cải tiến quy trình nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô

báo cáo về cải tiến quy trình nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chủ nhiệm đề tài: ThS HUỲNH TRƯỜNG HUÊ Long Xuyên, tháng 10 năm 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chủ nhiệm đề tài: ThS HUỲNH TRƯỜNG HUÊ Long Xuyên, tháng 10 năm 2009 CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TĨM LƯỢC Đề tài: “Cải tiến qui trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) phương pháp nuôi cấy mô” thực nhằm để tạo nguồn gừng giống in-vitro, khảo sát nồng độ kích thích tố tối ưu cho việc nhân giống gừng xây dựng qui trình nhân giống gừng điều kiện in vitro Đề tài thực với thí nghiệm, kết đạt sau: - Xử lý khử trùng mẫu với hóa chất Ca(OCl)2 đạt hiệu khử trùng cao nhất, cho kết mẫu sống vô trùng cao (70%) thời gian 25-30 phút nồng độ 10% - Nhân chồi với kích thích tố BA bổ sung vào mơi trường MS nồng độ mg.l-1, chồi gừng tăng trưởng phát triển nhanh - Kích thích tạo rễ nồng độ mg.l-1 NAA môi trường MS, chồi gừng có số rễ chiều dài rễ cao - Tạo hồn chỉnh với kích thích tố BA-NAA bổ sung vào môi trường MS nồng độ 2-0,5 mg.l-1 1-1mg.l-1, có hệ thống rễ chồi phát triển tốt Sau đó, hóa điều kiện nhà lưới đạt tỷ lệ sống 90% Từ kết thí nghiệm, xây dựng quy trình nhân giống gừng phương pháp ni cấy mơ i MỤC LỤC Nội dung Tóm lược ……………………………………………………………………… Mục lục ……………………………………………………………………… Danh sách bảng ……………………………………………………………… Danh sách hình ……………………………………………………………… Danh sách phụ chương ……………………………………………………… Chương I MỞ ĐẦU ………………………………………………………… A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU …………………………………………… I MỤC TIÊU ………………………………………………………………………………… II NỘI DUNG ………………………………………………………………………………… B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU …………………………………………… I ĐỐI TƯỢNG ………………………………………………………………………………… II PHẠM VI NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………… C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………… I CƠ SỞ LÝ LUẬN …………………………………………………………………………… Phân loại …………………………………………………………………… Nguồn gốc phân bố ………………………………………………………… Đặc tính sinh học …………………………………………………………… Bệnh hại củ gừng ……………………………………………………… Công dụng ………………………………………………………………… Các phương pháp nhân giống gừng …………………………………… Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ thực vật ……………… 7.1 Chọn lựa mẫu cấy ……………………………………………………… 7.2 Khử trùng mẫu cấy …………………………………………………… 7.3 Môi trường nuôi cấy …………………………………………………… 7.4 Chất điều hòa sinh trưởng ……………………………………………… 7.5 Điều kiện nuôi cấy …………………………………………………… II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………………………… Phương tiện nghiên cứu …………………………………………………… 1.1 Vật liệu ………………………………………………………………… 1.2 Địa điểm thực …………………………………………………… 1.3 Dụng cụ hóa chất …………………………………………………… Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………… 2.1 Môi trường nuôi cấy ………………………………………………… 2.2 Chuẩn bị mẫu cấy …………………………………………………… 2.3 Cách khử mẫu ni cấy …………………………………………… 2.4 Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………… 2.4.1 Khử mẫu ………………………………………………………… 2.4.2 Nhân chồi ………………………………………………………… 2.4.3 Tạo rễ …………………………………………………………… 2.4.4 Tạo hoàn chỉnh … ………………………………………… 2.4.5 Chuyển vườn ươm ………………………………………… 2.5 Phân tích số liệu ……………………………………………………… Chương II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ …… I