Nghiên cứu khoa học NHÂN GIỐNG lát HOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI cấy mô

NHÂN GIỐNG LÁT HOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hương,Văn Thu Huyền, Vũ Thị Ngọc, Trần Thanh Hương Trung tâm Nghiên cứu Giống rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Lát hoa (Chukrasia tabulais) loài gỗ có giá trị kinh tế cao Việt Nam Gỗ Lát hoa dùng để trang trí bề mặt cho nhiều loại đồ mộc bàn ghế, giường, tủ…cao cấp Nhân giống nuôi cấy mô kết cho thấy: Khử trùng mẫu sử dụng HgCl 1%, thời gian 15 phút cho tỷ lệ bật chồi cao đạt 60,37% Hệ số nhân chồi Lát hoa môi trường MWP cải tiến có bổ sung BAP 1,0mg/l cao đạt 6,45 6,48 chồi/cụm * Môi trường tạo rễ invitro thích hợp 1/2 MWP + IBA 1,0mg/l, tỷ lệ rễ đạt 93,33% Chồi nuôi cấy mô cao khoảng 5cm cắt chấm thuốc bột (TTG1) có gốc IBA 1,0 mg/l cho tỷ lệ rễ đạt 96,30% Thời gian rễ sau 15 - 20 ngày cấy giâm (mùa xuân - hè); 30 - 40 ngày giâm (mùa thu - đông) Từ khóa: Lát hoa, Nhân giống, Nuôi cấy mô ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam Chukrasia tabulais có tên gọi khác Lát hoa, Lát da, Lát chun Là loài phân bố rộng nước vùng Đông Nam Á Những nước có Lát hoa phân bố tự nhiên Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ (Pellegrin, 1908; Hooker, 1879; Phạm Hoàng Hộ, 1992; Association of Chinese Tree, 1978) Tại Việt Nam, Lát hoa tìm thấy số vùng Kon Hà Nừng, Nghệ An, Tuyên Quang, Lạng Sơn (Viện Điều tra Quy hoạch, 1990; Sách đỏ Việt Nam, 1996), thường độ cao 150800m Song đặc biệt độ cao 1450m vùng Sa Pa tìm thấy Lát hoa (Nguyễn Bá Chất, 1996) Trước Lát hoa có phân bố hầu hết tỉnh đến tận vùng Đông Nam Bộ song không xuất Lát hoa vùng Lát hoa rụng mùa đông, thời kỳ chín vào khoảng 11 đến 12 hàng năm Hạt Lát hoa nhỏ, mỏng Vì phát tán cách mẹ tới 120m, chủ yếu tập trung vùng từ 50-60m Cây chịu bóng giai đoạn 1-3 tháng tuổi sau chuyển thành ưa sáng Lát hoa phân bố rải rác có tỉ lệ khoảng 0,55-6,11% tự nhiên (Triệu Văn Hùng, 1993) bị khai thác triệt để Ngoài số lác đác lâm trường Chư Pa, Kon Nà Nừng (Gia Lai), hầu hết không sống rừng tự nhiên (Lê Đình Khả, 2003).Vì vậy, Lát hoa đưa vào sách đỏ Việt Nam (Bộ KHCN&MT 1996) Lát hoa Nhà nước công nhận loài cấu trồng nghành (Nghị định 18 HĐBT, 1992) loài trồng Chương trình 327 gần Chương trình trồng triệu rừng (giai đoạn từ 2000-2010) Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu Giống rừng thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam chọn, tạo nhân giống cho số giống rừng có suất, chất lượng cao Keo lai tự nhiên, Bạch đàn….Trong chương trình đề tài “nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, keo lai nhân tạo (mới chọn tạo) Lát hoa công nghệ tế bào”, phòng công nghệ Trung tâm thử nghiệm nhân giống cho số xuất xứ Lát hoa có khả sinh trưởng tốt để nhằm phát triển đưa nhanh giống vào sản xuất trồng rừng, bước đầu có kết tốt VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy chồi Lát hoa xuất xứ Việt Nam Thái Lan lấy từ vật liệu gốc năm tuổi vườn ươm Trung tâm Nghiên cứu Giống rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội Thời gian tiến hành thí nghiệm mùa năm Phương pháp nghiên cứu * Khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Tiến hành qua bước: - Rửa mẫu vật chất tẩy nhẹ, làm vòi nước chảy - Mẫu vật lau cồn 70o - Khử trùng Clorua thuỷ ngân (HgCl2), Canxi hypoclorit (Ca(OCl)2 ) Hyđro peroxit (H2O2 ) nồng độ khác từ 5-15 phút, sau tráng lại nước cất vô trùng 3-5 lần - Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu điều kiện vô trùng * Tạo nhân nhanh chồi - Tái sinh chồi ban đầu : Tiến hành cấy môi trường khác MS (Murashige Skoog Medium), MWP (McCown Woody Plant Medium), B5 (Micro-Macro Gamborg’s B5 medium) có bổ sung 7g/l agar-agar, 30g/l đường - Nhân chồi: sử dụng môi trường xác định từ thí nghiệm tái sinh chồi cải tiến thành phần, tỷ lệ chất đa lượng, vi lượng, có bổ sung axit amin; chất phụ gia; vitamin; số chất cytokinin BAP (Benzylaminopurine) Kn (Kinetin ) nồng độ khác 0,1; 0,5; 1,0; 1,5mg/l riêng rẽ phối hợp gọi môi trường cải tiến (MS*) * Quá trình tạo rễ: tiến hành theo phương pháp: - Ra rễ invitro: Chọn chồi đủ tiêu chuẩn cao 3cm chất lượng tốt cắt cấy sang môi trường tạo rễ, thành phần 1/2MS* có bổ sung IBA, NAA nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0mg/l - Ra rễ exsitu: Cũng từ chồi đủ tiêu chuẩn cấy rễ cắt chấm vào thuốc bột thương phẩm TTG1 (gốc IBA) TTG2 (gốc NAA) cấy trực tiếp cát hay vào bầu đất Các chồi thí nghiệm chăm sóc với giâm hom thông thường (Đoàn Thị Mai cs, 2003) * Đưa invitro vườn ươm: Vào loại giá thể cát bầu đất thời điểm khác năm Số liệu thu thập xử lý phương pháp phân tích phương sai theo chương trình phần mềm Excel (Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi, 1996) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng loại hoá chất thời gian khử trùng đến kết vào mẫu Mẫu vật khử trùng loại hoá chất HgCl 0,05% 0,1%, Ca(OCl)2 10% 20% khoảng thời gian 5, 10 15 phút Bảng Kết thí nghiệm khử trùng cho Lát hoa Tỷ lệ (%) Tỷ lệ bật chồi (%) Thời Hoá chất Trung gian Trung bình Sd Sd bình 22,48 1,04 5,56 1,18 HgCl2 0,05% 10 57,41 0,75 10,00 1,57 15 46,67 1,55 5,93 0,35 30,27 1,12 6,30 1,57 10 50,00 1,69 10,00 1,32 HgCl2 0,1% 15 60,37 1,37 20,37 1,45 20 77,11 1,50 7,78 1,08 10,00 1,86 3,33 0,98 Ca(OCl)2 10% 10 20,00 1,35 4,44 0,35 15 35,18 0,89 2,04 1,43 7,78 1,25 1,48 1,55 Ca(OCl)2 20% 10 20,00 1,80 4,07 1,76 15 28.89 1,34 3,70 1,86 Kết thí nghiệm cho thấy Lát hoa khử trùng HgCl 0,1% 15 phút cho hiệu tốt nhất, với tỷ lệ mẫu đạt 60,37% tỷ lệ mẫu bật chồi cao đạt 20,37% Khả tái sinh chồi Lát hoa Để đánh giá đánh giá khả nhân giống Lát hoa việc theo dõi khả tái sinh chồi sau trình khử trùng tiến hành Với kết thu loại hoá chất, nồng độ, thời gian khử trùng thích hợp từ thí nghiệm trước cho thấy hai dòng Lát hoa khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút phù hợp nhất, thí nghiệm tiến hành với lần lặp (30 mẫu/dòng/lần lặp) thể bảng sau Bảng Khả tái sinh chồi Lát hoa Tỷ lệ nhiễm (%) Đối tượng Lát Việt Nam (NA3) Tỷ lệ bật chồi (%) Trung bình Sd Trung bình Sd 37,78 1,86 20,74 1,85 Lát Thái Lan (TL3) 41,48 1,45 20,00 1,40 Kết thí nghiệm cho thấy tỷ lệ nhiễm trung bình NA3 37,78% thấp so với TL3 (41,48%) đồng thời tỷ lệ bật chồi 20,74% đạt tốt so với TL3 (20%) Hình Chồi Lát hoa tái sinh (4 - tháng sau vào mẫu) Xác định môi trường thích hợp cho đối tượng nghiên cứu Xác định môi trường nuôi cấy cho đối tượng nghiên cứu Thử nghiệm môi trường khác môi trường MS, B5 SH Kết cho thấy môi trường MWP môi trường thích hợp cho phát triển hai dòng Lát hoa Kết so sánh thể bảng Bảng Kết xác định môi trường cho Lát hoa MWP B5 MS Đối tượng Số chồi/cụm HSNC Lát Việt Nam 4,40 1,65 (NA3) Lát Thái Lan 4,80 1,80 (TL3) Ghi chú: HSNC: Hệ số nhân chồi SH Số chồi/cụm HSNC Số chồi/cụm HSNC Số chồi/cụm HSNC 2,80 1,58 2,10 1,45 3,20 1,12 3,10 1,75 2,60 1,53 3,01 1,03 Hình Chồi Lát hoa tái sinh sau 30 ngày cấy Xác định môi trường nhân chồi thích hợp cho đối tượng nghiên cứu Để xác định môi trường thích hợp cho dòng Lát hoa nghiên cứu, môi trường MWP bổ sung thêm BAP Kinetin nồng độ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l Số liệu thu thập tổng hợp bảng Bảng Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi Lát hoa Môi trường Lát Việt Nam (NA3) Lát Thái Lan (TL3) * MWP Số chồi/cụm Chiều dài cụm (cm) Trung Sd bình 3,24 0,76 5,44 1,22 Đối chứng BAP 0,5mg/l Trung bình 3,07 5,61 1,35 1,14 BAP 1,0mg/l 6,48 1,60 6,63 BAP 1,5mg/l 6,02 1,98 BAP 2,0mg/l 5,84 Kn 0,5mg/l Số chồi/cụm Chiều dài cụm (cm) Trung Sd bình 3,04 1,29 5,60 0,69 Trung bình 3,23 5,32 1,22 1,08 1,11 6,45 1,73 6,49 0,89 5,67 1,18 5,89 1,94 5,89 1,06 1,82 6,00 1,04 5,80 2,37 6,01 1,05 4,48 1,25 3,91 1,34 5,00 0,82 3,83 1,37 Kn 1,0mg/l 2,48 1,63 3,89 1,58 5,27 1,55 4,39 1,69 Kn 1,5mg/l 5,43 1,89 3,48 1,41 4,49 1,80 3,63 1,25 Kn 2,0mg/l 5,61 1,84 3,33 1,18 4,71 2,05 3,43 1,08 Sd Sd Hình Cụm chồi Lát hoa nuôi cấy môi trường nhân chồi Lát Thái Lan (TL3) Lát Việt Nam (NA3) Kết thí nghiệm cho thấy, BAP có tác dụng rõ lên trình tạo chồi chiều cao chồi so với đối chứng hay sử dụng chất kích thích sinh trưởng Kinetin Khi bổ sung BAP với nồng độ 1,0mg/l vào môi trường nuôi cấy số lượng chồi thu sau trình kích thích tạo chồi đạt từ 6,45 - 6,48 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt từ 6,49 - 6,63 cm Xác định môi trường rễ cho Lát hoa Môi trường sử dụng môi trường 1/2 MWP* bổ sung thêm chất kích thích IBA, NAA nồng độ khác Hình Chồi Lát hoa rễ Bảng Kết thí nghiệm rễ cho hai dòng Lát hoa Lát Việt Nam (NA3) Môi trường 1/2 MWP + Lát Thái Lan (TL3) Đối chứng IBA 0,5mg/l Tỷ lệ rễ (%) 38,52 59,31 IBA 1,0mg/l 93,33 5,83 4,70 89,63 5,95 4,90 IBA 1,5mg/l 88,15 5,72 3,05 80,00 5,35 3,60 Chiều dài