Phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ bacillus sp rbd14 nội sinh cây dừa cạn (catharanthus roseus l ) có khả năng kháng staphylococcus aureus kháng methicillin (mrsa) atcc 43300

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH −−−−−−−− BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ Bacillus sp RBD14 NỘI SINH CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus L.) CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) ATCC 43300 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƢỢC GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH −−−−−−−− BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ Bacillus sp RBD14 NỘI SINH CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus L.) CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) ATCC 43300 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƢỢC THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài thực tập tốt nghiệp Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh - Trƣờng đại học Mở TP HCM, em có thêm đƣợc nhiều kinh nghiệm quý báu giúp thân rèn luyện thêm nhiều kỹ trình làm việc Đề tài em ngày hoàn thiện nhận đƣợc nhiều giúp đỡ từ phía, thầy cơ, anh chị, bạn gia đình Lời đầu tiên, em xin đƣợc trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Dƣơng Nhật Linh, thầy Nguyễn Văn Minh tận tình hƣớng dẫn, bảo ln sẵn lịng giúp đỡ, động viên em từ lúc hình thành đề tài hoàn thiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chị Trần Thị Á Ni chị Nguyễn Thị Thảo Nguyên bạn phịng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ giúp em giải khó khăn q trình làm đề tài Vì thời gian kiến thức cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi sai sót, kính mong q thầy, hƣớng dẫn đóng góp để đề tài em đƣợc hồn thiện Xin gửi lời cảm ơn đến tất ngƣời! ii THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 Tổng quan vi sinh vật nội sinh 1.1 Khái niệm 1.2 Vai trò vi sinh vật nội sinh 1.3 Tình hình nghiên cứu từ vi sinh vật nội sinh dƣợc liệu 1.4 Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật nội sinh dƣợc liệu Tổng quan Dừa cạn (Catharanth us roseus L.) 2.1 Sơ lƣợc Dừa cạn (Catharanthus roseus L.) 2.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dừa cạn Catharanthus roseus (L.) 2.3 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật nội sinh dừa cạn Catharanthus roseus (L.) Tổng quan vi khuẩn Bacillus 10 3.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu hợp chất sinh học có Bacillus 11 Tổng quan vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) 12 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 Vật liệu 14 1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 14 1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 14 1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất môi trƣờng 14 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 2.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 15 2.2 Thu dịch nội bào ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 Error! Bookmark not defined.15 2.3 Xác định khả kháng khuẩn từ dịch ngoại bào dịch nội bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 16 2.4 Khảo sát khả huyết giải chủng vi khuẩn nội sinh dừa cạn Catharanthus roseus (L.) 16 2.5 Thu nhận cao chiết từ chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 từ hệ dung môi khác 17 2.6 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA cao chiết phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch 18 2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết phƣơng pháp pha loãng 18 iii THỰC TẬP TỐT NGHIỆP 2.8 GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 19 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 21 3.2 Xác định khả kháng khuẩn từ dịch ngoại bào dịch nội bào 22 3.3 Khảo sát khả huyết giải chủng vi khuẩn nội sinh dừa cạn 23 3.4 Thu nhận cao chiết từ chủng vi khuẩn từ hệ dung môi khác 24 3.5 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA cao chiết phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch 26 27 3.6 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết phƣơng pháp pha loãng 28 3.7 Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết 29 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 Kết luận 