KHỬ MẪU ………………………………………………………………………………… Hypocanxiclorua [Ca(OCl)2] ……………………………………………… Hyposodiumchlorua (NaOCl – Javen) ……………………………………… Trang i ii iv v vi 1 1 2 2 2 2 3 4 5 6 6 6 7 7 7 8 10 10 11 11 11 12 ii II NHÂN CHỒI ……………………………………………………………………………… III TẠO RỄ …………………………………………………………………………………… IV TẠO CÂY ………………………………………………………………………………… KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………………… A KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………… B ĐẾ NGHỊ …………………………………………………………………………………… Tài liệu tham khảo …………………………………………………………… 13 15 19 28 28 29 30 iii DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1: Nồng độ thời gian chất khử mẫu Ca(OCl)2 Javen ………… Bảng 2: Nồng độ kích thích tố BA NAA bổ sung vào môi trường MS …… Bảng 3: Ảnh hưởng nồng độ Ca(OCl)2 thời gian khử trùng lên mẫu cấy Bảng 4: Ảnh hưởng tỷ lệ dung dịch Javen thời gian khử trùng lên mẫu cấy …………………………………………………………………… Bảng 5: Sự tăng trưởng chồi gừng thời điểm tuần sau cấy … Bảng 6: Sự phát triển rễ thời điểm tuần, tuần tuần sau cấy Bảng 7: Ảnh hưởng kích thích tố BA NAA lên trình sinh trưởng chồi gừng thời điểm tuần SKC ……………………………… Bảng 8: Ảnh hưởng kích thích tố BA NAA lên trình sinh trưởng chồi gừng thời điểm tuần SKC ……………………………… 11 12 14 16 20 21 iv DANH SÁCH HÌNH Tên hình Trang Mẫu sống vô trùng sau tuần nuôi cấy ……………………………… Chồi gừng bổ sung BA mg.l-1 giai đoạn tuần sau cấy ……… Chồi gừng bổ sung BA mg.l-1 giai đoạn tuần sau cấy Tăng trưởng rễ nghiệm thức đối chứng tuần SKC Tăng trưởng rễ bổ sung 0,5 mg.l-1 NAA giai đoạn tuần SKC Hình 6: Tăng trưởng rễ bổ sung mg.l-1 NAA giai đoạn tuần SKC Hình 7: Tăng trưởng rễ bổ sung 2,5 mg.l-1 NAA giai đoạn tuần SKC ………………………………………………………………… Hình 8: Tăng trưởng rễ bổ sung mg.l-1 NAA giai đoạn tuần SKC Hình 9: Chồi gừng bổ sung mg.l-1 NAA giai đoạn tuần SKC …………… Hình 10: Tăng trưởng chồi gừng giai đoạn tuần SKC …………………… Hình 11: Chồi gừng bổ sung 2-0,5 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn tuần sau cấy…………………………………………………………………… Hình 12: Chồi gừng bổ sung 2-05 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn tuần sau cấy Hình 13: Chồi gừng bổ sung 2-05 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn tuần sau cấy so với đối chứng………………………………………… Hình 14: Chồi gừng bổ sung 1-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn tuần sau cấy Hình 15: Cây gừng bổ sung 0,5-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn tuần sau cấy Hình 16: Cây gừng bổ sung 2-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn tuần sau cấy Hình 17: Cây gừng in-vitro trồng ươm điều kiện nhà lưới ……………… Hình 18: Cây gừng sau tuần trồng ươm điều kiện nhà lưới …………… Hình 19: Cây gừng sau tuần trồng bầu điều kiện nhà lưới ……… 13 15 15 17 Hình 1: Hình 2: Hình 3: Hình 4: Hình 5: 17 18 18 18 18 19 22 23 23 24 24 25 25 26 26 v PHỤ CHƯƠNG Tên phụ chương Phụ chương 1: ANOVA số chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 2: ANOVA số chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 3: ANOVA số thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 4: ANOVA số thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 5: ANOVA cao chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 6: ANOVA cao chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 7: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC … Phụ chương 