rễ (cm) Số rễ/chồi Tỷ lệ rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Số rễ/chồi 3,38 5,42 2,00 3,40 35,56 63,70 3,55 5,67 1,80 3,20 IBA 2,0mg/l 71,85 5,65 3,40 68,69 5,10 3,50 NAA 0,5mg/l 48,15 4,22 2,70 50,37 4,29 3,00 NAA 1,0mg/l 51,11 4,33 2,40 57,03 4,53 2,80 NAA 1,5mg/l 61,48 3,95 2,90 66,67 4,23 3,00 NAA 2,0mg/l 57,04 3,58 2,20 56,30 3,56 2,20 Kết thí nghiệm cho thấy, hai dòng Lát hoa nghiên cứu IBA có tác dụng mạnh mẽ đến trình tạo rễ Tỷ lệ rễ hai dòng Lát hoa có bổ sung IBA đạt cao 59,31% 93,33%, sử dụng NAA để kích thích tạo rễ tỷ lệ đạt từ 48,15% - 66,67% * Từ số liệu thu thập cho thấy, môi trường 1/2MWP + IBA 1,0mg/l thích hợp cho trình tạo rễ nhân tạo cho hai dòng Lát hoa Nếu sử dụng môi trường 1/2MWP*+ IBA 1,5mg/l cho tỷ lệ rễ cao (80%-88,15%) Nhìn vào bảng kết môi trường 1/2MWP*+ IBA 1,0mg/l * môi trường 1/2MWP + IBA 1,5mg/l có khả kích thích chiều dài rễ tương đương Sự khác biệt lớn hai môi trường khả tạo số rễ/chồi Nếu môi * trường 1/2MWP + IBA 1,0mg/l cho số lượng rễ/chồi cao (4,7 - 4,9 rễ/chồi) môi trường 1/2MWP*+ IBA 1,5mg/l thấp nhiều (3,5 - 3,6 rễ/chồi) Như vậy, từ bảng số liệu ta kết luận môi trường thích hợp để tạo rễ cho hai dòng * Lát hoa nghiên cứu môi trường 1/2MWP + IBA 1,0mg/l Tuy nhiên, phương pháp có hạn chế thời gian rễ dài (45 ngày) Tạo rễ trực tiếp cho hai dòng Lát hoa chấm thuốc bột TTG Phương pháp tạo rễ trực tiếp phương pháp sử dụng chồi đủ tiêu chuẩn giai đoạn nhân chồi invitro đem xử lý chấm thuốc bột TTG có gốc IBA Với Lát hoa phương pháp cho kết bước đầu tốt Các chồi đủ tiêu chuẩn sau chấm thuốc cấy vào luống cát bầu đất vườn ươm chăm sóc phương pháp giâm hom bình thường Ưu điểm phương pháp rút ngắn thời gian nhân giống (mùa xuân - hè: 15-20 ngày, mùa thu đông: 30-40 ngày), tiết kiệm vật tư, công nhân giảm giá thành mà tạo số lượng lớn thời gian rễ ngắn nhiều so với phương pháp rễ lọ.Tuy nhiên, phương pháp phải thử nghiệm vài mùa vụ rễ để đạt hiệu cao Bảng Kết rễ trực tiếp phương pháp chấm thuốc bột TTG Lát Việt Nam (NA3) Lát Thái Lan (TL3) Nồng Tỷ lệ Hoá chất độ Chiều dài Số Tỷ lệ Chiều dài Số rễ (mg/l) rễ (cm) rễ/chồi rễ (%) rễ (cm) rễ/chồi (%) Đối chứng 42,22 3,66 2,39 40,00 3,89 2,16 0,5 72,59 5,44 3,59 76,60 5,53 3,50 TTG1 (gốc IBA) TTG2 (gốc NAA) 1,0 96,30 5,98 5,32 93,33 6,01 5,60 1,5 90,37 5,65 3,80 92,60 5,41 4,02 2,0 79,26 5,37 3,86 77,04 5,18 3,81 0,5 61,48 4,48 3,05 64,44 5,08 3,34 1,0 72,60 4,03 3,05 71,11 4,45 3,07 1,5 76,30 4,41 3,25 75,60 4,71 3,27 2,0 63,00 3,74 2,61 45,93 4,34 2,59 Qua bảng cho thấy rễ trực tiếp cách chấm thuốc bột TTG có gốc IBA cho kết cao nhiều so với công thức khác Ra rễ trực tiếp chấm thuốc TTG gốc IBA 1,0mg/l cho tỷ lệ rễ cao đạt 93,33% - 96,30% Kết thí nghiệm cho thấy thuốc bột TTG gốc IBA 1,0mg/l có khả kích thích chồi rễ cao, thích hợp cho hai dòng Lát hoa nghiên cứu Đây coi hướng nghiên để tạo chất lượng cao với giá thành rẻ Hình Cây Lát hoa