keywords: In vitro vitrification; Fertification ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, trữ lạnh xem kỹ thuật thiếu điều trị vô sinh tụ tinh ống nghiệm (TTTON) Trong trữ lạnh phơi giúp tăng tính an tồn hiệu chu kỳ kích thích buồng trứng làm TTTON trữ lạnh giao tử có vai trò * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Thanh Huyền (lethanhhuyenk53@gmail.com) Ngày nhận bài: 26/04/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 13/06/2018 Ngày báo đăng: 21/06/2018 30 Tạp chí y - dợc học quân sè 6-2018 quan trọng vấn đề bảo tồn khả sinh sản người có nhiều tiềm ứng dụng rộng rãi khác Trữ lạnh noãn xem giải pháp hữu hiệu để bảo tồn khả sinh sản cho phụ nữ độc thân phụ nữ mắc bệnh lý ác tính, sở để thành lập ngân hàng noãn người cho Trong số trường hợp đặc biệt, người chồng không lấy tinh trùng mẫu tinh trùng không đạt tiêu chuẩn sau noãn chọc hút, đơng lạnh nỗn lựa chọn để khơng bỏ nỗn Ngồi ra, trữ lạnh nỗn giúp giảm tình trạng số lượng phơi dư thừa ngày gia tăng [2, 8] Trên giới, trường hợp mang thai thành cơng từ nỗn người trữ lạnh Chen C CS công bố năm 1986 [5], sau thành công trữ lạnh phôi người thời gian ngắn Tuy nhiên, nay, so với đông lạnh phơi, hiệu đơng lạnh nỗn gây nhiều tranh cãi Việc trữ lạnh rã đông nỗn gặp nhiều khó khăn so với tinh trùng phơi Đặc điểm cấu trúc khác biệt nỗn kích thước tế bào thể tích nước tế bào lớn, tốc độ khử nước chậm ngun nhân khiến cho nỗn dễ bị tổn thương q trình làm lạnh rã đơng Các tổn thương ảnh hưởng đến khả sống, khả thụ tinh lực phát triển phơi tạo thành Vì vậy, chúng tơi thực nghiên cứu với mục tiêu: Mô tả biến đổi hình thái cấu trúc nỗn người sau đơng lạnh đánh giá kết TTTON nỗn sau rã đơng phương pháp thủy tinh hóa ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 211 noãn trưởng thành đông lạnh phương pháp thủy tinh hóa rã đơng (tương ứng với 34 chu kỳ có nỗn đơng lạnh 34 chu kỳ rã đơng - chuyển phôi bệnh nhân (BN)) Viện Mô phôi Lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y, thời gian từ tháng - 2015 đến 12 - 2017 - Tiêu chuẩn lựa chọn: + Noãn lấy vào thời điểm 34 36 sau tiêm hCG + Noãn giai đoạn MII có hình thái bình thường (theo Đồng thuận đánh giá phân loại nỗn, phơi VINAGOFPA, 2012) [1] - Tiêu chuẩn loại trừ: noãn giai đoạn GV, MI noãn bất thường * Vật liệu, hóa chất: Sử dụng mơi trường đơng lạnh rã đơng nỗn/phơi (Hãng Kitazato, Nhật Bản) Phương pháp nghiên cứu * Đơng lạnh rã đơng nỗn: Áp dụng quy trình đơng lạnh thủy tinh hóa theo phương pháp Cryotop Masashige Kuwayama (2005): + Trước đơng lạnh, tất nỗn xử lý enzym hyaluronidase (Hyase, Vitrolife) để loại bỏ hết tế bào nang bao xung quanh + Sau rã đông, nuôi cấy nỗn mơi trường IVF thời gian trước tiến hành kỹ thuật ICSI 31 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2018 * Xác định nỗn sống: Sau rã đơng, nỗn sống có màng suốt, màng tế bào ngun vẹn, bào tương sáng màu, hình thái khơng thấy có thay đổi so với trước đơng lạnh * Phân tích thoi vơ sắc: Áp dụng theo phương pháp Markus Montag (2006), sử dụng hệ thống Module polaraide - octax laser system kính hiển vi Nikon TE2000: sau rã đơng, tất nỗn theo dõi đánh giá xuất thoi vô sắc bào tương noãn thời điểm giờ, giờ, sau rã đông * Phương pháp đánh giá hình thái phơi: Quan sát hình thái phơi kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70, độ phóng đại 200 lần Phơi ngày (ngày chuyển phơi) phân loại theo tiêu chuẩn Đồng