ĐỀ TÀI THỰC HIỆN TIÊU bản cố ĐỊNH DỊCH HOÀN CHUỘT ĐỒNG

PHẦN I : ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh sản là một đặc điểm đặc trưng nhất của mọi cơ thể và là bản năng của mọi sinh vật để bảo tồn nòi giống và cũng là đặc điểm đặc trưng của sinh vật khi so sánh với phi sinh vật Ở giới động vật thuộc lớp thú, trong các cấu trúc của hệ sinh dục đực, tinh hoàn là cơ quan sản sinh tinh trùng và chế tiết hormon sinh dục. Để có cơ sở giải phẩu nhằm quan sát hình dạng ngoài và quá trình sản suất tinh trùng của tinh hoàn, việc xác định phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi và mẫu ngâm tinh hoàn là cần thiết. Ngoài ra kết quả nghiên cứu sẽ thay thế cho nguồn mẫu tiêu bản dịch hoàn đã xuống cấp không thể tiếp tục dùng để giảng dạy mô học. PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1. KỸ THUẬT 1.1 Kỹ thuật thực hiện mẫu ngâm: Thực hiện mẫu ngâm là cố định làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như của tế bào nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất Trước hết một loại thuốc cố định tốt phải đạt được những yêu cầu sau đây: Chống được sự nhiễm trùng Ngấm nhanh vào tổ chức, giết nhanh tế bào Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của tổ chức và tế bào, chống lại sự tự tiêu hủy do men nội bào Một số tác nhân cố định hoá học thông dụng là: cồn, formol, axit axetic, axit pieric, axit chromic, bicromat kali, clorua mercuric, tetroxyl osmium, axit trichloraxetic Hòe,1976 1.2 Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định: Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát. Mẫu vật thực hiện theo phương pháp này qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ, nếu một trong mỗi giai đoạn chính chưa đạt được mong muốn thì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả về sau. Tóm lược quy trình như sau: định hình khử nước tẩm Parafin – đúc khuôn – cắt mẫu tải mẫu lên lame nhuộm kép bằng HematoxylineEosin khử nước – làm trong mẫu và cố định mẫu trong Baume Canada. 1.2.1 Cố định. Nguyên tắc chung: Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy. Không được làm dập nát mẫu. Mẫu vật phải có kích thước vừa phải. Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng. Đủ dung dịch cố định cần thiết. • Đúng nồng độ. • Thể tích dung dịch cố định gấp từ 3060 lần thể tích mẫu. Thời gian cố định thích hợp. Mẫu dày tối đa 5mm thì cố định từ 2448 giờ. Dung dịch cố định là dung dịch Bouin chứa acid picric, acid acetic và formol. Rửa nước cho sạch màu vàng của Bouin dưới vòi nước chảy Hòe, 1976

GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm PHẦN I : ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh sản là một đặc điểm đặc trưng nhất của mọi cơ thể và là bản năng của mọi sinh vật để bảo tồn nòi giống và cũng là đặc điểm đặc trưng của sinh vật khi so sánh với phi sinh vật Ở giới động vật thuộc lớp thú, trong các cấu trúc của hệ sinh dục đực, tinh hoàn là cơ quan sản sinh tinh trùng và chế tiết hormon sinh dục. Để có cơ sở giải phẩu nhằm quan sát hình dạng ngoài và quá trình sản suất tinh trùng của tinh