8: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC … Phụ chương 9: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC … Phụ chương 10: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Phụ chương 11: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Phụ chương 12: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Phụ chương 13: ANOVA số chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 14: ANOVA số chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 15: ANOVA số thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Phụ chương 16: ANOVA số thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Phụ chương 17: ANOVA cao chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 18: ANOVA cao chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC …………………………………………………………… Phụ chương 19: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Phụ chương 20: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Phụ chương 21: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Phụ chương 22: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Trang 32 32 32 32 32 33 33 33 33 33 34 34 34 34 34 35 35 35 35 35 36 36 vi Danh mục từ viết tắt BA: Benzyladenine NAA: α-Naphtalenacetic acid Kn: Kinetin GA: Gibberellic Acid MS: Murashige Skoog SKC: sau cấy w/v: trọng lượng/thể tích v/v: thể tích/thể tích 7.2 Khử trùng mẫu cấy Trong nuôi cấy mô, khử trùng mẫu khâu quan trọng nhất, chúng tạo nguồn mẫu in-vitro ban đầu Mục đích khử trùng mẫu loại hết vi sinh vật gây nhiễm mẫu bám mẫu, nhằm tạo lượng mẫu sống vô trùng cao cho nuôi cấy Khử trùng mẫu cấy thường sử dụng hoá chất có khả tiêu diệt vi sinh vật như: calcium hypochlorite [Ca(ClO)2], thủy ngân clorua (HgCl2), Chloramin B, sodium hypochlorite (NaOCl – nước Javen), oxy già (H2O2), nước Brome, chất kháng sinh… Trong đó, Ca(ClO)2, NaOCl sử dụng nhiều chúng có độc tính thấp mơ cấy an tồn cho người sử dụng, khơng gây ức chế sinh trưởng hiệu diệt khuẩn tốt, mà giá thành lại rẻ Tuy nhiên, khả diệt khuẩn hóa chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ xử lý mức độ xâm nhập vi sinh vật bề mặt mô cấy (Vũ Văn Vụ ctv., 2007) 7.3 Môi trường nuôi cấy Môi trường ni cấy giữ vai trị quan trọng thành công nuôi cấy mô Các thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm: nước, muối khoáng (đa lượng vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, chất làm đặc mơi trường (agar) chất điều hịa sinh trưởng thực vật Thành phần môi trường nuôi cấy mơ thực vật thay đổi tùy theo lồi, tùy theo phận nuôi cấy, tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển mẫu cấy (Vũ Văn Vụ ctv., 2005) Các loại môi trường sử dụng nuôi cấy mô thực vật như: môi trường MS (Murashige Skoog), môi trường White, Knop B5 Gamborg… Trong đó, mơi trường White, Knop mơi trường nghèo dinh dưỡng; môi trường B5 Gamborg môi trường có hàm lượng dinh dưỡng trung bình; cịn mơi trường MS môi trường giàu dinh dưỡng Môi trường MS sử dụng phổ biến nuôi cấy mô, phù hợp với nhiều đối tượng nuôi cấy sử dụng nhiều trường hợp nuôi cấy 7.4 Chất điều hòa sinh trưởng Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật giữ vai trò quan trọng việc điều chỉnh trình sinh trưởng, phát triển hoạt động sinh lý thực vật Chúng hoạt động nồng độ liều lượng thấp, kích thích ức chế hoạt động sinh lý thực vật Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bao gồm chất điều hòa sinh