thuận ALPHA (2011) Đồng thuận đánh giá phân loại nỗn, phơi VINAGOFPA (2012) [1], chia phôi thành loại dựa vào đặc điểm số lượng phôi bào, độ đồng phôi bào tỷ lệ mảnh vỡ bào tương so với thể tích tồn phơi: - Phơi tốt: phơi có - phơi bào, kích thước phơi bào đồng (lệch ≤ 20%), tỷ lệ mảnh vỡ bào tương < 10% thể tích phơi, khơng có phơi bào đa nhân - Phơi trung bình: phơi có < phơi bào, đa số phơi bào có kích thước đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương 10 - 25% thể tích phơi, khơng có phơi bào đa nhân - Phơi xấu: phơi bào có kích thước không đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương > 25% thể tích phơi, có phơi bào đa nhân 32 * Xác định tỷ lệ có thai tỷ lệ làm tổ chu kỳ chuyển phôi từ nỗn đơng lạnh: BN sau chuyển phơi 14 ngày hẹn đến Viện để thử lượng ß-hCG máu: + Có thai sinh hố: sau chuyển phơi 14 ngày có nồng độ ß-hCG > 25 ng/ml + Có thai lâm sàng: sau - tuần chuyển phôi, siêu âm thấy túi ối buồng tử cung + Tỷ lệ làm tổ phơi tính tổng số phôi làm tổ tổng số phôi chuyển vào tử cung KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Một số đặc điểm chu kỳ rã đơng nỗn (n = 34) Tuổi trung bình BN 34,1 ± 5,9, nhiều 47 tuổi, 25 tuổi Số năm vơ sinh trung bình 5,9 ± 2,8, thời gian vơ sinh ngắn năm, dài 14 năm Số noãn rã đơng trung bình tính BN 6,2 ± 2,2, người có nỗn rã đơng 4, trường hợp nhiều 14 noãn Thời gian đơng lạnh từ - 15 tháng, trung bình 6,6 ± 3,5 tháng Tỷ lệ sống noãn sau rã đơng Tổng số 211 nỗn rã đơng, sau rã đơng 188 nỗn (89,09%) khơng thấy thay đổi hình thái so với trước đơng lạnh; 23 nỗn lại (10,91%) bị thối hóa, bào tương có màu sẫm, có nhiều hạt thơ, màng tế bào bị ly giải, không định rõ ranh giới màng bào tương bờn mng sut Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 6-2018 Ảnh 1: Nỗn bào II người trước đơng lạnh Ảnh 2: Nỗn bào II người sau rã đơng sống So sánh thay đổi hình thái nỗn trước sau rã đông Bảng 1: Thời điểm nghiên cứu Chỉ tiêu Trước đông (n = 188) Sau rã đông (n = 188) p Độ dày màng suốt trung bình (µm) 18,14 ± 3,06 18,20 ± 2,66 > 0,05 Đường kính nỗn trung bình (µm) 116,58 ± 4,95 116,18 ± 5,36 > 0,05 Tất noãn chụp ảnh trước đơng lạnh sau rã đơng, sau đo độ dày màng suốt, đo đường kính bào tương nỗn 188 nỗn sống sau rã đơng Kết cho thấy đường kính bào tương nỗn độ dày màng suốt nỗn trước đơng lạnh sau rã đơng thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê Hình thái nỗn khơng biến đổi sau đơng lạnh Trong số 211 nỗn nghiên cứu, 182 nỗn (86,2%) quan sát thấy thoi vô sắc trước đông lạnh; 29 nỗn lại khơng quan sát thấy thoi vơ sắc thời điểm đơng lạnh Sau rã đơng, tồn số nỗn có thoi vơ sắc (182 nỗn), 6/29 nỗn khơng có thoi vơ sắc sống sau rã đông Sự xuất thoi vô sắc nỗn sống sau rã đơng (n = 188) Bảng 2: Nhóm nghiên cứu Nỗn nhìn thấy thoi vơ sắc Nỗn khơng nhìn thấy thoi vơ sắc Sau rã đơng 0/182 (0%) 188 Sau rã đông 45/182 (24.7%) 143 Sau rã đông 164/182 (90,1%) 24 Sau rã đông 182/182 (100%) Thời gian Tại thời điểm sau rã đông, không quan sát thấy thoi vơ sắc tất nỗn cũn sng 33 Tạp chí y - dợc học quân sù sè 6-2018 So sánh vị trí thoi vơ sắc nỗn trước đơng lạnh nỗn sau rã đơng Bảng 3: Thời điểm nghiên cứu Góc thể cực thoi vô sắc - 30 Trước đông lạnh (n = 182) Sau rã đông (n = 182) 138/182 (75,8%) 130/182 (71,4%) 28/182 (15,3%) 33/182 (18,1%) 12/182 (6,6%) 15/182 (8,2%) 4/182 (2,3%) 4/182 (2,3%) 0 30 - 60 60 - 120 > 120 0 Phân tích vị trí thể cực thoi