hoàn, việc xác định phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi và mẫu ngâm tinh hoàn là cần thiết. Ngoài ra kết quả nghiên cứu sẽ thay thế cho nguồn mẫu tiêu bản dịch hoàn đã xuống cấp không thể tiếp tục dùng để giảng dạy mô học. Luận văn tốt nghiệp 1 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1. KỸ THUẬT 1.1 Kỹ thuật thực hiện mẫu ngâm: Thực hiện mẫu ngâm là cố định làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như của tế bào nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất Trước hết một loại thuốc cố định tốt phải đạt được những yêu cầu sau đây: - Chống được sự nhiễm trùng - Ngấm nhanh vào tổ chức, giết nhanh tế bào - Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của tổ chức và tế bào, chống lại sự tự tiêu hủy do men nội bào Một số tác nhân cố định hoá học thông dụng là: cồn, formol, axit axetic, axit pieric, axit chromic, bicromat kali, clorua mercuric, tetroxyl osmium, axit trichloraxetic [Hòe,1976] 1.2 Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định: Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát. Mẫu vật thực hiện theo phương pháp này qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ, nếu một trong mỗi giai đoạn chính chưa đạt được mong muốn thì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả về sau. Tóm lược quy trình như sau: định hình - khử nước - tẩm Parafin – đúc khuôn – cắt mẫu - tải mẫu lên lame - nhuộm kép bằng Hematoxyline-Eosin - khử nước – làm trong mẫu và cố định mẫu trong Baume Canada. 1.2.1 Cố định. Nguyên tắc chung: - Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy. - Không được làm dập nát mẫu. - Mẫu vật phải có kích thước vừa phải. - Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng. Luận văn tốt nghiệp 2 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm - Đủ dung dịch cố định cần thiết. • Đúng nồng độ. • Thể tích dung dịch cố định gấp từ 30-60 lần thể tích mẫu. - Thời gian cố định thích hợp. Mẫu dày tối đa 5mm thì cố định từ 24-48 giờ. - Dung dịch cố định là dung dịch Bouin chứa acid picric, acid acetic và formol. - Rửa nước cho sạch màu vàng của Bouin dưới vòi nước chảy [Hòe, 1976] 1.2.2 Khử nước Quy trình khử nước thông thường chung cho mỗi loại mẫu (có thể gia giảm tùy kích cở, mẫu, điều kiện của từng phòng thí nghiệm) a. Cồn II (cồn tuyệt đối sử dụng 2 lần) 4 giờ b. Cồn I (cồn tuyệt đối sử dụng 1 lần) 4 giờ c. Cồn tuyệt đối 6 giờ 1.2.3 Tẩm parafin 1.2.3.1 Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn) Dung môi trung gian của Parafin thường dùng nhất là Toluen và xylene. Ngoài ra còn có nhiều chất có 2 đặc tính khử cồn hòa tan Parafin như Benzen, Ét-xăng bách hương, Butanol, sunfuacacbon, Những chất sau chỉ dùng hạn chế: ví dụ như Ét-xăng bách hương dùng cho kỹ thuật xét nghiệm ty lạp thể, butanol dùng cho tổ chức hạch. Để khử hết cồn dùng : a. Xylene (hay xylon) II (đã sử dụng 2 lần 4 giờ ) b. Xylene I (đã sử dụng 1 lần 4 giờ) c. Xylene nguyên chất 6 giờ Thời gian khử cồn tối đa là 24 giờ, mẫu ngâm quá lâu sẽ cứng và dễ vỡ. [Hòe, 1976] 1.2.3.2 Tẩm parafin (khử xylene) Trước hết cần chọn loại Parafin tốt và thích hợp. Parafin chỉ có thể ngấm vào mẫu và loại xylene ra khi nó ở trạng thái lỏng, tẩm parafin chỉ thực hiện đầy đủ khi dung môi trung gian đã bị loại hoàn toàn. Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyển mẫu lần lượt vào những lọ có Parafin ngày càng tinh khiết. Để tiêt kiệm hóa chất và thời gian, trên thực tế chỉ cần 3 lần tẩm là đủ Luận văn tốt nghiệp 3 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm a. Parafin I (đã sử dụng 2 lần) 6 giờ b. Parafin II (đã dùng 1 lần) 6 giờ c. Parafin III (nguyên chất) 12 giờ Loại Parafin I và II có thể dùng nhiều lần hơn quy định. Parafin III phải đảm bảo nguyên chất vì chính nó sẽ dùng để đúc khuôn. Nói chung, thời gian tẩm lâu hay mau là tùy kích thước và tính chất của mẫu: nếu nhỏ và lỏng lẽo thì tẩm vài ba giờ, nếu to và cứng thì tẩm từ 24-36 giờ. [Hòe, 1976] 1.2.4 Đúc khuôn Người ta đổ vào khuôn chất Parafin lỏng đã lọc từ trước (Parafin ở lần chuyển thứ 3, nghĩa là Parafin hoàn toàn mới). Nhúng ngay mẫu vào chất Parafin đang lỏng này. Dùng kẹp hay kìm đã hơ nóng để định hướng mẫu theo ý muốn. Sau vài phút Parafin sẽ đông đặc lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí. Khi lớp vỏ ngoài Parafin đã đủ cứng, làm ướt cả khuôn vào trong bát đựng đầy nước lạnh và chú ý đừng làm rạn, vỡ màng mỏng Parafin bên trên. Khoảng 20-30 phút sau, Parafin sẽ cứng lại và thuần nhất toàn bộ. Cần tránh làm lạnh ngay khi Parafin còn lỏng, không được cắt mảnh ngay, phải đợi đến 24 giờ sau. 1.2.5 Cắt và dán mẫu 1.2.5.1 Bảo quản máy cắt và lưỡi dao - Máy cắt mảnh luôn luôn được bảo quản tốt và các phụ tùng được kiểm tra chặt chẽ. - Trước khi dùng cần kiểm tra lại vị trí của các trụ của bàn gắn và lưỡi dao, tránh sự va chạm vào nhau làm sai lệch máy. Xem lại dầu tra vào máy, sự trơn tru… - Sau khi dùng thì tháo lưỡi dao ra, lau sạch bằng một miếng vải mịn có tẩm xylene, vít chặt trong hộp để tránh tai nạn. Lau chùi cẩn thận các mảnh vụn nếu không sẽ làm cho máy bị sét bẩn 1.2.5.2 Cắt mẫu tẩm parafin bằng máy cắt với 3 giai đoạn - Cắt khối mẫu thành hình tháp, đáy hình thang, để lại khoảng 2-3 mm Parafin quanh mẫu. Gọt làm sao cho 2 cạnh trên và dưới song song. - Hơ nóng nhanh khối gỗ và khối mẫu để gắn khối mẫu vào khối gỗ, điều chỉnh mẫu sao cho ngay ngắn. Luận văn tốt nghiệp 4 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm - Đặt lưỡi dao vào, định hướng khối và dao trên máy cắt cho thích hợp. Nhiệt độ tối ưu là nhiệt độ phòng . Độ dày của mẫu cắt : • 3-5µm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tế bào học • 10-15 µm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tổ chức học định khu. Tốc độ của tay quay tùy thuộc vào tính chất của khối và độ dày của khối, nói chung, nên quay chậm với các khối dễ vỡ, đặc biệt là gan và lách. Còn đối với khối rắn không vỡ cần quay nhanh. Hứng các mẫu cắt trên một tờ giấy trắng. [Hòe, 1976] 1.2.5.3 Tải mảnh cắt lên lame Trước khi nhuộm cần phải tải mảnh cắt và dán mảnh trên lame. Muốn mảnh cắt dính vào nền lame có thể dùng một chất dính Gêlatin hoặc Albumin, trình tự thực hiện như sau: - Nhỏ vài giọt nước hoặc dung dịch dán còn ấm trên lame (dung dịch phải làm ướt đều kính) - Đặt lên trên dung dịch một mảnh cắt hay một dãy cắt. - Đặt lame trên bàn nóng khoảng 50 o C và theo dõi mảnh cắt tải ra, mảnh cắt phải nổi trên dung dịch. Không bao giờ bàn nóng quá 50 0 C thì tổ chức sẽ bị khô. - Nghiêng lame để tháo nước đi một cách thận trọng. Làm thế nào cho dung dịch dán trôi đi càng nhiều càng tốt. - Để tiêu bản khô theo tư thế nghiêng (mảnh cắt ở mặt dưới) ít nhất là 12 giờ ở nhiệt độ bình thường hoặc 20-30 phút trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 45 o C khi đã khô kiệt, các mảnh cắt dính rất tốt vào lame [Hòe, 1976] 1.2.6 Loại parafin ra khỏi mảnh cắt Loại parafin ra khỏi mảnh cắt chỉ tiến hành trước khi nhuộm vì không thể bảo quản lâu được tổ chức rất hay vụn vỡ, hút ẩm. - Đối với các tiêu bản đã được nhuộm cả khối: + Làm tan parafin bằng xylene. + Gắn bằng Baume canada. - Đối với các tiêu bản chưa nhuộm và dán bằng albumin: + Làm đông đặc albumin bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn. + Hòa tan parafin bằng xylen từ 1-2 phút. Luận văn tốt nghiệp 5 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm + Loại xylen bằng cồn tuyệt đối 1 phút. + Cho vào cồn 95 0 : 1 phút. + Cho vào nước 5 phút. 1.2.7 Nhuộm Hematoxyline – Eosin - Cho tiêu bản vào Hematoxyline từ 5- 45 phút tùy theo loại Hematoxyline. - Rửa tiêu bản trong nước chảy cho đến khi nào tiêu bản màu xanh (từ hồng sang xanh) khoảng 10 phút ở nước chảy pH=8 - Nhúng vào cồn acid vài giây (1ml acid HCl + 99ml cồn 96 0 ) Cần lắc tiêu bản rồi rửa nước lã cho xanh lại. Kiểm tra lại nếu biệt hóa chưa đủ thì nhúng lại cồn acid, nếu màu nhạt sau khi rửa qua nước cất, có thể cho lại Hematoxylin từ 10-15 phút. Sau đó biệt hóa trở lại. - Ngâm tiêu bản trong Eosin từ 2-4 phút (Eosin Y 1% trong cồn để nhuộm nguyên sinh chất) - Rửa nước từ 3-4 phút (kiểm tra trên kính hiển vi xem đã đạt yêu cầu chưa). - Nhúng tiêu bản trong cồn 90 0 khoảng 10-15 giây, sau đó là cồn tuyệt đối I, II, III (10-30 giây mỗi lần ) để khử nước. - Chuyển sang ngâm mẫu trong xylene cho đến khi trong mẫu. Gắn tiêu bản chú ý: sau khi gắn xong, tiêu bản phải trong suốt. Baume Canada thường dùng trong dung dịch xylen 55%. Cần đậy kín lọ. [Hòe, 1976] 2. CẤU TRÚC MÔ HỌC 2.1. Cấu tạo đại thể của tinh hoàn Ở người trưởng thành, mỗi tinh hoàn có kích thước trung bình 4 x 2.5 cm, hình trứng nằm trong bìu. Tinh hoàn được bọc trong một vỏ liên kết xơ gọi là màng trắng có lá tạng của tinh mạc phủ ngoài. Ở mặt sau trên của tinh hoàn, màng trắng dày lên thành khối xơ gọi là thể Highmore. Từ màng trắng có nhiều vách liên kết tiến vào trong, chia tinh hoàn thành nhiều tiểu thuỳ tinh hoàn (150 – 200 tiểu thuỳ). Các tiểu thuỳ có xu hướng qui tụ về phía thể Highmore. Trong mỗi tiểu thuỳ có 1 – 5 ống sinh tinh cong queo, uốn lượn trong mô liên kết rất giàu mạch máu, mạch bạch huyết, thần kinh. [Kiệt, 1994] Luận văn tốt nghiệp 6 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm 2.2. Cấu tạo vi thể của ống sinh tinh Trong mỗi tiểu thuỳ tinh hoàn có nhiều ống sinh tinh. Thành của ống sinh tinh gồm một lớp vỏ chung và lớp biểu mô tinh. Lớp vỏ chung gồm lớp đáy, lớp dạng cơ và lớp sợi. Lớp đáy nằm sát màng đáy, không có cấu tạo tế bào, chỉ có sợi collagen xếp theo nhiều hướng khác nhau. Lớp dạng cơ nằm ngoài lớp đáy, gồm những tế bào chứa nhiều siêu sợi actin. Lớp dạng cơ giúp ống sinh tinh co dãn được. Ngoài lớp dạng cơ có những tế bào sợi. Luận văn tốt nghiệp 7 Hình 1: Hệ niệu - sinh dục nam [Hoa, 2003] Thận Niệu quản Túi tinh Ống thoát tiểu Tuyến hành Ống dẫn tinh Mào tinh 8. Tinh hoàn 9. Quy đầu 10. Niếu tinh quản 11. Niếu quản tiền liệt 12. Tuyến tiền liệt 13. Bàng quang 14. Ống phóng tinh Hình 2: Cấu tạo tinh hoàn bổ dọc [Hoa, 2003] Ống phóng tinh Ống thoát tinh Ống mào tinh Lưới tinh Ống lạc(di tích ống trung thận) Các ống sinh tinh GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm Biểu mô sinh tinh là một biểu mô đặc biệt tựa trên màng đáy và hướng vào lòng của ống sinh tinh. Biểu mô sinh tinh gồm hai loại tế bào chính: tế bào dòng tinh và tế bào sertoli 2.2.1. Tế bào dòng tinh Những tế bào dòng tinh xếp thành 4 – 8 lớp tế bào từ màng đáy cho đến lòng ống sinh tinh. Những tế bào dòng tinh vừa sinh sản vừa biệt hoá để tạo thành tinh trùng. Ở người đàn ông trưởng thành, tế bào dòng tinh gồm có: tinh nguyên bào, tinh bào I, tinh bào II, tinh tử (tiền tinh trùng), tinh trùng. Quá trình từ tinh nguyên bào đến tinh trùng được gọi là quá trình tạo tinh (spermatogenese). Quá trình này gồm ba giai đoạn: - Tạo tinh bào (spermatocytogenese): tinh nguyên bào phân chia theo kiểu nguyên phân tạo thành tinh bào I. - Tạo tinh tử, còn gọi là quá trình giảm phân (meiose): tinh bào I tiến hành hai lần phân chia giảm nhiễm để tạo tinh tử. - Tạo tinh trùng ( spermiogenese): các tinh tử biến đổi và biệt hoá thành tinh trùng. Luận văn tốt nghiệp 8 Hình 3: Ống sinh tinh [Hoa, 2003] 1. Thành ống sinh tinh 2. Tế bào kẽ Leydig 3. Lòng ống sinh tinh 1 2 3 Tinh nguyên bào A đậm Tinh nguyên bào A nhạt Tinh nguyên bào A nhạt Tinh nguyên bào A nhạt Tinh nguyên bào A nhạt Tinh nguyên bào B Tinh bào I Tinh tử giai đoạn cuối Tinh tử giai đoạn sớm Tinh bào II Thể cặn Tinh trùng Hình 4: Sơ đồ phân chia và biệt hóa tế bào dòng tinh [Kiệt, 1994] GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm * Tinh nguyên bào Tinh nguyên bào là những tế bào sinh dục nguyên thuỷ, nằm sát màng đáy của ống sinh tinh, kích thước nhỏ khoảng 12 micron, nhân ít nhuộm màu, bào tương có bộ Golgi nhỏ, ti thể và nhiều ribosom tự do. Tinh nguyên bào gồm hai loại: tinh nguyên bào A và tinh nguyên bào B. Các tinh nguyên bào nằm ở phần nền của biểu mô sinh tinh gián phân liên tục để tạo nhiều thế hệ tế bào, cung cấp trong quá trình sinh tinh. Một số tinh nguyên bào có chu kỳ tế bào rất dài, ít phân chia, chỉ đóng vai trò dự trữ. Các tế bào này chỉ phân chia khi có sự thiếu hụt tinh nguyên bào cho quá trình sinh tinh. Ở người, phân loại theo hình dạng, có 3 loại tinh nguyên bào: Loại A đậm màu: đóng vai trò dự trữ, loại này sẽ gián phân tạo thành loại tinh nguyên bào A nhạt khi có sự thiếu hụt Loại A nhạt màu: gián phân liên tục để tạo tinh nguyên bào loại B Loại B: gián phân liên tục để tạo tinh bào I có kích thước lớn hơn tinh nguyên bào, nhân trở nên nhuộm màu đậm hơn do các nhiễm sắc thể co ngắn và dày hơn [Silber, 1999] Luận văn tốt nghiệp 9 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm Sự gián phân liên tục của các tinh nguyên bào đảm bảo nguồn cung cấp cho quá trình sinh tinh diễn ra liên tục trong suốt đời sống nam giới. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình này sẽ làm giảm đáng kể số lượng tinh trùng và tác động lâu dài lên quá trình sinh tinh. Ở người số lượng tinh trùng được sinh ra phụ thuộc vào - Số lượng tinh nguyên bào dự trữ (loại A đậm) - Số lần gián phân từ giai đoạn A đậm đến giai đoạn tinh bào I. Con số này thường cố định tùy loài. - Cường độ phân chia của các tinh nguyên bào cũng như của các giai đoạn sau của quá trình sinh tinh. [ Silber, 1999 ] ** Tinh bào I Tinh bào I thực hiện phân chia giảm nhiễm lần thứ nhất để cho hai tinh bào II với 23 nhiễm sắc thể. Tinh bào II nhanh chóng phân chia giảm nhiễm lần hai để tạo thành hai Luận văn tốt nghiệp 1 7 6 5 4 3 2 10 Tinh nguyên bào A nhạt Tinh nguyên bào B Tinh nguyên bào A đậm Giai đoạn sớm của tinh trùng Tinh tử Tinh bào I Tế bào Sertoli Hình 5: Các loại tế bào dòng tinh ở lớp biểu mô tinh [David H. Cormack] [...]... bao liên kết bám trên tinh hoàn cho thật sạch, bỏ ngay vào dung dịch cố định Bouin (Nếu thao tác mổ lâu thì vùi tinh hoàn trở lại dịch mô của chuột một lúc rồi đem cho vào dung dịch cố định) Tinh hoàn Hình 9: Tinh hoàn chuột tại vị trí Hình 9: Tinh hoàn chuột tại vị trí 2.2.2 Cố định: Cố định trong dung dịch Bouin (công thức pha xem ở phần phụ lục) trong 24 giờ Trong lúc cố định nên có những động tác... lame (nếu có) Hình 15: Cố định mẫu trong Baume Canada Dán nhãn tiêu bản, ghi rõ: Tên mẫu, ngày tháng năm làm tiêu bản Luận văn tốt nghiệp 26 SVTH: Trần Thanh Liêm Tinh hoàn chuột đồng cắt ngang H&E 5/5/2006 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa Hình 16: Tiêu bản tinh hoàn chuột đồng cắt ngang 3 BẢNG TÓM TẮT QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN: GIAI ĐOẠN Lấy mẫu Cố định mẫu Rửa nước VẬT LIỆU SỬ DỤNG chuột, kéo, kẹp, thau nước,... PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.1 Thực hiện mẫu đại thể (mẫu ngâm): Luận văn tốt nghiệp 17 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm Thao tác thực hiện mẫu đại thể dịch hoàn chuột đồng khá đơn giản, gồm các bước sau: - Chuột sống sau khi bị dìm chết trong nước, tiến hành mổ ngay Thao tác mổ được thực hiện ở mặt bụng của chuột Thực hiện mẫu ngâm dịch hoàn chuột đồng bằng cách giải phẩu chuột, sau đó gở các... tinh trùng, tế bào Sertoli 1.2 Tồn tại: - Độ bắt màu phẩm nhuộm không đồng nhất giữa các tiêu bản do tiêu bản hiển vi dịch hoàn chuột đồng được thực hiện trên nhiều đối tượng chuột có độ tuổi khác nhau nên sự nhạy cảm đối với thuốc nhuộm của tổ chức mô khác nhau - Tiêu bản không giữ được trọn vẹn cấu trúc bao thớ xung quanh dịch hoàn do bao này rất dày gây trở ngại lớn trong khâu cắt mẫu 2 KỸ THUẬT:... tinh hoàn ra dương hành của chuột Sau khi giải phẫu, trình bày nội quan, ngâm vào dung dịch formol 10%, sau đó đổi dung dịch khi thấy dung dịch không còn trong (khoảng 2 tháng) Giai đoạn cắt da Giai đoạn cắt thịt Hình 8: Sơ đồ các đường mổ trong giải phẩu chuột - Quan sát hình dạng ngoài, vị trí, của dịch hoàn chuột khi mổ 2.2 Thực hiện mẫu hiển vi: Quá trình nghiên cứu cấu trúc dịch hoàn chuột đồng. .. chỉnh thời gian nhuộm Hematoxyline và Eosin cho cân đối hoàn Tiêu bản bị nhiễm Thuốc nhuộm bị cặn hoặc các lọ Lọc thuốc nhuộm, thay các bẩn cồn, xylen bị cặn lọ hoá chất PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN Qua quá trình thực hiện thí nghiệm trên đối tượng dịch hoàn chuột đồng chúng tôi đã làm được 100 tiêu bản hiển vi cố định và 2 mẫu đại thể được thực hiện với kết quả như sau: 1 ƯU VÀ KHUYẾT ĐIỂM: 1.1 Ưu điểm:... điểm và thời gian thực hiện đề tài: Luận văn tốt nghiệp 15 GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm sinh lý động vật - Bộ môn SinhKhoa Sư phạm - Đại học Cần Thơ Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 10/2005đến tháng 05/ 2006 1.2 Phương tiện và hoá chất: Để thực hiện được tiêu bản hiển vi cố định tinh hoàn chuột đồng trải qua nhiều... định sẽ dễ dàng thấm sâu vào cấu trúc mô, mô cố định sẽ tốt hơn, đồng thời dịch mô từ mẫu thoát ra không làm loãng dung dịch cố định 2.2.3 Khử nước: Vớt mẫu trong dung dịch cố định ra rửa dưới vòi nước chảy khoảng 2-3 giờ để giảm bớt màu vàng của dung dịch Bouin: dùng một chai nước khoáng bị đục thủng đáy, cho nước vào đầy chai sau đó cho tinh hoàn đã cố định vào, tiếp tục cho nước chảy khoảng 2 – 3... xung quanh nội quan và tinh hoàn chuột, trình bày mẫu cho đẹp rồi ngâm vào dung dịch Formol 10% (chuẩn bị sẵn) Sau khoảng 2 tháng thì thay dung dịch formol khác 2.2 Mẫu hiển vi: 2.2.1 Cố định mẫu: Trong khâu cố định mẫu cần chú ý: Thời gian cố định phải thích hợp + Nếu cố định quá lâu thì khi cắt mẫu sẽ bị giòn nên mẫu sẽ bị vỡ hoặc bong ra khỏi khuôn sáp + Nếu thời gian cố định quá ngắn thì mẫu sẽ bị... mổ phải nhẹ nhàng thể hiện ở tất cả các khâu: Giết chuột, mổ, tháo gở, cắt lấy tinh hoàn, ngâm mẫu: -Giết chuột: dìm chuột vào một chậu nước Thao tác tránh chạm tới vùng bụng của chuột, tránh va chạm mạnh dễ dàng làm vỡ các nội quan bên trong Dùng các đinh ghim cố định bốn chi của chuột - Mổ: thao tác mổ được thực hiện ở mặt bụng Tiến hành mổ từ một điểm phía trên dương hành của chuột, luồn mũi kéo vào . phẩu chuột - Quan sát hình dạng ngoài, vị trí, của dịch hoàn chuột khi mổ. 2.2 Thực hiện mẫu hiển vi: Quá trình nghiên cứu cấu trúc dịch hoàn chuột đồng thông qua phương pháp thực hiện tiêu bản. dung dịch cố định cần thiết. • Đúng nồng độ. • Thể tích dung dịch cố định gấp từ 30-60 lần thể tích mẫu. - Thời gian cố định thích hợp. Mẫu dày tối đa 5mm thì cố định từ 24-48 giờ. - Dung dịch cố. osmium, axit trichloraxetic [Hòe,1976] 1.2 Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định: Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát. Mẫu vật thực hiện theo phương pháp này qua nhiều giai đoạn phức