trưởng tự nhiên chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp Benzyladenine (BA) Thidiazuron (TDZ) thuộc nhóm cytokinin tổng hợp; α– naphtalenacetic acid (NAA) acid 2,4 – diclorophenoxyacetic (2,4D) thuộc nhóm auxin tổng hợp chất sử dụng phổ biến kỹ thuật vi nhân giống, giữ vai trò quan trọng trình phát sinh hình thái thực vật in vitro, có hiệu tác động phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có chất, mẫu ni cấy (Vũ Văn Vụ ctv., 2005; Võ Thị Bạch Mai, 2004) Trong nuôi cấy mô thực vật, auxin cytokinin có vai trị quan trọng phân chia kéo dài tế bào Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, auxin giúp thúc đẩy sinh trưởng giãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính Auxin kích thích tạo rễ nồng độ thấp, cịn nồng độ cao ức chế thành lập rễ thay vào tạo thành mô sẹo Nồng độ auxin môi trường tạo rễ thường 0,5 – 3,0 mg.l-1 NAA IBA Cytokinin kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, hình thành Khi kết hợp auxin cytokinin tăng hoạt tính hoạt động chúng, kích thích tăng trưởng thành lập chồi Đối với phát triển chồi, auxin kích thích sinh trưởng chồi non khởi phát mô phân sinh chồi từ nhu mô sử dụng phối hợp với cytokinin (chẳng hạn NAA kết hợp với BA) (Bùi Trang Việt, 2000; Nguyễn Như Khanh, 2007) Khi phối hợp với cytokinin để nhân chồi, nồng độ auxin thường dùng 0,1 – 1,0 mg.l-1 (Bùi Bá Bổng, 1995) Tỷ lệ auxin cytokinin định kết phát sinh hình thái mơ ni cấy in vitro nguyên vẹn Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao kích thích hình thành rễ, ngược lại auxin/cytokinin thấp dẫn đến xuất phát triển chồi Tỷ lệ cân đối auxin cytokinin cho phép tạo hoàn chỉnh (rễ, thân, lá) Tỷ lệ thay đổi tuỳ theo đối tượng nuôi cấy loại mô nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000; Vũ Văn Vụ ctv., 2005; Võ Thị Bạch Mai, 2004) 7.5 Điều kiện nuôi cấy Sự nuôi cấy phải đặt điều kiện ổn định ánh sáng nhiệt độ Yêu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển cho đối tượng nuôi cấy không giống Nhiệt độ thấp thấp sử dụng để làm chậm hay làm ngừng hẳn sinh trưởng mẫu ni cấy Nhiệt độ phịng nuôi cấy thường giữ ổn định máy điều hồ nhiệt độ suốt thời gian ni cấy Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy, bao gồm cường độ, chu kỳ thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng 100 – 2500 lux dùng phổ biến nuôi cấy nhiều loại mô Theo Murashige (1977) cường độ ánh sáng cao chồi sinh trưởng chậm lại, thúc đẩy trình tạo rễ Ánh sáng tham gia vào phát triển phôi soma Ánh sáng cường độ cao gây nên sinh trưởng mơ sẹo, cường độ trung bình kích thích tạo chồi cường độ thấp làm gia tăng chiều cao chồi làm chồi có màu xanh đậm (trích dẫn từ Vũ Văn Vụ ctv., 2007) II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu 1.1 Vật liệu: giống gừng tàu (Zingiber officinale Rosc.) 1.2 Địa điểm thực hiện: Đề tài thực phịng ni cấy mơ trường Đại học An Giang 1.3 Dụng cụ hóa chất * Dụng cụ: Keo, nồi trùng, microwave, tủ cấy, thước đo, đồng hồ báo thời gian, giấy nhôm, buồng nuôi cây, vật dụng khác… * Hóa chất: khống đa lượng, khống vi lượng, chất điều hòa sinh trưởng (BA NAA), chất khử [Ca(OCl)2 NaOCl (Javen)]… Phương pháp nghiên cứu 2.1 Môi trường nuôi cấy Môi trường (MS) gồm có khống đa vi lượng theo Murashige-Shoog (1962), vitamin theo Morel (1951), đường (20 g.l-1), nước dừa (100 ml.l-1), agar (8 g.l-1) Các điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường pH môi trường 5,8 Các keo chứa 50 ml môi trường hấp khử trùng nhiệt độ 1210C 30 phút 2.2 Chuẩn bị mẫu cấy Chọn củ gừng giống già, phía đỉnh sinh trưởng củ gừng có eo thắt lại Xử lý gừng giống với thuốc phòng bệnh (Validacine, Topsin…) Ủ hom gừng tro trấu xử lý điều kiện cách ly, để hom gừng nẩy mầm tốt hạn chế nấm bệnh Thời gian ủ thường 15 ngày 2.3 Cách khử mẫu nuôi cấy Tách lấy củ gừng non từ củ mẹ, tách bỏ lớp bẹ lá, vảy bao quanh củ vòi nước chảy Rửa củ nhiều lần, ngâm nước xà phòng 10-15 phút; rửa lại nhiều lần vịi nước chảy Sau ngâm củ cồn 700 phút Rửa lại với nước cất vô trùng lần Tiếp theo cho mẫu vào ngâm dung dịch khử trùng Ca(OCl)2 NaOCl (Javen) với nồng độ thời gian tương ứng, sau rửa lại mẫu nhiều lần với nước cất vô trùng Dùng dao mổ tiệt trùng cắt bỏ phần mô bi tổn thương khử trùng Dùng kẹp chuyển mẫu vào keo có chứa mơi trường, bình mẫu Các keo ni mẫu đặt phịng ni cấy có nhiệt độ từ 25-280C với cường độ ánh sáng 3000-4000 lux chu kỳ quang 12 giờ.ngày-1 2.4 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, gồm thí nghiệm sau: 2.4.1 Khử mẫu Các mẫu khử trùng với dung dịch khử hypocanxiclorua [Ca(OCl)2] hyposodiumchlorua (NaOCl – Javen) tương ứng với nồng độ thời gian khác sau: phút * Ca(OCl)2: mức nồng độ 5% 10% (w/v) với thời gian 10, 15, 20, 25, 30 * NaOCl: tỷ lệ Javen với nước cất 1:2; 1:1; 2:1 (v/v) thời gian 10, 15, 20, 25, 30 phút Bảng 1: Nồng độ thời gian chất khử mẫu Ca(OCl)2 NaOCl Thời gian (phút) Ca(OCl)2 NaOCl 5% 10% 1:2 1:1 2:1 10 C1-1 C2-1 J1-1 J2-1 J3-1 15 C1-2 C2-2 J1-2 J2-2 J3-2 20 C1-3 C2-3 J1-3 J2-3 J3-3 25 C1-4 C2-4 J1-4 J2-4 J3-4 30 C1-5 C2-5 J1-5 J2-5 J3-5 Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với 10 lần lập lại, lần lập lại mẫu Chỉ tiêu theo dõi: quan sát tỷ lệ mẫu sống, không bị nhiễm phát triển tốt, tỷ lệ mẫu chết tỷ lệ mẫu nhiễm sau tuần nuôi cấy Sau khảo sát nồng độ thời gian tối ưu chất khử trùng mẫu, mẫu khử trùng nuôi cấy môi trường MS để tạo nguồn mẫu in-vitro Các chồi phát triển môi trường nuôi cấy tách ra, cắt bỏ rễ khoảng cm, cấy vào mơi trường thí nghiệm nhân chồi tạo hoàn chỉnh 2.4.2 Nhân chồi: Khảo sát nồng độ kích thích tố BA cho việc nhân chồi, gồm nghiệm thức sau: A0 : MS (đối chứng) A0,5 : MS + BA (0,5 mg.l-1) A1 : MS + BA (1 mg.l-1) A1,5 : MS + BA (1,5 mg.l-1) A2 : MS + BA (2 mg.l-1) A2,5 : MS + BA (2,5 mg.l-1) A3 : MS + BA (3 mg.l-1) Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với lần lập lại, lần lập lại keo, keo mẫu Chỉ tiêu theo dõi: - Chiều cao (mm): đo từ môi trường đến chớp cao - Số lá: đếm số chồi - Số chồi: đếm số chồi phát sinh Các tiêu theo dõi tuần, tuần ni cấy Chọn chồi gừng có từ 3-4 từ thí nghiệm nhân chồi sau tuần ni cấy, cắt bỏ rễ cấy vào mơi trường thí nghiệm tạo rễ 2.4.3 Tạo rễ: Khảo sát nồng độ kích thích tố NAA cho việc tạo rễ, gồm nghiệm thức sau: B0 B0,5 B1 B1,5 B2 B2,5 B3 B4 B5 : : : : : : : : : MS (đối chứng) MS + NAA (0,5 mg.l-1) MS + NAA (1 mg.l-1) MS + NAA (1,5 mg.l-1) MS + NAA (2 mg.l-1) MS + NAA (2,5 mg.l-1) MS + NAA (3 mg.l-1) MS + NAA (4 mg.l-1) MS + NAA (5 mg.l-1) Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lập lại, lần lập lại keo, keo mẫu Chỉ tiêu theo dõi: - Số rễ: đếm số rễ phát sinh - Chiều dài rễ (mm): đo rễ dài Các tiêu theo dõi tuần, tuần ni cấy 2.4.4 Tạo hồn chỉnh: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ kích thích tố BA NAA lên việc tạo hoàn chỉnh, gồm nghiệm thức sau (Bảng 2): Bảng 2: Nồng độ kích thích tố BA NAA bổ sung vào mơi trường MS Nghiệm thức T0 (ĐC) T1 (0,5/05) T2 (1/0,5) T3 (1,5/0,5) T4 (2/0,5) T5 (2,5/0,5) T6 (3/0,5) T7 (0,5/1) T8 (1/1) T9 (1,5/1) T10 (2/1) T11 (2,5/1) T12 (3/1) MS + BA + NAA BA (mg.l-1) NAA (mg.l-1) 0 0,5 0,5 0,5 1,5 0,5 0,5 2,5 0,5 0,5 0,5 1 1,5 2,5 Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lập lại, lần lập lại keo, keo mẫu Chỉ tiêu theo dõi: - Chiều cao (mm): đo từ môi trường đến chớp cao - Số lá: đếm số chồi - Số chồi: đếm số chồi phát sinh - Số rễ: đếm số rễ phát sinh - Chiều dài rễ (mm): đo rễ dài Các tiêu theo dõi tuần, tuần nuôi cấy 2.4.5 Chuyển vườn ươm Cây sau ni cấy thí nghiệm tạo rễ tạo hoàn chuyển vườn ươm Các trồng khay ươm có tỷ lệ đất phân rác oai mục 1:1 Phân rác phơi nắng khơ để tiêu diệt mầm bệnh, sau trộn với đất cho đầy lên lổ khay Các trồng khay theo dõi khả sống điều kiện nhà lưới sau tuần trồng ươm 2.5 Phân tích số liệu Số liệu lưu trữ Excel dùng phần mềm MSTATC để phân tích thống kê 10 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A KẾT LUẬN - Xử lý khử trùng mẫu với hóa chất Ca(OCl)2 đạt hiệu khử trùng cao nhất, cho kết mẫu sống vô trùng cao (70%) thời gian 25-30 phút nồng độ 10% - Nhân chồi với kích thích tố BA nồng độ mg.l-1, chồi gừng tăng trưởng phát triển nhanh - Kích thích tạo rễ nồng độ mg.l-1 NAA, chồi gừng có số rễ chiều dài rễ cao - Tạo hoàn chỉnh với kích thích tố BA-NAA nồng độ 2-0,5 mg.l-1 1-1mg.l-1, có hệ thống rễ chồi phát triển tốt - Thuần hóa điều kiện nhà lưới đạt tỷ lệ sống 90% Qua kết đạt được, qui trình nhân giống gừng cải tiến sau: Củ gừng giống Ủ hom (2 tuần) Củ gừng non Khử trùng Ca(OCl)2 10% 25-30 phút Môi trường MS Nguồn mẫu in-vitro Nhân chồi Tạo BA mg.l-1 BA-NAA 2-0,5 mg.l-1 1-1 mg.l-1 Tạo rễ NAA mg.l-1 Ươm 27 B Đề NGHỊ - Khảo sát ảnh hưởng tương tác loại kích thích tố khác nhóm auxin cytokinin việc nhân chồi gừng, nhằm tìm loại kích thích tối ưu cho nhân giống gừng in-vitro - Trồng đồng để khảo sát suất gừng ni cấy mơ, từ làm sở để so sánh với suất gừng trồng củ 28 PHỤ CHƯƠNG Phụ chương 1: ANOVA số chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.615 0.102 1.022 0.4246 Within 42 4.213 0.100 Total 48 4.828 Phụ chương 2: ANOVA số chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.485 0.247 1.679 0.1500 Within 42 6.190 0.147 Total 48 7.675 Phụ chương 3: ANOVA số thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.059 0.010 0.423 Within 42 0.982 0.023 Total 48 1.042 Phụ chương 4: ANOVA số thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.197 0.033 0.760 Within 42 1.817 0.043 Total 48 2.014 Phụ chương 5: ANOVA cao chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 291.964 48.661 0.841 Within 42 2430.375 57.866 Total 48 2722.339 32 Phụ chương 6: ANOVA cao chồi thí nghiệm nhân chồi thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2027.396 337.899 3.194 0.0113 Within 42 4442.711 105.779 Total 48 6470.107 Phụ chương 7: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4.011 0.501 3.820 0.0013 Within 54 7.088 0.131 Total 62 11.099 Phụ chương 8: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 540.853 67.607 17.618 0.0000 Within 54 207.219 3.837 Total 62 748.072 Phụ chương 9: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 188.671 