vơ sắc nỗn sau rã đơng so với trước đơng lạnh cho thấy tỷ lệ nhỏ nỗn có thay đổi vị trí thể cực Trước đơng lạnh, 138 nỗn có thoi vô sắc nằm sát thể cực 1, 28 nỗn có thoi vơ sắc lệch so với thể cực từ 30 - 600; 12 nỗn có thoi vơ sắc vị trí 60 - 1200 so với thể cực 1, nỗn có thoi vơ sắc vị trí 120 - 1800 Tuy nhiên, sau rã đơng, 130 nỗn có thoi vơ sắc vị trí - 300 Tỷ lệ thoi vị trí 30 - 1200 tăng từ 21,9% lên 26,3% Kết thực TTTON nỗn sau rã đơng Nỗn thụ tinh bình thường: 134/188 (71,28%); nỗn thụ tinh bất thường: 3/188 (1,6%); số phôi phân chia: 124/134 (92,5%); số phôi tốt ngày 3: 48/124 (38,71%); số phơi chuyển trung bình: 2,5, phơi, nhiều phơi; 34 kỳ chuyển phơi, 12 chu kỳ có thai sinh hóa 35,29%, 10 chu kỳ có thai lâm sàng (29,41%), trường hợp thai, trường hợp hai thai trường hợp sảy thai (8,3%) tuần thứ 12; tỷ lệ làm tổ: 11/85 (12,94%) BÀN LUẬN Hiện nay, việc bảo quản lạnh noãn người chủ yếu thực theo hai phương pháp đông lạnh hạ nhiệt độ chậm thủy tinh hóa Với phương pháp đông lạnh hạ nhiệt độ chậm, cố gắng giảm thiểu tác động bất lợi đến tế bào cách kiểm sốt đặc tính lý sinh q trình đơng lạnh tốc độ làm lạnh làm ấm, kết hợp với sử dụng chất bảo vệ đơng lạnh thích hợp Với quy trình đơng lạnh hạ nhiệt độ chậm, tế bào bị khử nước thơng qua q trình cân thẩm thấu hình thành đá ngoại bào Trong đó, thủy tinh hóa coi “phương pháp 34 đông lạnh không cân bằng”, phương pháp sử dụng chất bảo vệ đơng lạnh có nồng độ cao, kết hợp với tốc độ làm lạnh cực nhanh khiến dung dịch rắn hóa mà khơng trải qua hình thành tinh thể đá, giảm thiểu tổn thương đông lạnh cho tế bào Một số báo cáo gần cho thấy tỷ lệ sống noãn người đông lạnh ngày nâng cao sử dụng phương pháp thủy tinh hóa Bo CS (2015) thủy tinh hóa 466 nỗn người cho tỷ lệ sống sau rã đông đạt 86,69% [4] Đặc biệt, Antinori M CS (2007) công bố tỷ lệ sống lên đến 99,4% nghiên cứu 330 nỗn đơng lạnh phương phỏp Tạp chí y - dợc học quân số 6-2018 thủy tinh hóa [3] Nghiên cứu chúng tơi, tỷ lệ noãn sống 89,09%, tương đương nhiều nghiên cứu giới Để đánh giá ảnh hưởng q trình đơng lạnh (đặc biệt q trình khử nước) đến hình thái nỗn, chúng tơi tiến hành đo đường kính bào tương nỗn độ dày màng suốt nỗn sống sau rã đơng, so sánh với trước đông lạnh Kết cho thấy, sau rã đơng, kích thước hình dạng nỗn khơi phục lại hồn tồn so với trước đơng lạnh (bảng 1) Tương tự kết chúng tơi, Martínez-Burgos M (2011) [7] nghiên cứu 53 nỗn thủy tinh hóa nhận thấy, sau rã đơng, tỷ lệ nỗn khơi phục lại hồn tồn thể tích ban đầu 97,5%; nhóm nỗn đơng lạnh chậm, tỷ lệ khơi phục lại thể tích hồn tồn 85,7% Tác giả cho rằng, khả khơi phục lại thể tích nhanh dấu hiệu cho thấy màng tế bào bào tương noãn “khỏe mạnh” Thay đổi nhiệt độ q trình trữ lạnh - rã đơng dẫn tới thay đổi cấu trúc thoi vơ sắc nỗn Thoi vơ sắc đóng vai trò quan trọng q trình thụ tinh, bao gồm hồn tất giảm phân, đẩy thể cực thứ hai, di chuyển tiền nhân phân chia hợp tử Khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp, phân tử tubulin giải trùng hợp, làm biến cấu trúc vi ống Do đó, việc tái trùng hợp lại xác vi ống đảm bảo cho trình thụ tinh diễn bình thường, giảm nguy hình thành phơi lệch bội Việc sử dụng kính hiển vi tăng cường ánh sáng phân cực, nhà nghiên cứu quan sát hình ảnh thoi vơ sắc bào tương noãn Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy điều kiện tối ưu nhiệt độ 370C, hình ảnh thoi vơ sắc quan sát thấy sau khoảng từ vài chục