Phân loại, nuôi trồng và khảo sát sơ bộ các chất có hoạt tính sinh học của loài vân chi đỏ tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ THU TRANG PHÂN LOẠI, NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI VÂN CHI ĐỎ TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN ĐỨC HỒNG Tp Hồ Chí Minh, Năm 2012 MỞ ĐẦU Trametes nấm có khả hóa sube, tai nấm khơ trở nên cứng giịn Trên giới có khoảng 50 lồi thuộc chi Trametes, số có số lồi nấm phá gỗ, có số khác thuộc chi Trametes nấm dược liệu Hiện nay, ghi nhận có khoảng 820 chủng Trametes khắp trái đất [102] Vân chi đỏ (Trametes sanguinea) lồi nấm có nhiều ứng dụng tiềm dược liệu xử lý môi trường Các nghiên cứu cho thấy vân chi đỏ tìm thấy nhiều vùng giới có số chất có hoạt tính sinh học polysaccharide, saponin, carotenoid, hay alkaloid… Ở Việt Nam, năm gần phát nhiều loài vân chi tự nhiên, có vân chi đỏ Tuy nhiên, nghiên cứu phân loại khảo sát chất có hoạt tính sinh học nấm có nguồn gốc từ Việt Nam hạn chế Đề tài nhằm định danh, nuôi trồng khảo sát sơ hợp chất có hoạt tính sinh học lồi vân chi đỏ phát Việt Nam Kết phân loại dựa hình thái rDNA xác định nấm vân chi đỏ phân lập Trametes sanguinea, sở cho việc phân loại chi Trametes nói riêng lồi nấm lớn khác Việt Nam nói chung nghiên cứu Ngoài ra, kết khảo sát hoạt chất sinh học có giá trị nghiên cứu hướng đến việc khai thác chất có lợi nấm vân chi đỏ MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Mục lục i Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình vẽ, đồ thị viii MỞ ĐẦU Chương 1-TỔNG QUAN 1.1 Vị trí giới nấm hệ thống phân loại học .1 1.2 Phương pháp phân loại nấm .4 1.2.1 Phương pháp phân loại dựa hình thái đặc điểm sinh lý 1.2.1.1 Giới thiệu chung giới nấm 1.2.1.2 Ngành Basidiomycota (nấm đảm) .4 1.2.2 Phân loại học giới nấm dựa vào sinh học phân tử .7 1.2.2.1 DNA ribosome 1.2.2.2 DNA mã hóa cho enzyme ATPase ti thể tiểu phần số (atp6) .9 1.2.2.3 DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha (tef1) 10 1.2.2.4 Gen mã hóa cho protein RPB1 RPB2 (rpb1, rpb2) 10 1.2.2.5 Gen mã hóa α-tubulin β-tubulin (α-tub, β-tub) 11 1.2.2.6 Gen mã hóa cho enzyme cytochrome oxidase (cox) 11 1.3 Khái quát nấm nuôi trồng 12 1.3.1 Đặc điểm sinh lý nấm trồng 13 1.3.1.1 Nhu cầu dinh dưỡng hệ sợi nấm 13 1.3.1.2 Ảnh hưởng yếu tố vật lý 14 1.3.2 Phương pháp nuôi trồng 15 1.3.2.1 Nguyên liệu trồng nấm 15 i 1.3.2.2 Kỹ thuật trồng nấm 15 1.4 Nấm dược liệu dược tính 18 1.5 Các hợp chất có hoạt tính sinh học nấm dược liệu 21 1.5.1 Polysaccharides 21 1.5.1.1 β- D- glucan 21 1.5.1.2 Các dị polysaccharide (Heteropolysaccharides) 21 1.5.2 Saponin 22 1.5.3 Steroid 23 1.5.4 Carotenoid 25 1.5.5 Alkaloid 26 Chương 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2 Môi trường sử dụng 28 2.1.2.1 Môi trường dinh dưỡng 28 2.1.2.2 Môi trường nuôi trồng 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phân lập nấm vân chi đỏ 29 