23.584 2.189 0.0427 Within 54 581.776 10.774 Total 62 770.448 Phụ chương 10: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 53.861 6.733 31.741 0.0000 Within 54 11.454 0.212 Total 62 65.315 33 Phụ chương 11: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4726.162 590.770 17.077 0.0000 Within 54 1868.125 34.595 Total 62 6594.288 Phụ chương 12: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo rễ thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2352.484 294.060 2.843 0.0104 Within 54 5585.387 103.433 Total 62 7937.871 Phụ chương 13: ANOVA số chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 1.095 0.091 2.256 0.0165 Within 78 3.155 0.040 Total 90 4.249 Phụ chương 14: ANOVA số chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 2.002 0.167 2.634 0.0052 Within 78 4.941 0.063 Total 90 6.943 Phụ chương 15: ANOVA số thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 1.003 0.084 2.884 0.0024 Within 78 2.261 0.029 Total 90 3.264 34 Phụ chương 16: ANOVA số thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 55.602 4.633 6.884 0.0000 Within 78 52.499 0.673 Total 90 108.101 Phụ chương 17: ANOVA cao chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 3182.182 265.182 5.349 0.0000 Within 78 3866.987 49.577 Total 90 7049.169 Phụ chương 18: ANOVA cao chồi thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 8265.669 688.806 5.812 0.0000 Within 78 9243.438 118.506 Total 90 17509.108 Phụ chương 19: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 7.595 0.633 7.805 0.0000 Within 78 6.325 0.081 Total 90 13.920 Phụ chương 20: ANOVA số rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 2142.942 178.578 6.825 0.0000 Within 78 2040.881 26.165 Total 90 4183.823 35 Phụ chương 21: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 121.240 10.103 14.024 0.0000 Within 78 56.195 0.720 Total 90 177.435 Phụ chương 22: ANOVA dài rễ thí nghiệm tạo thời điểm tuần SKC Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 12 3947.363 328.947 1.601 0.1086 Within 78 16025.907 205.460 Total 90 19973.270 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Balachandran, S N, Bhat, S R and Chandel, K P S 1990 “In vitro clonal multiplication of turmeric (Curcuma spp.) and ginger (Zingiber officinales Rosc.)” Plant Cell Rep 8: 521-524 Bùi Bá Bổng 1995 Nhân giống nuôi cấy mô An Giang: Khoa học Công nghệ Môi trường An Giang Bùi Trang Việt 2000 Sinh lý thực vật đại cương (phần II: phát triển) Tp Hồ Chí Minh: NXB Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Chi cục bảo vệ thực vật An Giang 1998 Sổ tay cho nhà kinh doanh thuốc bảo vệ thực vật An Giang Chu Hữu Tín 2006 Gừng – Lương thực dược liệu [trực tuyến] Đọc từ: http://www.khoahoc.net/baivo/chuhuutin/071206-gung.htm Danh Giàu 2003 Nghiên cứu mơi trường thích hợp phịng thí nghiệm giá thể thích hợp ngồi vườn ươm để nâng cao sinh trưởng, phát triển tỷ lệ sống giống sả gừng Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Tp HCM Dương Công Kiên 2002 Ni cấy mơ thực vật Thành phố Hồ Chí Minh: Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Hosoki, T and Sagawa, Y 1977 “Clonal propagation of ginger (Zingiber officinales Rosc.) through tissue culture” Hort Sci 12: 451-452 Huỳnh Thiện Tiến 2006 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên phát triển chồi Dó Bầu (Aquilaria crassna