phút đến vài sau rã đông [6] Kết nghiên cứu cho thấy, sau nuôi cấy, thoi vô sắc phục hồi 100% nỗn sau rã đơng (bảng 2) Việc xác định thời điểm tái trùng hợp hồn tồn thoi vơ sắc để lựa chọn thời gian thụ tinh thích hợp có vai trò định nâng cao tỷ lệ thụ tinh noãn sau rã đông hạn chế phôi lệch bội sau Căn vào kết nghiên cứu công bố khác giới, lựa chọn thời điểm sau rã đông để thực kỹ thuật ICSI nỗn đơng lạnh, kết quả: tỷ lệ thụ tinh 71,28%; tỷ lệ thai lâm sàng đạt 29,41% tỷ lệ phôi làm tổ đạt 12,94% Kết tương đồng với nhiều nghiên cứu khác giới Antinori M (2007) [6] thực ICSI 328 nỗn đơng lạnh 726 nỗn “tươi”, nhóm nỗn thủy tinh hóa có tỷ lệ thụ tinh 93%, tỷ lệ thai lâm sàng 32,5%, tỷ lệ làm tổ 13,2%, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với nhóm nỗn tươi khơng đơng lạnh Từ kết thụ tinh nỗn rã đơng, đặc biệt kết lâm sàng cho phép nhận định rằng, nhiều tranh cãi liên quan đến tác động quy trình đơng lạnh đến cấu trúc nội bào ảnh hưởng đến tiềm phát triển noãn sau rã đông, với nỗ lực cải tiến thành phần chất bảo quản dụng cụ chứa mẫu, hiệu quy trình đơng lạnh thủy tinh hóa nỗn nâng cao rõ rệt 35 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2018 KT LUN Qua nghiên cứu 211 nỗn đơng lạnh rã đơng 34 chu kỳ rã đơng nỗn chuyển phơi cho thấy: - Hình thái nỗn kích thước bào tương độ dày màng suốt sau rã đông không thay đổi có ý nghĩa thống kê so với trước đơng lạnh - Thoi vơ sắc nỗn sau rã đơng phục hồi hồn tồn sau ni cấy - Tỷ lệ nỗn sống sau rã đơng 89,09%, tỷ lệ phơi tốt ngày 38,71%, tỷ lệ thụ tinh 71,28%, tỷ lệ thai lâm sàng 29,41%, tỷ lệ làm tổ 12,94% TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Viết Tiến, Nguyễn Thị Ngọc Phượng CS Đồng thuận đánh giá phân loại nỗn, phơi hỗ trợ sinh sản Hội Phụ sản khoa Sinh đẻ có kế hoạch Việt Nam (VINAGOFPA), Chi hội Y học sinh sản Việt Nam (VSRM) 2012 36 Đặng Quang Vinh CS Trữ lạnh phôi trứng hỗ trợ sinh sản Vô sinh hỗ trợ sinh sản Hosrem 2007 Antinori M, Licata E, Dani G et al Cryotop vitrification of human oocytes results in high survival rate and healthy deliveries Reprod Biomed Online 2007, 14 (1), pp.72-79 Bo Xu, Xian-hong Tong et al Cryotop vitrification affects oocyte quality and embryo developmental potential EC Gynaecology 2015, (2), pp.46-52 Chen C Pregnancy after human oocyte cryopreservation Lancet 1986, 2, pp.884-886 Ciotti P.M, Porcu E, Notarangelo L et al Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing Fertil Steril 2009, 91 (6), pp.2399-2407 Martínez-Burgos M, Herrero L, Megías D et al Vitrification versus slow freezing of oocytes: Effects on morphologic appearance, meiotic spindle configuration and DNA damage Fertil Steril 2011, 95 (1), pp.374-377 Oktay K, Cil A.P, Bang H Efficiency of oocyte cryopreservation: A meta-analysis Fertil Steril 2006, 86, pp.70-80 ... phương pháp thủy tinh hóa ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 211 noãn trưởng thành đơng lạnh phương pháp thủy tinh hóa rã đơng (tương ứng với 34 chu kỳ có nỗn đông lạnh 34... bào Trong đó, thủy tinh hóa coi phương pháp 34 đơng lạnh không cân bằng , phương pháp sử dụng chất bảo vệ đơng lạnh có nồng độ cao, kết hợp với tốc độ làm lạnh cực nhanh khiến dung dịch rắn hóa. .. tỷ lệ thụ tinh nỗn sau rã đơng hạn chế phôi lệch bội sau Căn vào kết nghiên cứu công bố khác giới, lựa chọn thời điểm sau rã đông để thực kỹ thuật ICSI nỗn đơng lạnh, kết quả: tỷ lệ thụ tinh 71,28%;