31 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 Tài liệu tiếng Việt 32 Tài liệu tiếng Anh 32 Nguồn Internet 39 PHỤ LỤC 40 iv THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) .6 Hình 1.2: Vi thể Bacillus đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi 10 Hình 3.1 : Đại thể Bacillus sp RBD14 mơi trƣờng NA .21 Hình 3.2: Vi thể Bacillus sp RBD14 đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi vật kính 100x 21 Hình 3.3: Kết kháng MRSA từ dịch ngoại bào chủng Bacillus sp RBD14 22 Hình 3.4: Khả tiêu huyết chủng Bacillus sp RBD14 23 Hình 3.5: Dịch chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 sau ly tâm 24 Hình 3.6: Thiết bị quay .25 Hình 3.7: Dịch chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 sau đun .26 Hình 3.8: Khả kháng MRSA cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 từ loại dung môi môi trƣờng MHA 28 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ thu nhận cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 .18 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1:Kết khảo sát vòng kháng khuẩn từ dịch ngoại hay nội bào Bacillus sp RBD14 22 Bảng 3.2: Khối lƣợng cao chiết thu đƣợc từ 50 ml dịch chiết 25 Bảng 3.3: Số đo vòng kháng MRSA cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 môi trƣờng MHA 27 Bảng 3.4:Nồng độ ức chế tối thiểu loại cao chiết từ chủng Bacillus sp RBD14 kháng MRSA .29 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Số đo vòng kháng MRSA cao chiết từ loại dung môi .27 v THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh DANH MỤC VIẾT TẮT Cộng Cs., Dimethyl sulfoxide: DMSO Minimum Inhibitory Concentration: MIC Mueller Hinton Agar: MHA Nutrient Agar: NA Dichlomethane: Di Hexan: He Methanol: Me Chloroform: Chlo Etyl axetat EA Staphylococcus aureus kháng Methicillin MRSA vi THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc sức khỏe cộng đồng tồn giới (Kưck cs., 2010) MRSA có khả gây tử vong bao gồm viêm phổi đe dọa tính mạng, viêm cân nang chân hoại tử, viêm nội tâm mạc, viêm tủy xƣơng, nhiễm trùng huyết nặng nhiễm độc tố nhƣ hội chứng sốc nhiễm độc (Moneck cs., 2011) Một vài nghiên cứu cho thấy chủng MRSA gần có khả kháng loại kháng sinh nhƣ: Vacomycin (Okwu cs., 2019), daptomycin (Roch cs., 2017), linezolizd (Caballero cs., 2015) Vì phát triển kháng thuốc khơng thể tránh khỏi tất loại thuốc kháng sinh có, nên liệu pháp liên tục đƣợc phát triển (Vestergaard cs., 2019) Nhiều nghiên cứu chứng minh đƣợc chiết xuất từ vi sinh vật nội sinh dƣợc liệu có hoạt tính sinh học có tiềm vƣợt trội, số chứng minh đƣợc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chống virus (Makuwa cs., 2021) Một nghiên cứu gần cho thấy chiết xuất từ Bacillus amyloliquefaciens RD26 nội sinh diệp hạ châu đắng có khả kháng MRSA với vòng ức chế 25 ± 0.57 mm, đó, hợp chất BR04 (pyrimidine–2,4-d) đƣợc tinh chế từ chiết xuất Bacillus amyloliquefaciens RD26 có khả kháng MRSA cao (Nguyễn Văn Minh cs., 2021) Theo Koul cộng (2013), hệ vi sinh vật nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus) có khả tạo hợp chất có hoạt tính sinh học nhƣ alkanoid, terpenoid, flavonoid, steroid nguồn cung cấp chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị cho y học (Koul cs., 2013) Năm 2015, Kumar cộng phân lập vi sinh vật nội sinh loại dƣợc liệu khác nhau: sầu đau (Azadirachta indica), trâm bầu (Terminalia arjuna) dừa cạn (Catharanthus roseus), kết có 14 loại nấm loại vi khuẩn đƣợc phân lập Trong đó, chủng vi khuẩn NRL2 có khả kháng lại S aureus Dịch chiết vi khuẩn NRL2 có hoạt động kháng khuẩn hiệu quả, dịch chiết tạo vùng ức chế 33 mm S.aureus (Kumar cs., 2015) Chính gia tăng phát triển Staphylococcus aureus kháng THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh methicillin nên việc tìm sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật nội sinh có khả chống lại tác nhân kháng kháng sinh điều cần thiết Kế thừa kết từ cơng trình nghiên cứu trƣớc khả kháng MRSA hệ vi sinh vật nội sinh dƣợc liệu, tiến hành thực đề tài “Đánh giá sơ khả kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) ATCC 43300 từ cao tổng chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L.)” Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá sơ khả kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) ATCC 43300 từ cao tổng chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L.) Nội dung nghiên cứu  Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L.)  Khảo sát khả kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) từ dịch nội bào ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L.)  Thu cao chiết từ dịch nội bào ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14  Xác dịnh sơ khả kháng kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh PHẦN 1: TỔNG QUAN THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh Bảng 3.3 Số đo vòng kháng MRSA cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 mơi trƣờng MHA Cao chiết Vịng kháng khuẩn (mm) Methanol 17,67 ± 1,53a Ethyl acetate 16,34 ± 1,52a Dichloromethane n-hexane Chloroform Trong cột giá trị có mẫu tự khơng khác biệt mức ý nghĩa % qua phép thử Duncan (a, b: thể mức độ khác qua thống kê) Số đo vòng kháng (mm) 20 18 16 14 12 10 Số đo vòng kháng (mm) Biểu đồ 3.1 Số đo vòng kháng MRSA cao chiết từ loại dung môi SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 27 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh H nh 3.8 Khả kháng MRSA cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 từ loại dung môi môi trƣờng MHA Từ kết bảng 3.3, biểu đồ 3.1 hình 3.8 cho thấy có cao chiết từ loại dung môi methanol ethyl acetate có khả kháng lại MRSA Tuy nhiên, cao chiết từ dung mơi methanol lại kháng MRSA với đƣờng kính 17,67 ± 1,52 mm lớn cao chiết từ dung mơi ethyl acetate (đƣờng kính 16,34 ± 1,52 mm) Kết cho thấy cao chiết từ dung môi methanol có tiềm việc kháng MRSA 3.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết phƣơng pháp pha loãng Từ kết thí nghiệm thử khả kháng MRSA từ cao chiết chủng Bacillus sp RBD14 từ loại dung môi phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch, nhận thấy có loại cao chiết từ chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 có khả kháng MRSA Do đó, tiến hành thực xác định nồng độức chế tối thiểu (MIC) để kiểm tra lại khả kiềm hãm phát triển MRSA cao chiết chủng Bacillus sp RBD14 Kết thể bảng 3.4 SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 28 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh Bảng 3.4 Nồng độ ức chế tối thiểu loại cao chiết từ chủng Bacillus sp RBD14 kháng MRSA Thứ tự giếng 10 11 12 Cao 512 256 128 64 32 16 0,5 0,25 chiết μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ μg/ mL mL mL mL mL mL mL mL mL mL mL mL EA + + - - - - - - - - - - Me + + + - - - - - - - - - +: kháng; -: không kháng Từ kết bảng 3.4, nhận thấy cao chiết chủng Bacillus sp RBD14 đƣợc chiết từ dung mơi ethyl acetate, methanol có khả ức chế phát triển MRSA Kết cho thấy giá trị MIC cao chiết ethyl acetat 256 μg/mL, cao chiết methanol 128 μg/mL Theo nghiên cứu Chalasani cộng (2015) tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu hợp chất đƣợc tinh chế từ Bacillus sp kháng MRSA khoảng 0,3–16 μg/mL Từ kết mục 3.6 3.7, định chọn cao chiết methanol để tiếp tục cho nghiên cứu 3.8 Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết Vì thời gian thực nghiệm hạn chế, vừa phải học thực hành vừa phải cách ly nhiều lần thuộc diện f1 nên chƣa tiến hành xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu cao chiết Tuy nhiên, có thời gian thực tiếp tục đề tài để khảo sát đƣợc đầy đủ nội dung SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 29 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 30 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh Kết luận Với kết thực nghiệm mà thu nhận đƣợc nhƣ trình bày trên, chúng tơi có kết luận sau: − Dịch ngoại bào vi khuẩn Bacillus sp RBD14 có khả kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) có đƣờng kính 18,67 ± 1,53 mm − Chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 khơng có khả tan huyết − Cao chiết từ dung mơi methanol eathyl acetate có khả kháng lại vi khuẩn Bacillus sp RBD14 Trong cao chiết từ methanol có khả kháng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 với đƣờng kính 17,67 ± 1,52 mm − Kết MIC từ cao chiết thu đƣợc từ dung môi methanol ức chế vi khuẩn Bacillus sp RBD14 128 μg/ ml Đề nghị Kết đề tài tiền đề cho cơng trình nghiên cứu xác định hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ vi sinh vật Để hồn thiện cho cơng trình nghiên cứu, chúng tơi có đề nghị nhằm củng cố thêm kết mà đề tài đạt đƣợc nhƣ hƣớng phát triển: - Tiếp tục khảo sát nồng độ diệt khuẩn tối thiểu cao chiết từ vi khuẩn Bacillus sp RBD14 − Thử nghiệm thêm số hoạt tính sinh học nhƣ: khả chống oxy hóa, khả tạo màng sinh học biofilm, hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thƣ − Thu nhận hợp chất có chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 phƣơng pháp sắc kí cột silica gel tiến hành nhận định hợp chất phƣơng pháp phân tích khối phổ IR MS − Khảo sát khả kháng khuẩn từ hợp chất có chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 31 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hằng, C T T., Hiếu, V M N., Thịnh, P Đ., Linh, N N., Thuất, N Đ., & Vân, T T T (2021) Khảo sát điều kiện lên men chủng vi khuẩn biển Bacillus velezensis AlgSm1 để thu nhận alginate lyase Bản B Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 63(3) Giang, T P T Tác dụng kỳ diệu Dừa cạn với bệnh ung thƣ Viện Nghiên cứu phát triển y dược cổ truyền Việt Nam Nguyễn Hồng Ái Vy, Nguyễn Hữu Hiệp (2019) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn nội sinh có khả kháng khuẩn chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 81-88 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Phƣơng pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Van, T H., & Tu, H L (2019) Phân lập định danh vi khuẩn nội sinh diếp cá (Houttuynia cordata Thunb, Saururaceae) tỉnh Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ngƣời Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55(CĐ Công nghệ Sinh học), 166-173 Tài liệu tiếng Anh Arun Kumar G., Robert Antony A., V Rajesh Kannan., 2015, “Exploration of endophytic microorganisms from selected medicinal plants and their control potential to multi drug resistant pathogens”, Journal of Medicinal Plants Studies 3(2), pp 49-57 Balaban N, Collins LV, Cullor JS, Hume EB, MedinaAcosta E, Motta OV, O'Callaghan R, Rossitto PV, Shirtliff ME, Silveira LS, Tarkowski A, Torres JV Prevention of diseases caused by Staphylococcus aureus using the peptide RIP Peptides, 21: 1301-1311 (2000) SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 32 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M (1966) Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method Am J Clin Pathol 36:493–496 Barrales-Cureño, H J., Reyes, C R., García, I V., Valdez, L G L., De Jesús, A G., Cortés Ruíz, J A., & Espinoza Perez, J (2019) Alkaloids of pharmacological importance in Catharanthus roseus (Vol 1, p 18) Intech Open Ltd.: London, UK 10 Barsby, T., Kelly, M T., Gagné, S M., & Andersen, R J (2001) Bogorol A produced in culture by a marine Bacillus sp reveals a novel template for cationic peptide antibiotics Organic letters, 3(3), 437-440 11 Bozdogan B, Esel D, Whitener C Antibacterial susceptibility of a vancomycinresistant Staphylococcus aureus strain isolated at the Hershey Medical Center J Antimicrob Chemother, 52: 864-868(2003) 12 Caballero, B., Finglas, P., & Toldrá, F (2015) Encyclopedia of food and health Academic Press 13 Chalasani, A G., Dhanarajan, G., Nema, S., Sen, R., & Roy, U (2015) An antimicrobial metabolite from Bacillus sp.: significant activity against pathogenic bacteria including multidrug-resistant clinical strains Frontiers in microbiology, 6, 1335 14 Clinical and Laboratory Standards Institute 2006 Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved Standard 7th ed CLSI Document M7-A7 Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA 15 Clinical and Laboratory Standards Institute 2009 Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard, 8th ed M07-A8 CLSI, Wayne, PA 16 Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., & Dua, T K (2015) Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry Journal of pharmaceutical analysis, 5(2), 75-84 17 Jeyanthi, V., & Velusamy, P (2016) Anti-methicillin resistant Staphylococcus aureus compound isolation from halophilic Bacillus amyloliquefaciens MHB1 SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 33 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh and determination of its mode of action