vườn ươm KẾT LUẬN - Đã xác định kỹ thuật khử trùng tạo mẫu thích hợp cho dòng Lát hoa (NA3 TL3): Sử dụng chất HgCl nồng độ 1% khử trùng 15 phút với tỷ lệ mẫu 60,37% * - Đã xác định môi trường nhân chồi thích hợp cho dòng Lát hoa (NA3 TL3) MWP + 1,0mg/l BAP với tỷ lệ 6,45 - 6,48 chồi/cụm sau 20 ngày - Đã xác định phương pháp tạo rễ cho chồi Lát hoa invitro * +Môi trường tạo rễ invitro thích hợp 1/2 MWP + 1,0mg/l IBA có tỷ lệ đạt chồi rễ đạt 93,33% (NA3) 89,63% (TL3) sau 20-30 ngày cấy +Sử dụng thuốc bột TTG có gốc IBA 1,0 mg/l cho hiệu rễ trực tiép thích hợp nhất, với tỷ lệ chồi rễ đạt 96,30% (NA3) 93,33% (TL3) sau 15-20 ngày cấy giâm (mùa xuân – hè); 30-40 ngày giâm (mùa thu – đông) TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Đình Khả, Đoàn Thị Mai, 2002 Một số phương thức nhân giống sinh dưỡng sản xuất lâm nghiệp Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp,(5), trang 23 – 24 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999 Nhân giống vô tính trồng rừng dòng vô tính, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Quang Thạch, 1996 Công nghệ sinh học thực vật NXB trường ĐH Nông nghiệp I Đoàn Thị Mai, 2001 Nhân giống cho số giống rừng suất cao Hội nghị CNSH toàn quốc trang Đoàn Thị Mai, Trần Hồ Quang, Ngô Thị Minh Duyên, 1998 Kỹ thuật nhân giống Keo lai nuôi cấy mô phân sinh Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, số 7, trang 35-36 Nguyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hải Tuân, Ngô Kim Khôi, 1996 Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp máy vi tính NXB Nông nghiệp Propagation of Chukrasia species by tissue culture Doan Thi Mai, Nguyen Thi My Huong, Van Thu Huyen, Vu Thi Ngoc, Tran Thanh Huong Research Centre for Forest Tree Improvement Forest Science Institute of Viet Nam SUMMARY Chukrasia is one of the most important commercial tree species in Vietnam It is used for various purposes Plant tissue culture can be applied to quickly propagate selected Chukrasia species The suitable sterilization method is 1% HgCl2 for 15 minutes The suitable medium for shoot formation is MWP with 1,0 mg/l BAP The rooting medium is 1/2MWP with 1,0mg/l IBA Rooting directly by rooting powder (TTG1) is an effective method for Chukrasia Key words: Chukrasia, Propagation, Tissue culture ... Duyên, 1998 Kỹ thuật nhân giống Keo lai nuôi cấy mô phân sinh Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, số 7, trang 35-36 Nguyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng NXB Nông... Hình Chồi Lát hoa tái sinh (4 - tháng sau vào mẫu) Xác định môi trường thích hợp cho đối tượng nghiên cứu Xác định môi trường nuôi cấy cho đối tượng nghiên cứu Thử nghiệm môi trường khác môi trường... Chồi Lát hoa tái sinh sau 30 ngày cấy Xác định môi trường nhân chồi thích hợp cho đối tượng nghiên cứu Để xác định môi trường thích hợp cho dòng Lát hoa nghiên cứu, môi trường MWP bổ sung thêm BAP