2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu 29 2.2.1.2 Phương pháp phân lập 29 2.2.2 Phân loại nấm hình thái di truyền 29 2.2.2.1 Phân loại nấm hình thái 29 2.2.2.2 Phân loại dựa DNA Ribosome 29 2.2.3 Khảo sát số đặc điểm sinh lý hai loài nấm vân chi 31 2.2.3.1 Khảo sát tốc độ lan tơ 31 2.2.3.2 Hình thái tơ nấm môi trường nuôi cấy lắc 32 2.2.4 Trồng để thu nhận nấm 32 2.2.4.1 Chuẩn bị meo giống cấp 32 2.2.4.2 Chuẩn bị meo cọng 32 ii 2.2.4.3 Trồng nấm giá thể mạt cưa 32 2.2.4.4 Quy trình trồng nấm vân chi 33 2.2.5 Khảo sát hoạt chất sinh học 33 2.2.5.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 34 2.2.5.2 Phương pháp định lượng β-1,3-glucan 38 2.2.5.3 Phương pháp định tính định lượng saponin 39 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 42 Chương 3-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân lập mẫu nấm vân chi đỏ 44 3.1.1 Hình thái mẫu nấm vân chi đỏ tự nhiên 44 3.1.2 Phân lập nấm vân chi đỏ 45 3.2 Phân loại nấm vân chi đỏ đen 45 3.2.1 Phân loại nấm hình thái 45 3.2.2 Phân loại sinh học phân tử 52 3.2.2.1 Kết PCR 52 3.2.2.2 Kết giải trình tự 54 3.2.2.3 Xây dựng phân loại 54 3.3 Khảo sát số đặc điểm sinh lý hai loài nấm 56 3.3.1 Khảo sát tốc độ lan tơ 56 3.3.2 Hình thái tơ nấm môi trường nuôi cấy lắc 58 3.4 Ni trồng hai lồi nấm 59 3.4.1 Nuôi trồng nấm vân chi đỏ 59 3.4.1.1 Chuẩn bị giống 59 3.4.1.2 Quy trình ni trồng 60 3.4.2 Nuôi trồng nấm vân chi đen 62 3.4.2.1 Chuẩn bị giống 62 3.4.2.2 Quy trình ni trồng 63 3.5 Khảo sát hoạt chất sinh học 64 3.5.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 64 iii 3.5.2 Định lượng β-1,3-glucan 67 3.5.3 Định tính định lượng saponin 70 3.5.3.1 Định tính saponin 70 3.5.3.2 Định lượng saponin 73 Chương -KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 74 4.2 Kiến nghị 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO xi PHỤ LỤC iv Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan 1.1 Vị trí giới nấm hệ thống phân loại học Phân loại học có từ lâu đời, phát triển theo phát triển lịch sử lồi người, đời người phân biệt loại thực vật gây độc sử dụng làm thực phẩm dược liệu, ghi nhớ phân loại lồi vật ni Sự phát triển phân loại học nấm sau thực vật động vật Trong hệ thống phân loại cũ từ giới (kingdom) Carl Linnaeus đến giới Herbert F Copeland năm 1938, nấm coi thuộc giới thực vật (Plantae), đặc điểm mô tả hình thái nấm biết đến trước nhiều kỉ Khi hệ thống phân loại giới Robert Whittaker đời năm 1969 khác biệt nấm sinh vật khác đặc biệt thực vật sau thời gian nhận biết phân loại cách có hệ thống Ông phân loại sinh vật đa bào dựa vào khả dinh dưỡng: giới Animalia sinh vật dị dưỡng, khơng có khả tự tạo dinh dưỡng cho thể mà phải lấy từ nguồn khác, giới Plantae sinh vật tự dưỡng, thực vật sử dụng ánh sáng mặt trời tạo nguồn dinh dưỡng cho chúng nguồn thức ăn cho lồi dị dưỡng khác, giới Fungi dị dưỡng, nấm tiết enzym ngồi mơi trường, tiêu thụ chất hữu thông qua sợi nấm gọi hệ sợi, chúng