using electron microscope and flow cytometry analysis Indian journal of microbiology, 56(2), 148-157 18 Gerard, J M., Haden, P., Kelly, M T., & Andersen, R J (1999) Loloatins A− D, cyclic decapeptide antibiotics produced in culture by a tropical marine bacterium Journal of natural products, 62(1), 80-85 19 Ghahremani, M., Jazani, N H., & Sharifi, Y (2018) Emergence of vancomycin-intermediate and-resistant Staphylococcus aureus among methicillin-resistant S aureus isolated from clinical specimens in the northwest of Iran Journal of global antimicrobial resistance, 14, 4-9 20 Guo, B., Wang, Y., Sun, X., & Tang, K (2008) Bioactive natural products from endophytes: a review Applied Biochemistry and Microbiology, 44(2), 136-142 21 Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC Methicillinresistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility J Antimicrob Chemother, 40: 135-136 (1997) 22 Idris, A M., Al-tahir, I., & Idris, E (2013) Antibacterial activity of endophytic fungi extracts from the medicinal plant Kigelia africana Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, G Microbiology, 5(1), 1-9 23 Kaul, S., Gupta, S., Ahmed, M., & Dhar, M K (2012) Endophytic fungi from medicinal plants: a treasure hunt for bioactive metabolites Phytochemistry reviews, 11(4), 487-505 24 Korkina, L G (2007) Phenylpropanoids as naturally occurring antioxidants: from plant defense to human health Cellular and molecular biology, 53(1), 15-25 25 Koul, M., Lakra, N S., Chandra, R., & Chandra, S (2013) Catharanthus roseus and prospects of its endophytes: a new avenue for production of bioactive metabolites International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 4(7), 2705-2716 26 Köck, R., Becker, K., Cookson, B., van Gemert-Pijnen, J E., Harbarth, S., Kluytmans, J A J W., & Friedrich, A W (2010) Methicillin-resistant SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 34 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh Staphylococcus aureus (MRSA): burden of disease and control challenges in Europe Eurosurveillance, 15(41), 19688 27 Kumar, A., Antony, A R., & Kannan, V R (2015) Exploration of endophytic microorganisms from selected medicinal plants and their control potential to multi drug resistant pathogens Journal of Medicinal Plants Studies, 3(2), 49-57 28 Kusari S, Lamshoft M, Zuhlke S, Spiteller M (2008) An endophytic fungus from Hypericum perforatum that produces hypericin J Nat Prod 71:159–162 29 Li, J., Zhao, G Z., Chen, H H., Wang, H B., Qin, S., Zhu, W Y., & Li, W J (2008) Antitumour and antimicrobial activities of endophytic streptomycetes from pharmaceutical 30 Liu X, Dong M, Chen X, Jiang M, Lv X, Yan G (2007) Antioxidant activity and phenolics of an endophytic Xylaria sp from Ginkgo biloba Food Chem 105:548–554 31 Makuwa, S C., & Serepa-Dlamini, M H (2021) The Antibacterial Activity of Crude Extracts of Secondary Metabolites from Bacterial Endophytes Associated with Dicoma anomala International Journal of Microbiology, 2021 32 Mataraci, E., & Dosler, S (2012) In VitroActivities of Antibiotics and Antimicrobial Cationic Peptides Alone and in Combination against MethicillinResistant Staphylococcus Chemotherapy, 56(12), aureus Biofilms Antimicrobial Agents and 6366–6371 doi:10.1128/aac.01180-12 plants in rainforest Letters in applied microbiology, 47(6), 574-580 33 Monecke, S., Coombs, G., Shore, A C., Coleman, D C., Akpaka, P., Borg, M., & Ehricht, R (2011) A field guide to pandemic, epidemic and sporadic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus PloS one, 6(4), e17936 34 Monecke, S., Ehricht, R., Slickers, P., Wernery, R., Johnson, B., Jose, S., & Wernery, U (2011) Microarray-based genotyping of Staphylococcus aureus isolates from camels Veterinary Microbiology, 150(3-4), 309-314 35 Mousa, W K., Schwan, A., Davidson, J., Strange, P., Liu, H., Zhou, T., & Raizada, M N (2015) An endophytic fungus isolated from finger millet SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 35 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh (Eleusine coracana) produces anti-fungal natural products Frontiers in microbiology, 6, 1157 36 Mickymaray, S., Alturaiki, W., Al-Aboody, M