ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TIỂU LUẬN HỌC PHẦN MỘT SỐ VẤN ĐỀ HIỆN ĐẠI TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÊN TIỂU LUẬN: NHÂN GIỐNG HOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT THÁI NGUYÊN – 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 NỘI DUNG 2 1. Căn cứ khoa học 2 1.1.Định nghĩa 2 1.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2 1.3. Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 1.4. Quy trình nhân giống hoa in vitro 5 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống hoa bằng nuôi cấy mô tế bào 6 2. Thành tựu và triển vọng của kỹ thuật nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 2.1. Thành tựu 9 2.2. Triển vọng 10 KẾT LUẬN 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 MỞ ĐẦU Từ thời xa xưa con người đã biết thưởng thức cái đẹp của thiên nhiên . Hoa đã trở thành một nét đẹp không thể thiếu trong các ngày lễ tết, hội hè… Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giới cũng như ở Việt Nam ngày càng nhiều. Việt Nam là nước có khí hậu đa dạng nên có nguồn trên cây hoa phong phú, đồng thời có thể trồng trọt nhiều loại hoa với nhiều vụ trong năm. Thị trường hoa ngày càng được mở rộng từ nội địa đến tiềm năng xuất khẩu hoa ra nước ngoài. Nhà nước khuyến khích trồng hoa, mở rộng đầu tư và phát triển sản xuất hoa ở những nơi có điều kiện phù hợp. Công nghệ nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đang là một lĩnh vực được nhiều người quan tâm, đây là một công cụ quan trọng trong chương trình cải thiện giống. Ngày nay, nhờ áp dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào mà việc chọn tạo giống hoa được tiến hành nhanh hơn và có thể khắc phục được một số khó khăn mà các phương pháp chọn giống truyền thống khó vượt qua. Trong những năm gần đây, việc nhân nhanh giống cây có phẩm chất di truyền tốt bằng công nghệ mô, tế bào đang được ứng dụng ngày càng nhiều cho cây lâm nghiệp, cây công nghiệp mang lại hiệu quả và năng suất cao. Để hiểu rõ hơn về công nghệ nuôi cấy mô tế bào, tôi tiến hành tìm hiểu đề tài “Nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”.
Trang 1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-TIỂU LUẬN HỌC PHẦN MỘT SỐ VẤN ĐỀ HIỆN ĐẠI TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TÊN TIỂU LUẬN:
NHÂN GIỐNG HOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
THÁI NGUYÊN – 2014
Trang 2MỤC LỤC
Trang 3MỞ ĐẦU
Từ thời xa xưa con người đã biết thưởng thức cái đẹp của thiên nhiên Hoa đã trở thành một nét đẹp không thể thiếu trong các ngày lễ tết, hội hè… Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giới cũng như ở Việt Nam ngày càng nhiều
Việt Nam là nước có khí hậu đa dạng nên có nguồn trên cây hoa phong phú, đồng thời có thể trồng trọt nhiều loại hoa với nhiều vụ trong năm Thị trường hoa ngày càng được mở rộng từ nội địa đến tiềm năng xuất khẩu hoa ra nước ngoài Nhà nước khuyến khích trồng hoa, mở rộng đầu tư và phát triển sản xuất hoa ở những nơi có điều kiện phù hợp
Công nghệ nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đang là một lĩnh vực được nhiều người quan tâm, đây là một công cụ quan trọng trong chương trình cải thiện giống Ngày nay, nhờ áp dụng phương pháp nuôi cấy mô
tế bào mà việc chọn tạo giống hoa được tiến hành nhanh hơn và có thể khắc phục được một số khó khăn mà các phương pháp chọn giống truyền thống khó vượt qua
Trong những năm gần đây, việc nhân nhanh giống cây có phẩm chất di truyền tốt bằng công nghệ mô, tế bào đang được ứng dụng ngày càng nhiều cho cây lâm nghiệp, cây công nghiệp mang lại hiệu quả và năng suất cao
Để hiểu rõ hơn về công nghệ nuôi cấy mô tế bào, tôi tiến hành tìm hiểu đề
tài “Nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”.
Trang 4NỘI DUNG
1. Căn cứ khoa học
1.1.Định nghĩa
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phương pháp tách rời một bộ phận sạch của cây (mô, tế bào…) đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để chúng tiếp tục phân bào rồi biệt hóa thành mô, cơ quan (cụm chồi, chồi…) và phát triển thành cây mới.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
- Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn…
- Nuôi cấy mô sẹo
- Nuôi cấy tế bào đơn
- Nuôi cấy protoplast
Nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất còn gọi là nuôi cấy thực vật in vtro (nuôi cấy trong ống nghiệm).
1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tính toàn năng của tế bào
Gottlied Haberlandt lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế
bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời” Theo ông, tế
bào bất kỳ của cơ thể sinh vật đa bào nào cũng đều có khả năng phát triển thành
cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Đó chính là tính toàn năng của tế bào
Trang 5Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, người ta đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ
Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào Tuy nhiên, tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau
đó các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan khác nhau
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hóa tế bào, ngược với quá trình phân hóa tế bào
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, mẫu vật ban đầu phải trải qua giai đoạn phản phân hóa để trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra những mô, tế bào không phân hóa, sau đó các tế bào và mô này sẽ tạo thành cây hay cơ quan hoàn chỉnh thông qua quá trình tái phân hóa
Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật
Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào
Trong nội bộ từng cơ thể được diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con có bộ NTS giống nhau và giống tế bào mẹ Như vậy, qua nguyên phân bộ NST của mẹ
đã chuyển nguyên vẹn sang tế bào con
Trang 6Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống in vitro khi lấy các bộ phận sinh trưởng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông tin
di truyền giống nhau và giống cơ thể mẹ Như vậy nếu cơ thể mẹ có các tính trạng di truyền tốt thì các tính trạng đó sẽ được thể hiện ở cơ thể con cái
Cơ sở hóa học của nuôi cấy mô, tế bào
Môi trường nuôi cấy được coi là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật gồm các muối khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon, các acid amin, các chất điều hòa sinh trưởng và một số phụ gia khác
Yêu cầu đặt ra khi lựa chọn môi trường là phải thích hợp với sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của mô nuôi cấy, thành phần và hàm lượng các chất phải chính xác và phù hợp với từng đối tượng cụ thể Môi trường
MS là môi trường chủ yếu được lựa chọn trong nhân giống in vitro
1.3 Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật
Giai đoạn khởi xướng (1898 -1930)
Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cáy mô
tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào dựa trên thuyết tế bào của Shleiden – Schwann.
Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950)
Bắt đầu với công trình của White (1930) nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiết nấm men.
Năm 1935, Thimann đã phát hiện ra auxin (IAA) trong mô thực vật Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng IAA và vitamin bổ sung vào môi trường nuôi cấy thu được kết quả tốt.
Những năm 1940, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy Kết quả cho thấy chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bào.
Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 -1960)
Trang 71954-1955, Skoog phát hiên kinetinine có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào.
1956, Skoog và Miller tìm hiểu của tỷ lệ auxin/cytokinine trong môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá.
1960, Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng.
Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực vật (1960 đến nay)
1960, Cookingđã dùng enzyme cellulase phân huye cellulose của tế bào thực vật thu được tế bào không vỏ gọi là tế bào trần.
1968, Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn.
Từ 1977, Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây khoai tây – cà chua.
Từ 1980, hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công bố.
Ngày nay nuôi cấy mô tế bào không những là cơ sở quan trọng trong công nghệ sinh học hiện đại mà còn là công cụ quan trọng trong chọn tạo nhân giống, đóng góp cơ sở lý luận mới cho sinh học hiện đại.
1.4 Quy trình nhân giống hoa in vitro
Bước 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy là mảnh mô đặt vào môi trường nuôi cấy Để tiến hành nuôi cấy
in vitro thành công, khi lựa chọn mô cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được
dùng làm mẫu cấy, mùa vụ lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu… Cẫu cấy sau khi lựa chọn được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học
Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro
Trang 8Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường
bổ sung cytokinine, GA3 và các chất hữu cơ khác
Bước 3: Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn rất quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài
Bước 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn
bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó
là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, đây là bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, ánh sáng,
sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền
Bước 5: chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp… Sau khoảng hai tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng, giảm độ ẩm Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định
Trang 9về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao… Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường
độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao Cây con thường được cấy trong luống ươm, dễ thoát nước, tơi xốp…
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống hoa bằng nuôi cấy mô tế bào
1.5.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy
Để nuôi cấy mô thực vật cho khả năng tái sinh cây cao người ta có thể sử dụng nhiều loại mô nuôi cấy khác nhau như: mô hạt, mô lát cắt lá, mô lát cắt thân, rễ, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Với mỗi loại mô nuôi cấy khác nhau cũng
sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của cây
Tỷ lệ tái sinh cây phụ thuộc vào tuổi của mẫu cấy: mẫu cấy già hay mẫu cấy còn non Tuổi của mẫu cấy ảnh hưởng rất nhiều đến tỷ lệ sống và tỷ lệ phản ứng Nếu mẫu cấy là mẫu trưởng thành không con khả năng sinh trưởng nữa thì
khi nuôi cấy mẫu sẽ dần chết đen Còn mẫu từ lá non (6 tháng tuổi in-vitro) đã
phát triển thành các protocorm ở bề mặt lát cắt lá chỉ sau 4 - 7 tuần và phụ thuộc vào môi trường sinh trưởng Ngoài ra, khả năng tái sinh cây còn phụ thuộc vào kiểu di truyền, tình trạng sinh lý, kích thước mẫu cấy và phương pháp cấy…
1.5.2.Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Khoáng đa lượng
Khoáng đa lượng như Mg, Ca, N, P, K,S Nhu cầu thực vật về khoáng
đa lượng là trên 0,5 mM Trong đó ba yếu tố quan trọng mà bất kỳ loại cây nào trong tự nhiên, trong gieo trồng cũng như trong nuôi cấy thường được bổ sung
đó là N (đạm), P (lân), K (kali)
Nitơ là thành phần đóng vai trò quan trọng, nó tham gia vào thành phần của axit nucleic, là thành phần chủ yếu của nguyên sinh chất của tế bào, do đó ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của cây Cây trong nuôi cấy không thể sử dụng được nguồn nitơ nguyên tử mà sử dụng ở dạng amonium (NH4+) và nitrat (NO3-) Còn photpho tham gia vào quá trình vận chuyển năng
Trang 10lượng, sinh tổng hợp protein, axit nucleic và tham gia cấu trúc màng tế bào Photpho thường được sử dụng ở hai dạng là H2PO4- và HPO42-
Khoáng vi lượng
Tuy chỉ cần một lượng rất nhỏ (dưới 0,5 mM) song nó có vai trò quan trọng trong đời sống thực vật Chúng tham gia vào các quá trình sinh hóa trong
tế bào, tăng tính chống chịu của thực vật với các điều kiện môi trường bất lợi Các vi lượng thông dụng là: Mn, B, Zn, Cu, Co, I
Carbon và nguồn năng lượng
Trong hầu hết các trường hợp thì mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tự tổng hợp carbon Do đó, các thành phần cacbonhydrat trong môi trường giữ vai trò quan trọng Nguồn cacbon bao gồm các loại đường sucrose, glucose hoặc fructose Trong đó, sucrose được sử dụng phổ biến hơn cả Sucrose được
bổ sung vào môi trường nuôi cấy để đẩy mạnh sự tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con
Nhưng không phải lúc nào hàm lượng đường cao cũng tốt cho mô nuôi cấy Chia (1988) kết luận rằng chính nồng độ đường thấp sẽ làm tăng tạo thể tiền chồi Trong một số trường hợp, đôi khi sự có mặt của đường lại không thuận lợi cho mô nuôi cấy
Vitamin
Vitamin là chất xúc tác quan trọng trong các phản ứng enzim Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô chủ yếu là myo-inositol, B3, B6, B1 Các vitamin thường dễ bị hỏng do nhiễm tảo nên cần giữ ở nhiệt độ dưới 00C Một số vitamin bổ sung là biotin, B3, vitamin C, B1, B6
1.5.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các chất kích thích sinh trưởng gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinine, ngoài ra gibberellin và ethylen và acid cũng có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao dổi chất ở thực vật.
Nhóm auxin
Trang 11Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA còn có các dẫn xuất của nó là naphtyl axetic acid (NAA) và 2,4 – diclophenoxy axetic acid (2,4-D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình tạo rễ NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA.
Nhóm cytokinine
Cytokinine rất cần thiết trong nuôi cấy mô (không tạo đột biến) cytokinine có một loại duy nhất trong tự nhiên là Zeatin Các loại tổng hợp nhân tạo Benzyladenine (BA), Kinetin… được dùng nhiều do rẻ tiền Chúng có tác dụng kích thích phân chia tế bào (phối hợp với auxins), kích thích tạo chồi.
Cytokinine là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Các cytokinine thường gặp là kinetin, BAP Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào
Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinine cao thì thích hợp cho hình thành rễ và thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi Nếu
tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo.
Nhóm gibberellin (GA 3 )
Gibberellin là một họ các hợp chất có hơn 70 loại khác nhau tất cả là dẫn xuất của Gibberellic acid Chất được sử dụng nhiều là GA3 và GA4+9 Gibberellin có tác dụng kích thích kéo dài chồi thân, kích thích hạt nảy mầm của phấn hoa và sự sinh trưởng của ống phấn và kích thích bật chồi (chồi ngủ) Gibberellin được tổng hợp trong lá non
Ethylene
Ethylene tham gia vào phản ứng của thực vật khi bị tổn thương Chúng được tổng hợp ở tất cả các tế bào của cây và gây ra hiện tượng rụng lá Ethylene làm giảm hình thành chồi bất định Tương tác với ethylene-binding protein