khơng thể thiếu chu trình biến đổi vật chất Về Robert Whittaker chia giới Monera thuộc nhóm sinh vật nhân sơ giới Protista sinh vật nhân thực, chúng sinh vật sống đơn bào Vào năm 70 kỉ XX, phát triển sinh học phân tử giúp cho phân loại sinh vật sống vào chất gen quan tâm tới hình thái hành vi giới sống việc so sánh vùng gen tương đồng bảo tồn cao (ban đầu rDNA) Lúc chia nhiều nhóm lồi có đặc điểm chung gen bảo tồn Hơn nữa, liên tiếp khám phá sống đưa luận điểm chung: tất sinh vật có tổ tiên chung Sự bao qt sống khơng cịn mức giới mà tổ chức sống mức cao hơn, bao quát Dựa nghiên cứu RNA, Carl Woese tìm khác biệt giới Monera, vi khuẩn vi khuẩn cổ Một cách khái quát, đến thập niên 1990, Carl Woese cho rằng, sống chia làm lãnh giới (domain): lãnh giới Nguyễn Thị Thu Trang Tổng quan Bacteria gồm giới Bacteria, lãnh giới Archaea gồm giới Archaea, lãnh giới Eukarya gồm giới Protista, Fungi, Plantae Animalia Theo hệ thống phân lồi giới Fungi có mối quan hệ gần gũi với giới Animalia (Hình 1.1) [21] Hình 1.1 Hệ thống phân loại giới lãnh giới [72] Phân loại học đầu kỉ XXI dựa phân loại lãnh giới Woese, sâu vào phân loại lãnh giới Eukarya Đó kết q trình phát triển công nghệ sinh học sinh tin, phôi thai học, hóa thạch học lịch sử học, ngày nhiều loài sinh vật thuộc lãnh giới nhân thực giải trình tự phân loại Do vậy, hội nghị phân loại học quốc tế năm 2005 đưa cách phân loại lãnh giới Eukarya (Eukaryota) Theo đó, lãnh giới Eukarya chia làm siêu giới tiếp tục khẳng định quan điểm Woese giới nấm có mối quan hệ gần với giới Metazoa (Animalia) giới Plantae Do vậy, giới Fungi nằm siêu giới Opisthokonts (Opisthokonta) với giới Metazoa (Hình 1.2) [21] Tổng quan Hình 1.2 Hệ thống phân loại siêu giới lãnh giới Eukarya [19] Sau năm 2005, nghiên cứu phân loại học sâu đặc điểm lãnh giới Eukarya, đặc biệt chứng rDNA nguyên sinh động vật thay đổi quan điểm siêu nhóm Lãnh giới Eukarya chia làm hai siêu nhóm  Unikonts-Unikonta (một roi): gồm siêu giới Amoebozoa Opisthokonts [22, 30, 31, 32]  Bikonts-Unikonta (hai roi): gồm siêu giới Excavata, Rhizaria, Chromalveolata, Archaeplastida Trong đó, ngành Heterkontophyta (Stramenopiles) Alveolata thuộc siêu giới Chromalveolata siêu giới Rhizaria có quan hệ gần gũi với nhau, gọi siêu giới SAR, giới Plantae nằm siêu giới Archaeplastida [13] CAAGGAGTCTAACATGCCTGCGAGTGTTTGGGTGGAAAACCCGAGCGCG TAATGAAAGTGAAAGTCGGGACCTCTGTCGTGGAGGGCACCGACGCCC GGACCTGACGTTCTCTGACGGATCCGCGGTAGAGCATGTATGTTGGGAC CCGAAAGTGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTC TGGTGGAGGCTCGTAGCGATTCTGACTCAAATTCCTCTCTTATAAAATGT TGAGGGGGATATC-3’ Trong vùng gen mã hóa cho ITS1, 5.8S ITS2 phần LSU 5’GCGGAAGGATCATTAACGAGTTCTGAAAGGGGTTGTAGCTGGCCTTCCG GGGCATGTGCACACCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTA GGTTTGGCGTGGGCTTCGGGGCCTCCGGGCTCTGAGGCATTCTGCCGGC CTATGTATCACTACAAACACATAAAGTAACAGAATGTATTCGCGTCTAA CGCATCTAAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGA GCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTCTCAACCCACACGTCCTTGTGAT GTTGCGGGCTTGGATTTGGAGGCTTGCTGGCCCTCTGCGGTCGGCTCCTC TTGAATGCATTAGCTTGATTCCGTGCGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATT GTCTACGCTGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCTGTAT GGGACAACTTCTTGACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-3’ Hình Kết BLAST GenBank nấm vân chi đỏ Bảng Trình tự rDNA lồi nấm lấy từ GenBank Tên loài Trametes sanguinea Chủng BRFM 1114 GENBANK Mã số GI Trametes ochracea 395406725 58081982 AY309019.1 32264086 AB158314.1 BCRC3638 JX082366.1 AB158313.1 Trametes hirsuta Trametes versicolor Mã số 58081983 Ganoderma lucidum CSAAS0801 FJ940919.1 282160438 Grifola frondosa AFTOL-ID701 AY854084.1 57232718 Hericium erinaceus KUMC 1023 AY534601.1 43468943 Tricholoma matsutake TM4 AB036891.1 6906741 Hypsizygus marmoreus 1196 FJ609257.1 222354344 Pleurotus cystidiosus PSUMCC609 AY315792.1 37222374 Pleurotus floridanus CCRC 36038 AY265832.1 30039376 Pleurotus eryngii 6690 AY450347.1 38426284 Lentinula edodes 50624-ACCC AY683137.1 56384664 AF036928.1 3169335 JN086661.1 357434866 Flammulina velutipes Volvariella volvacea Vv-4(V) File: 1309ZAA058.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:958 A:782 C:1039 T:825 Sample: 1309ZAA058_premix Lane: 58 Base spacing: 15.417789 1506 bases in 18256 scans Page of File: 1309ZAA058.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:958 A:782 C:1039 T:825 Sample: 1309ZAA058_premix Lane: 58 Base spacing: 15.417789 1506 bases in 18256 scans Page of File: 1309ZAA059.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:3397 A:3768 C:3943 T:2555 Sample: 1309ZAA059_premix Lane: 60 Base spacing: 15.3472805 625 bases in 7592 scans Page of File: 1309ZAA059.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:3397 A:3768 C:3943 T:2555 Sample: 1309ZAA059_premix Lane: 60 Base spacing: 15.3472805 625 bases in 7592 scans Page of File: 1309ZAA060.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:1572 A:1433 C:1388 T:1077 Sample: 1309ZAA060_premix Lane: 79 Base spacing: 15.524616 875 bases in 10648 scans Page of File: 1309ZAA060.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:1572 A:1433 C:1388 T:1077 Sample: 1309ZAA060_premix Lane: 79 Base spacing: 15.524616 875 bases in 10648 scans Page of ... danh, nuôi trồng khảo sát sơ hợp chất có hoạt tính sinh học loài vân chi đỏ phát Việt Nam Kết phân loại dựa hình thái rDNA xác định nấm vân chi đỏ phân lập Trametes sanguinea, sở cho việc phân. .. hay alkaloid… Ở Việt Nam, năm gần phát nhiều loài vân chi tự nhiên, có vân chi đỏ Tuy nhiên, nghiên cứu phân loại khảo sát chất có hoạt tính sinh học nấm có nguồn gốc từ Việt Nam cịn hạn chế... thể tạo vân đồng tâm, mặt có nhiều lỗ nhỏ Tùy theo màu sắc loài vân chi mà chúng gọi tên vân chi đen, vân chi đỏ, vân chi trắng…Hiện loài vân chi biết tới nhiều vân chi đen với thành phần có nhiều