S., Mariappan, P., Rajenderan, V., Alsagaby, S A., & Alarfajj, A A (2018) Anti-bacterial efficacy of bacteriocin produced by marine Bacillus subtilis against clinically important extended spectrum beta-lactamase strains and methicillin-resistant Staphylococcus aureus International Journal of Medical Research & Health Sciences, 7(2), 75-83.Millette, M., Dupont, C., Archambault, D., & Lacroix, M (2007) Partial characterization of bacteriocins produced by human Lactococcus lactis and Pediococccus acidilactici isolates Journal of applied microbiology, 102(1), 274-282 37 Misra, P., & Kumar, S (2000) Emergence of periwinkle Catharanthus roseus as a model system for molecular biology of alkaloid: Phytochemistry, pharmacology, plant biology and in vivo and in vitro cultivation J Med Arom Plant Sci, 22, 306-37 38 Molina, G., Pimentel, M R., Bertucci, T C., & Pastore, G M (2012) Application of fungal endophytes in biotechnological processes Chem Eng Trans, 27 39 Mukhopadhyay, M., & Adhikari, M (2020) Endophytic of Catharathus roseus: A protential source of plant growth promoters and antimocrobial compounds Journal of Advanced Scientific Research, 11(2) 40 Myo E M., Maung C E H., Mya K M., & Khai, A A (2020) Characterization of bacterial endophytes from Myanmar medicinal plants for antimicrobial activity against human and plant pathogens Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 56 41 Nair, D N., & Padmavathy, S (2014) Impact of endophytic microorganisms on plants, environment and humans The Scientific World Journal, 2014 42 Nongkhlaw, F M., & Joshi, S R (2015) Investigation on the bioactivity of culturable endophytic and epiphytic bacteria associated with ethnomedicinal plants The Journal of Infection in Developing Countries, 9(09), 954-961 SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 36 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh 43 Ng, K R., Lyu, X., Mark, R., & Chen, W N (2019) Antimicrobial and antioxidant activities of phenolic metabolites from flavonoid-producing yeast: Potential as natural food preservatives Food Chemistry, 270, 123-129 44 Nguyen, Q D., Truong, P M., Vo, T N T., Chu, T D X., & Nguyen, C H (2020) Draft genome sequence data of Streptomyces sp SS1-1, an endophytic strain showing cytotoxicity against the human lung cancer A549 cell line Data in brief, 30, 105497 45 Okwu, M U., Olley, M., Akpoka, A O., & Izevbuwa, O E (2019) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and anti-MRSA activities of extracts of some medicinal plants: A brief review AIMS microbiology, 5(2), 117 46 Ong, H C., Ahmad, N., & Milow, P (2011) Traditional medicinal plants used by the temuan villagers in Kampung Tering, Negeri Sembilan, Malaysia Studies on Ethno-Medicine, 5(3), 169-173 47 Patel, D K., Kumar, R., Laloo, D., & Hemalatha, S (2012) Natural medicines from plant source used for therapy of diabetes mellitus: An overview of its pharmacological aspects Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2(3), 239250 48 Photolo, M M., Mavumengwana, V., Sitole, L., & Tlou, M G (2020) Antimicrobial and antioxidant properties of a bacterial endophyte, methylobacterium radiotolerans MAMP 4754, isolated from combretum erythrophyllum seeds International journal of microbiology, 2020 49 Pham, H N T., Vuong, Q V., Bowyer, M C., & Scarlett, C J (2020) Phytochemicals derived from Catharanthus roseus and their health benefits Technologies, 8(4), 80 50 FITRI, D S., PANGASTUTI, A., Susilowati, A R I., & SUTARNO, S (2017) Endophytic bacteria producing antibacterial against methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) in seagrass from Rote Ndao, East Nusa Tenggara, Indonesia Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 18(2), 733740 SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 37 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh 51 Roch, M., Gagetti, P., Davis, J., Ceriana, P., Errecalde, L., Corso, A., & Rosato, A E (2017) Daptomycin resistance in clinical MRSA strains is associated with a high biological fitness cost Frontiers in microbiology, 8, 2303 52 Roy, S., & Banerjee, D (2015) Broad spectrum antibacterial activity of granaticinic acid, isolated from Streptomyces thermoviolaceus NT1; an endophyte