Pierre) Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học Khoa Nông nghiệp – TNTN, Đại học An Giang Lã Đình Mỡi, Dương Đức Huyên Nguyễn Tiến Bân 2002 Cây gừng – Tài nguyên thực vật Đông Nam Á Số 5-2002: 3-15 Lâm Ngọc Phương 1997 “Nhân giống vơ tính gừng (Zingiber officinale Rosc.) phương pháp nuôi cấy mô” Tuyển tập công trình khoa học cơng nghệ 19931997: 363-367 Đại Học Cần Thơ Lê Trần Như Thảo 2005 Nhân giống gừng phương pháp in-vitro Luận văn tốt nghiệp Đại học dân lập Văn Lang Mai Văn Quyền, Lê Thị Việt Nhi, Ngơ Quang Vinh, Nguyễn Thị Hịa Nguyễn Tuấn Kiệt 2001 Những rau gia vị phổ biến Việt Nam Tp HCM: NXB Nông Nghiệp Nguyễn Bá Linh 2006 Điều tra trạng canh tác gừng huyện Chợ Mới tỉnh An Giang năm 2005-2006 Luận văn tốt nghiệp Khoa Nông Nghiệp – TNTN, Đại học An Giang Nguyễn Minh Trang 2008 Nhân giống in-vitro lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học Khoa Nông Nghiệp – TNTN, Đại học An Giang Nguyễn Ngọc Bình Phạm Đức Tuấn 2001 Trồng nơng nghiệp, dược liệu đặc sản tán rừng Hà Nội: NXB Nông nghiệp 30 Nguyễn Như Khanh 2007 Sinh học phát triển thực vật Hà Nội: NXB Giáo dục Nguyễn Phú Dũng 2008 Hiện trạng canh tác ảnh hưởng nấm Tricoderma loại vật liệu chứa đất trồng lên sinh trưởng, sâu bệnh hại gừng xã Mỹ An, Chợ Mới, An Ging 2006-2007 Nghiên cứu khoa học Đại học An Giang Ravindran, P N and Nirmal Babu, K 2005 Ginger: The genus Zingiber CRC Press Rout, G R, Palai, S K, and Das, P 2001a Onset of in-vitro rhizogeneis reponse and peroxidase activity in Zingiber officinale (Zingiberaceae) Rev biol Trop 49: 34 Rout, G R, Palai, S K, Samantaray, S and Das, P 2001b Effect of growth regulation and culture conditions on shoot multiplication and rhizome formation in ginger (Zingiber officinale Rosc.) in-vitro Dev Biol Plant 37:814-819 Sharma, R T and Singh, B M 1997 High-frequency in-vitro multiplication of diseasefree Zingiber officinale Rosc Plant cell reports 17:68-72 Trần Văn Hòa, Hứa Văn Chung, Trần Văn Hai, Dương Minh Phạm Hoàng Oanh 2000 101 câu hỏi thường gặp sản xuất nông nghiệp, tập Tp HCM: NXB trẻ Võ Thị Bạch Mai 2004 Sự phát triển chồi rễ Tp Hồ Chí Minh: NXB Đại học Quốc Gia Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng Lê Hồng Điệp 2005 Công nghệ sinh học tế bào (tập hai) Hà Nội: NXB Giáo dục Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm Hoàng Minh Tấn 2007 Sinh lý học thực vật Hà Nội: NXB Giáo dục Wang, H 1989 In vitro clonal propagation of ginger sprouts Acta Bot Yunnanica 11: 231-233 Yongqiang Zheng, Yanmei Lui, Mi Ma and Kun Xu 2008 Increasing in-vitro microrhizome production of ginger (Zingiber officinale Rosc) Acta Physiol Plant 30:513-519 Yuji Noguchi Osamu Yamakawa 1988 Rapid clonal propagation of ginger (Zingiber officinale Rosc.) by roller tube culture J Breed 38:437-442 31 ... 2009 CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NI CẤY MƠ TĨM LƯỢC Đề tài: ? ?Cải tiến qui trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) phương pháp nuôi cấy. .. mầm, nhân giống gừng từ hạt Nhân giống gừng phương pháp nuôi cấy mô tạo số lượng lớn đồng bệnh, tốn chi phí khơng gian tồn trữ giống Nhân giống gừng phương pháp nuôi cấy mô thực Lâm Ngọc Phương. .. diện tích chi phí tồn trữ giống Vì vậy, đề tài ? ?Cải tiến qui trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) phương pháp nuôi cấy mô? ?? tiến hành để đáp ứng nhu cầu gừng giống cho thị trường, giúp