in Catharanthus roseus (L.) G Don Don J Appl Pharm Sci, 5, 611 53 Russell, F M., Biribo, S S N., Selvaraj, G., Oppedisano, F., Warren, S., Seduadua, A., & Carapetis, J R (2006) As a bacterial culture medium, citrated sheep blood agar is a practical alternative to citrated human blood agar in laboratories of developing countries Journal of clinical microbiology, 44(9), 3346-3351 54 Sain, M., & Sharma, V (2013) Catharanthus roseus (an anti-cancerous drug yielding plant)-a review of potential therapeutic properties International Journal of Pure & Applied Bioscience, 1(6), 139-142 55 Santoyo, G., Moreno-Hagelsieb, G., del Carmen Orozco-Mosqueda, M., & Glick, B R (2016) Plant growth-promoting bacterial endophytes Microbiological research, 183, 92-99 56 Silva, G H., Teles, H L., Zanardi, L M., Young, M C M., Eberlin, M N., Hadad, R., & Araújo, Â R (2006) Cadinane sesquiterpenoids of Phomopsis cassiae, an endophytic fungus associated with Cassia spectabilis (Leguminosae) Phytochemistry, 67(17), 1964-1969 57 Singh, R., & Dubey, A K (2020) Isolation and characterization of a new endophytic actinobacterium Streptomyces californicus strain ADR1 as a promising source of anti-bacterial, anti-biofilm and antioxidant metabolites Microorganisms, 8(6), 929 58 Strobel, G (2006) Harnessing endophytes for industrial microbiology Current opinion in microbiology, 9(3), 240-244 SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 38 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh 59 Taher, Z M., Agouillal, F., Marof, A Q., Dailin, D J., Nurjayadi, M., Razif, E N., & El Enshasy, H A (2019) Anticancer Molecules from Catharanthus roseus Indonesian Journal of Pharmacy, 30(3), 147 60 Tang, M., Gong, M., Xu, C., Wu, S., & Liu, F (2014) Identification and crude protein extract of endophytic bacteria strain KLXD06 antagonistic against MRSA isolated from Hemsleya sinesis Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 27(4) 61 Tiong, S H., Looi, C Y., Hazni, H., Arya, A., Paydar, M., Wong, W F., & Awang, K (2013) Antidiabetic and antioxidant properties of alkaloids from Catharanthus roseus (L.) G Don Molecules, 18(8), 9770-9784 62 Turnbull, P C., Kramer, J M., & Melling, J (1996) Bacillus Medical microbiology 63 Van Minh, N., Phat, N T., & Linh, D N (2021) Purification of bioactive compound from endophytes Bacillus sp RD26 of Phyllanthus amarus Schum et Thonn Pharmacophore, 12(3) 64 Van Bergen, M A., & Snoeijer, W (1996) Revision of Catharanthus G Don: Series of Revisions of Apocynaceae XLI Wageningen Agricultural University 65 Vestergaard, M., Frees, D., & Ingmer, H (2019) Antibiotic resistance and the MRSA problem Microbiology spectrum, 7(2), 7-2 66 Yu, A., Loo, J F., Yu, S., Kong, S K., & Chan, T F (2014) Monitoring bacterial growth using tunable resistive pulse sensing with a pore-based technique Applied microbiology and biotechnology, 98(2), 855-862 67 Zhang, H W., Song, Y C., & Tan, R X (2006) Biology and chemistry of endophytes Natural product reports, 23(5), 753-771 Nguồn Internet https://thaoduocdainam.com/wp-content/uploads/2020/12/dc.jpg https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS3OYUYLIjXM_W88YEFa_c4eUcDF80E6_juQ&usqp=CAU SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 39 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh PHỤ LỤC Kết thống kê vi khuẩn Bacillus sp RBD14 kháng MRSA SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 40 THỰC TẬP TỐT NGHIỆP GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh ThS Nguyễn Văn Minh Kết thống kê cao chiết vi khuẩn Bacillus sp RBD14 kháng MRSA SVTH: Nguyễn Trần Ngọc Dung 41 ... Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L. ) Nội dung nghiên cứu  Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L. )  Khảo sát khả kháng Staphylococcus. .. khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L. )? ?? Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá sơ khả kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) ATCC 43300 từ cao tổng chủng vi khuẩn Bacillus. .. aureus kháng Methicillin (MRSA) từ dịch nội bào ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L. )  Thu cao chiết từ dịch nội bào ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus