đồ án tốt nghiệp tách chiết và bảo quản adn của tôm sú (penaeus monodon)

Phức hợp nucleoprotein cuộn lại th ành nhiễm sắc thể Do vai trò quan trọng của ADN trong hoạt động sống của sinh vật tham giavào các quá trình cơ bản của sự sống như việc sinh tổng hợp p

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin cảm ơn người cha quá cố của con, mẹ v à những người thânyêu của con đã nuôi nấng, dạy dỗ con nên người Cảm ơn ba mẹ đã luôn dành tìnhyêu thương, sự chăm sóc tốt nhất cho con, chắp cánh niềm tin cho con v ào đời

Em xin cảm ơn ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, viện nghiên cứuCông nghệ sinh học & Môi trường đã tạo điều kiện tốt nhất cho em đ ược học tập vàrèn luyện trong suốt 4 năm qua

Em xin chân thành c ảm ơn các thầy cô đã luôn tận tâm dạy dỗ chúng em,truyền đạt cho chúng em những kiến thức mới

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, cô ThS.Nguyễn Thị Hiệp đã tận tình chỉ dẫn cho em trong những b ước đầu làm quen vớinghiên cứu, truyền cho em niềm say m ê khoa học và giúp em thực hiện đề tài này

Em xin cảm ơn công ty TNHH SX -TM-DV Nam Khoa, thầy TS.BS PhạmHùng Vân cùng các anh ch ị làm việc ở công ty đã tạo điều kiện cho em đ ược thựctập tại công ty Em cảm ơn chị Trang, chị Yến đã ân cần chỉ dạy cho em từ nhữngthao tác nhỏ nhất, giúp đỡ em hoàn thành đề tài này

Và cuối cùng, mình muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả những người bạn thânthiết đã luôn chia sẻ những niềm vui, nỗi buồn c ùng với mình trong suốt thời sinhviên

Một lần nữa, xin chân th ành cảm ơn!

Nha Trang, 06/2009

Sinh viên thực hiện Đào Hoài Thu

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Danh mục các thuật ngữ viết tắt vi

Lời mở đầu 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHI ÊN CỨU 2

1.1 Cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể 2

1.2 Tách chiết ADN 5

1.3 Bảo quản ADN 6

1.4 Gen cytochrome b 13

1.5 Tôm sú 15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu, cách thu và bảo quản mẫu 19

2.2 Phương pháp nghiên c ứu 19

2.2.1 Tách chiết ADN tôm sú 20

2.2.2 Phản ứng PCR 21

2.2.3 Kỹ thuật điện di 22

2.2.4 Giải trình tự 23

2.2.4.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 23

2.2.4.2 Chạy chu trình nhiệt 24

2.2.4.3 Tủa sản phẩm chu trình nhiệt 24

2.2.4.4 Giải trình tự tự động 25

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Đánh giá chất lượng ADN sau khi bảo quản bằng kỹ thuật điện di 28

3.1.1 Loạt mẫu I 28

3.1.2 Loạt mẫu II 29

3.1.3 Loạt mẫu III 32

3.2 Đánh giá chất lượng ADN sau khi bảo quản bằng phản ứng PCR 34

3.2.1 Loạt mẫu I 34

3.2.2 Loạt mẫu III 36

3.3 Đánh giá bảo quản ADN qua giải tr ình tự 39

Kết luận và đề xuất ý kiến 45

Tài liệu tham khảo 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Bảng mức độ t ương đồng giữa các trình tự 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của một nucleotide 2

Hình 1.2 Hai mạch đối song song 3

Hình 1.3 Phức hợp nucleoprotein cuộn lại th ành nhiễm sắc thể 5

Hình 1.4 Cấu trúc của phân tử protein Cyt b 14

Hình 1.5 Tôm sú Penaeus monodon 15

Hình 3.1 Ảnh điện di dịch ly trích ADN tổng số của loạt mẫu I sau khi bảo quản 28

Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II sau bảo quản (mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) 29

Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II sau bảo quản (mẫu 9, 10) 30

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II tr ước khi bảo quản (mẫu 1, 2) 30

Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II tr ước khi bảo quản (mẫu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 31

Hình 3.6 Ảnh điện di dịch ly trích ADN tổng số của loạt mẫu III sau khi bảo quản 32

Hình 3.7 Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu I sau khi bảo quản (mẫu 1, 2) 34

Hình 3.8 Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu I sau khi bảo quản (mẫu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 34

Hình 3.9 Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu III sau khi bảo quản (mẫu 1, 2, 3) 37

Hình 3.10 Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b lo ạt mẫu III sau khi bảo quản (mẫu 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 37

Hình 3.11 Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu III tr ước khi bảo quản (mẫu 1, 2, 3, 4, 5) 38

Hình 3.12 Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu III tr ước khi bảo quản (mẫu 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10) 39 1A

550 bp

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

EDTA ethylene di-amine tetra-acetic acid

FDA Food and Drug Administration

P/C/I Phenol/Chloroform/Isoamyl Alco hol

PCR Polymerase Chain Reaction

rARN ribosomal acid ribonucleic

SDS Sodium dodecyl sulfate

SLS Solution Loading Sequencing

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam với 3260 km bờ biển, hơn 150000 ha có khả năng nuôi tôm nước

lợ đã trở thành một trong những nước có ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sảnphát triển Trong đó tôm sú chiếm ưu thế rất lớn Hiện tại, loài này được nuôi ở hơn

22 quốc gia trên thế giới, đóng vai trò rất quan trọng trong việc cải thiện đời sốngcủa các cộng đồng dân c ư ven biển và tạo nguồn thu ngoại tệ Năm 2000 sản lượngtôm sú nuôi đạt 571.5 nghìn tấn, chiếm 52.3% tổng sản l ượng các loại tôm (FAO ,2002) Ở nước ta, trị giá xuất khẩu to àn ngành thủy sản là 850 triệu USD (1998),trong đó tôm sú chiếm khoảng 50 – 60% trị giá kim ngạch này Tuy nhiên nguồntôm bố mẹ của tôm sú dựa ho àn toàn vào khai thác tự nhiên Sự lệ thuộc vào nguồntôm bố mẹ khai thác từ tự nhi ên và tình trạng khan hiếm của nguồn cung cấp n ày đãtrở thành một trong những trở ngại lớn nhất cho nghề nuôi tôm sú tr ên toàn thế giới

và cản trở quá trình thuần hoá đối tượng này Tôm sú nuôi nhân tạo thường có tỷ lệthành thục thấp, sức sinh sản không cao v à sức sống con non kém h ơn so với tômbắt từ ngoài tự nhiên Điều này dẫn đến tình trạng nguồn cá thể bố mẹ bị khai tháccạn kiệt và phá vỡ cấu trúc quần thể tự nhiên của tôm sú Thêm vào đó, vi ệc pháttriển khu nuôi tự phát, không quy hoạch đ ã gây ra các vấn đề về môi trường, sự lantràn của dịch bệnh làm cho nguồn tôm bố mẹ này càng bị đe dọa Do vậy, công tácbảo tồn nguồn gen tôm sú rất quan trọng để lưu giữ những gen quý nhằm mục đíchkinh tế hay làm đa dạng nguồn gen, hệ sinh thái thuỷ sản

Được sự cho phép của Viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Tr ường và thầyPGS.TS Ngô Đăng Ngh ĩa, cô ThS Nguyễn Thị Hiệp, tôi thực hiện đề t ài nghiên

cứu: “Tách chiết và bảo quản ADN của tôm sú ( Penaeus monodon)” với mục

tiêu là tách chiết ADN tổng số của tôm sú v à kiểm tra chất lượng ADN tôm sú sauthời gian bảo quản khác nhau, ở những điều kiện khác nhau để xác định điều kiệnphù hợp cho bảo quản ADN tô m sú, phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHI ÊN CỨU

1.1 Cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể [2]

Phân tử ADN, vật chất mang thông tin di truyền của hầu hết sinh vật, l à mộtchuỗi xoắn kép gồm hai sợi đơn, mỗi sợi đơn là một chuỗi polymer hình thành từnhững monomer là nucleotide Mỗi một nucleotide gồm có gốc phosphoric acid,đường 5-desoxyribose, và 1 trong 4 nitrogenous base ( hai purine là adenine (A),guanine (G) và hai pyrimidi ne là cytosine (C), thymine (T)) Tính đặc hiệu củanucleotide do base quy ết định, nên khi nói tới nucleic acid, base th ường được dùngthay cho nucleotide Cách g ọi thường dùng là cặp base, kí hiệu bp (base pair) hay

kb (kolibase – 1000 cặp base)

Hình 1.1 Cấu trúc của một nucleotide

Mô hình xoắn kép của ADN bao gồm hai mạch polynucleotide bắt cặp bổsung tạo thành lò xo xoắn kép quanh trục giữa, mỗi b ước xoắn của lò xo dài 34 Å

Hai mạch được gắn với nhau bằng các li ên kết hydro giữa các base đối diệnvới nhau theo nguyên tắc bổ sung trong từng cặp: đối diện adenine l à thymine vàđối diện với guanine l à cytosine Các base purin và pyrimidine có c ấu trúc phẳng,mặt phẳng của chúng xếp vuông góc với trục d ài của mạch polynucleotide và chúngchồng cái này lên cái kia, khoảng cách trung tâm của hai mặt phẳng kề nhau l à3.4Å.

Như vậy, phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép mà hai mạch gồm khungđường xen kẽ với các nhóm phosphate, đ ược gắn với nhau nhờ các li ên kết hydrogiữa adenine với thymine ở mạch đối diện và giữa guanine với cytosine ở mạch đốidiện

Hình 1.2 Hai mạch đối song song Các base của nucleic acid bắt cặp bổ sung: A bắt cặp với T bằng 2 li ên kết

hydro và G bắt cặp với C bằng 3 liên kết hydro

Kích thước phân tử ADN rất khác nhau, có phân tử có kích th ước rất lớn, dàihơn cả triệu cặp nucleotide, lớn h ơn cả phân tử protein nh ư phát hiện củaCarpersson năm 1930 nhưng c ũng có những phân tử rất nhỏ, chỉ chứa khoảng v àinghìn nucleotide Tất cả sinh vật đều có chung một cấu trúc ADN Tính đặc tr ưng

của ADN của một loài biểu hiện ở trình tự sắp xếp các nucleotide dọc theo chiều d ài

và số lượng của chúng

Trong tế bào Eukaryote, ADN nằm trong nhân ở dạng mạch thẳng d ưới dạngnhiễm sắc thể, hoặc nằm ở t rong ty thể và lục lạp dưới dạng mạch vòng Tuy nhiên,

dù ở dạng nào thì các phân tử ADN này đều tồn tại theo kiểu cuộn chặt

ADN Eukaryote có kích thư ớc rất lớn (ví dụ, ADN ở ng ười có thể dài đến1m) nên phân tử này phải được nén chặt ở nhiều mức độ khác nhau, mức độ thấpnhất là nucleosome và mức độ cao nhất là cấu trúc nhiễm sắc chất Các nhiễm sắcthể của Eukaryote có tổ chức phức tạp gồm ADN v à nhiều loại protein gắn v ào.Trong số đó, histon là những protein nhỏ chứa nhiều aminoacid mang điện tíchdương (lysine và arginine) nên g ắn chặt với ADN điện tích âm, protein giữ vai tròcốt lõi trong việc cuộn lại và điều hoà hoạt tính ADN Các nhiễm sắc thể có sốlượng và hình dạng đặc trưng cho tế bào của mỗi loài sinh vật

Sự hình thành nhiễm sắc thể kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép ADN qua hệ thốngcác bậc cấu trúc sau:

 Nucleosome là đơn v ị cấu trúc của nhiễm sắc thể đ ược tạo nên do sợiADN dài quấn quanh các protein histon, h ình thành sợi 11nm Đơn vị này là phứchợp gồm 146 cặp base của ADN quấn quanh 8 phân tử h iston Các nucleosome k ềnhau được nối qua một phân tử histon trung gian

 Sợi chromatin dày 30 nm: các nucleosome x ếp khít nhau tạo thành phứchợp nucleoprotein

 Vùng xếp cuộn dày 300 nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốnkhúc tạo nên

 Chất dị nhiễm sắc 700 nm

 Nhiễm sắc thể kỳ giữa 1400 nm

Hình 1.3 Phức hợp nucleoprotein cuộn lại th ành nhiễm sắc thể

Do vai trò quan trọng của ADN trong hoạt động sống của sinh vật (tham giavào các quá trình cơ bản của sự sống như việc sinh tổng hợp protein, sin h trưởng,sinh sản và di truyền), cho nên việc nghiên cứu ADN ngày càng được chú trọng vànhững hiểu biết về ADN ng ày càng được mở rộng

Có nhiều phương pháp tách chiết ADN tế bào Tuy nhiên, các phương phápnày đều được dựa trên nền tảng của 3 bước sau:

 Phá màng tế bào và màng nhân

Tế bào, mô thường được nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy nh ư SDS,sarcosyl và protease K Khi đó, màng t ế bào và màng nhân sẽ bị vỡ ra và giải phóngADN ra ngoài môi trường, phân huỷ các protein liên kết với ADN

 Loại bỏ các thành phần không mong muốn tron g mẫu

Các thành phần không mong muốn chủ yếu l à protein Thành phần này sẽđược loại bỏ bằng cách sử dụng hỗn hợp dung dịch phenol v à chloroform Dungdịch này có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hoà tan nucleic acid Sau lytâm, ta sẽ thu được 3 pha: pha phenol, chloroform ở dưới cùng, lớp tủa trắng ở giữa

và lớp nước trên cùng là dung dịch có chứa ADN Ta sẽ thu nhận lớp n ước trêncùng này

 Tủa nucleic acid

Tủa nucleic acid nhằm thu nhận nucleic acid d ưới dạng cô đặc, bảo vệnucleic acid tránh bị phân huỷ của enzyme nh ưng lại có thể hoà tan chúng lại trongdung dịch theo nồng độ mong muốn Thông th ường, nucleic acid được tủa bằngdung dịch ethanol với môi tr ường có nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp hay bằngisopropanol Sau khi thu nh ận nucleic acid, kết tủa cần phải rửa trong ethanol 70%

để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính v ào

1.3 Bảo quản ADN

Trong qua 500 năm qua, 820 loài trên Trái đ ất tuyệt chủng do những hoạtđộng của con người, hoặc theo quy luật của tự nhiên, và đây là một trong những tổnthất rất lớn trong lịch sử thế giới Việc sử dụng các nguồn tài nguyên thiên nhiêncủa Trái đất thiếu quy hoạch đ ã tạo áp lực rất lớn cho động vật hoang d ã và thựcvật, bất chấp các nỗ lực của con ng ười trong việc bảo tồn nguồn gen của chúng.Hiện tại danh sách các lo ài đang bị đe doạ ở vào khoảng 10000 loài

Mặc dù việc bảo quản gen không ngăn chặn đ ược sự tuyệt chủng của các lo àinày nhưng việc lưu giữ lại nguồn gen của nó sẽ cung cấp những thông tin quý báu

về loài như hoá sinh, sinh lý, sinh thái c ủa chúng và thậm chí là cả cách thức hìnhthành loài Như vậy, việc bảo tồn ADN của các lo ài quý hiếm đang có nguy c ơ

tuyệt chủng nhằm mục đích đảm bảo rằng những thông tin di truyền quan trọng này

sẽ không bị mất đi trong t ương lai [21]

Trong lĩnh vực pháp y, việc bảo quản ADN từ lúc thu mẫu đến khi phân tích,lưu giữ lại ADN chứng cứ sau phân tích cũng rất quan trọng Những sai hỏng ADNtrong quá trình này sẽ gây ra nhiều bất lợi cho pháp luật trong việc xác định tộiphạm

Đối với lĩnh vực sức khoẻ, y tế th ì liệu pháp gen đang là một trong nhữngcách rất có triển vọng trong việc chữa các bệnh di truyền Thông qua việc l ưu giữADN của cá nhân, ta có thể kiểm tra cây phả hệ, kiểm tra bện h di truyền, tạo ra mộtphần cơ thể trong tương lai cho các liệu pháp gen, để tạo d òng, sửa chữa các saihỏng về chức năng gen

Lưu giữ ADN của những thành viên trong gia đình cho mục đích kiểm traADN để khi những vấn đề li ên quan đến chức năng gen xảy r a thì có thể sử dụngchúng thông qua kỹ thuật di truyền [24]

Trong việc nghiên cứu và sản xuất vaccine thế hệ mới th ì việc bảo quảnADN lại đóng một vai trò hết sức quan trọng Ta có thể l ưu giữ lại đoạn gen tổnghợp nên các kháng nguyên đ ể khi cần sản xuất vaccine sẽ được dùng cho quá trìnhtạo dòng, cấy chuyển gen vào vật chủ để sinh tổng hợp kháng nguyên Việc này sẽgiảm đi thời gian nuôi cấy, tách chiết lại ADN tr ước khi sản xuất vaccine

Ngoài ra, phương pháp và thời gian bảo quản ADN cũng rất quan trọng đối vớicác nhà nghiên cứu trong việc bố trí thí nghiệm, l ên kế hoạch cho những nghiên cứutiếp theo Ví dụ như lúc thu các mẫu thí nghiệm để phân tích ADN xem xét mối quan

hệ giữa các loài, sự biến động di truyền hay xác định tương đồng của các loài di nhậpthì việc giữ cho ADN ít bị tổn thương nhất là hết sức quan trọng

Các nhà bảo tồn cũng có thể bảo quản nguồn gen quý hiếm của động vật,thực vật nhất là các đối tượng có nguy cơ tuyệt chủng hay biến đổi di truyền đểnghiên cứu chức năng gen, tái tạo lại nguồn lợi nhờ các kỹ thuật di truyền

Bản chất của ADN là rất nhạy cảm, dễ bị đứt g ãy bởi phản ứng thuỷ phân,hoạt động oxy hoá của enzyme endonuclease V ì vậy, nếu như không có phươngpháp bảo quản thì những chuỗi dài ADN chứa đựng rất nhiều thông tin di truyềnnày sẽ bị bẻ gãy thành những đoạn nhỏ, làm giảm đi đáng kể khả năng phân tíchgen và nhiều kỹ thuật khác sử dụng đến gen Hoạt động của enzyme gây nên sự đứt

gãy ADN có thể được hạn chế bằng cách đ iều chỉnh pH môi tr ường, nhiệt độ, haynồng độ muối Nhiều mẫu thí nghiệm đ ã được bảo quản thành công khi được xử lývới các tác nhân hoá học hay vật lý [ 18].

Bảo quản ADN vốn là mối quan tâm lớn của các nh à khoa học trong nhiềulĩnh vực khác nhau, từ khoa học d ược phẩm, pháp y, sinh học, đến quản lý bảo t àngsinh học Mặc dù thuật ngữ “bảo quản” đ ược sử dụng cho tất cả những lĩnh vực tr ên

và đều có vai trò giữ nguyên vẹn tính chất vật lý, hoá học của phân tử ADN , nhưngkhi ứng dụng nó trong những lĩnh vực ri êng biệt sẽ khác nhau đáng kể Tuỳ theohướng ứng dụng mà những yêu cầu về thời gian bảo quản, độ chính xác v à điềukiện bảo quản cũng sẽ rất khác nhau Ví dụ nh ư khoa học dược phẩm liên quan đếnmức độ đứt gãy nhỏ nhất theo những yêu cầu nghiêm ngặt của FDA Tuy nhiên,thời gian sử dụng dược phẩm lại ngắn, thường từ 18 – 24 tháng Ngược lại vớinhững yêu cầu đó, bảo tàng sinh học liên quan đến việc giữ ổn định tr ình tự thôngtin di truyền ADN thì lại cần phải bảo quản mẫu vật trong thời gian d ài để các nhàkhoa học trong tương lai có thể sử dụng mẫu vật để nghi ên cứu tại những thời điểmkhông xác định

Trong thực tế, sự đứt gãy đang xảy ra đối với một vài mẫu vật theo thời gianbảo quản Và mục đích của việc nghiên cứu phương pháp bảo quản là hạn chế quátrình đứt gãy này

Mẫu ADN được bảo quản rất tốt ở nhiệt độ - 80ºC hay nitơ lỏng, nhưng lại rấttốn chi phí khi bảo quản hàng trăm, hàng ngàn mẫu vật trong điều kiện này Ngược lại,mẫu được khử nước có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng, nhờ đó sẽ giảm đáng kể chi phí

và rất thuận tiện Những nghiên cứu trước đây về ADN trong dung dịch đ ã cho thấyrằng tốc độ đứt gãy có thể dự đoán chính xác và điều kiện của dung dịch đệm có thểđiều chỉnh để giữ ổn định tại nhiệt độ phòng Rõ ràng, những nghiên cứu ADN dướidạng tiềm sinh với các bước chuẩn bị làm khô là rất cần thiết [20]

Những nghiên cứu hoá sinh trong thời gian d ài cho thấy các cơ chế hoá học

có ảnh hưởng rất lớn đến sự đứt gãy ADN được bảo quản trong dung dịch đệm ít

ổn định hơn khi nó được làm biến tính trước đó Ward và Kuo tiến hành khảo sátkhả năng của ADN sợi đôi chống lại sự bức xạ khi có hoặc không có mặt phân tửoxy Từ những gì quan sát được cho thấy ADN sợi đôi chống lại được tác dụng củabức xạ Điều này đã đưa tới kết luận như sau: “Nền tảng của ADN nguy ên vẹn đượcbảo vệ khỏi những tác động của bức xạ l à do sự có mặt của tác nhân vật lý ở trung

tâm của sợi xoắn kép” Giả thuyết n ày ngược lại với những quan sát cho rằng ADNđược làm đặc trong chromatin có khả năng chống lại tác động của sự oxy hoá h ơn làADN tự do Cơ chế của những phản ứng n ày đã chỉ ra 1 điều rất quan trọng l à sựoxy hoá được biết đến là nguyên nhân gây ra hi ện tượng không bắt cặp trong quátrình sao chép ADN, gây ra đột biến Nhiều đột biến có li ên quan đến ung thư vàtuổi tác, điều này có thể giải thích bởi sự tiến hoá của c ơ chế đọc.

Bảo quản trong dung dịch

Để tránh những đứt gãy ADN do tác nhân hoá h ọc hay enzyme, các nh à khoahọc thường bảo quản ADN dạng kết tủa trong ethanol ở - 80ºC Dưới những điềukiện này, nucleic acid sẽ ổn định trong thời gian d ài, nhưng phải tách chúng ra khỏiethanol, chuyển qua dung dịch đệm chứa n ước, xác định hàm lượng trước khi sửdụng Những thao tác n ày cho thấy kết tủa ADN không thích hợp cho các ứng dụngyêu cầu mẫu được bảo quản trong điều kiện có thể sử dụng ngay

ADN trong dung dịch là thuận tiện nhất nhưng nucleic acid rất nhạy cảm với sựkhử purine, khử pyrimidine, khử amin, thuỷ phân làm hạn chế khả năng giữ ổn địnhADN thời gian dài trong môi trường dung dịch Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chứngminh khả năng ứng dụng của ADN trong môi tr ường kiềm sẽ ức chế cơ chế đứt gãy,phân tách acid trong thời gian dài Hơn nữa, độ mang điện có tác động đán g kể tới cả

sự khử purine nên việc sử dụng dung dịch muối là không phù hợp để giữ ADN nguyênvẹn trong dung dịch Dưới điều kiện pH = 8.5 thì oxy hoá là mối đe dọa đầu tiên đến sự

ổn định của ADN (bao gồm nuclease đ ã bị ức chế hay loại bỏ) [20]

Tác động của quá trình oxy hoá sẽ được tăng cường khi có mặt của các kimloại Fe3+, Cu2+ dù với dạng vết thông qua phản ứng Fenton Nh iều nghiên cứu đãchứng minh rằng sự tạp nhiễm các kim loại l àm tăng mức độ oxy hoá đáng kể xảy

ra trong suốt quá trình bảo quản Thêm vào đó, việc khử kim loại trong tất cả nhữngthành phần ADN, dung dịch đệm, n ước sẽ làm giảm đáng kể đứt gãy trong suốt quátrình bảo quản Nồng độ kim loại cho phép l à dưới 5 ppb Tuy nhiên, dù đạt đượctinh sạch cao thì ADN chứa 30 – 40 ppb sắt, và các chất ổn định như đường, dungdịch đệm đều có chứa lượng rất lớn kim loại tạp nhiễm

Để bảo quản ADN khỏi sự oxy hoá ta có thể bổ sung th êm những chất chốngoxy hoá vào môi trường bảo quản Evans đ ã dùng 200 µM EDTA với 1% ehanol đểgiảm thiểu sự đứt gãy của plasmid Ứng dụng n ày có thể đạt hiệu quả bảo quản tr ên90% sau 2 năm bảo quản ở nhiệt độ phòng [20]

Đông lạnh ADN

Mặc dù có nhiều nghiên cứu khẳng định khả năng bảo quản tốt của dungdịch nhưng giữ ADN trong thời gian lâu (h ơn 10 năm) ta có thể sử dụng các điềukiện bảo quản mà ở đó sự dịch chuyển của các phân tử bị hạn chế nh ư trong điềukiện đông sâu hay làm khô

ADN thường được bảo quản trong nhiệt độ đông sâu nh ưng còn rất ít hiểubiết về ảnh hưởng của quá trình đông lạnh và rã đông đến chất lượng ADN Ảnhhưởng của hai quá trình này được báo cáo đầu tiên bởi Shikama khi ông chỉ ra rằngADN tuyến ức con bê được bảo quản tốt ở -192ºC Lyscov và Moshkovky cho rằng

sự đứt gãy ADN phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh mẫu Ngược lại với quan điểm tr ình

tự ADN rất ít chịu tác động của các nhân tố hoá lý Nghiên cứu này cho thấy sự ảnhhưởng tới oligonucleotide phụ thuộc v ào thành phần base, cấu trúc, và chiều dài củađoạn oligonucleotide [22]

Nguyên lý của phương pháp bảo quản đông sâu là làm chậm các quá trìnhsinh học, hoá sinh hoặc làm ngừng các quá trình này Tế bào được giữ ở trạng tháiđông sâu dường như không thay đổi và sau đó có thể phục hồi lại khi cần thiết

Phương pháp bảo quản này sử dụng nitơ lỏng để đạt tới nhiệt độ -196ºC Các

cơ quan, mô được xử lý trước với chất bảo vệ để giữ cho chúng khỏi bị shock đônglạnh – mô trong cơ quan dễ bị phá huỷ do tốc độ l àm lạnh Chất bảo vệ sẽ giúp bảoquản cơ quan ở nhiệt độ cực kỳ thấp

Các cơ quan, mô khi làm lạnh thật nhanh sẽ ngăn chặn sự h ình thành các tinhthể đá Nếu mô được làm lạnh chậm, tinh thể đá sẽ h ình thành và làm rách màng t ếbào và phá huỷ các cơ quan tử của tế bào

Khi lấy mô ra khỏi nitơ lỏng, nó sẽ được đưa về nhiệt độ phòng bởi quá trình

rã đông nhanh Quá trình rã đông nhanh này sẽ ngăn cản việc hình thành các tinhthể đá Các mô sau đó sẽ đ ược hồi phục trở lại tr ước khi tiến hành các thí nghiệmtiếp theo [22]

Làm khô ADN

Ngược lại với làm lạnh đông, làm khô là phương pháp thay th ế có tính thựctiễn hơn Phương pháp làm khô d ựa vào nguyên tắc loại nước để ngăn không choADN tham gia vào ph ản ứng thuỷ phân và hạn chế sự dịch chuyển của ADN C ó

nhiều phương pháp loại nước khỏi dung dịch như sấy phun ở nhiệt độ thường, sấyphun ở nhiệt độ lạnh, sấy bằng khí hay làm khô lạnh [20].

Do nguồn gen thường xuyên biến đổi giữa các sinh vật, thế n ên các nhànghiên cứu thường giữ mẫu ADN [18] Trên thế giới đã có khá nhiều những nghiêncứu phương pháp bảo quản mô động vật, thực vật, bảo quản hạt giống, tinh tr ùng,trứng hay phôi nhưng điều kiện để bảo quản tốt mô cho mục tiêu phân tích ADN lạichưa thật sự được tìm hiểu, xác định nhiều

Năm 1989, Marla Meeth Pyle, Robert P Adams nghiên cứu xác định chấtlượng và số lượng ADN trong lá thực vật Lá đ ược xử lý bằng phương pháp sấykhô, bảo quản lạnh và chất bảo quản hoá học Chất lượng ADN được bảo quản tốttrong mẫu lá tươi, đông lạnh và sấy khô, nhưng không có chất bảo quản nào có thểcho kết quả tốt sau từ 3 đến 7 ng ày [14]

Năm 1998, M A J Frantzen , J B Silk , J W H Ferguson , R K Wayne

& M H Kohn đã đánh giá hiệu quả của 4 phương pháp bảo quản mẫu phân chophân tích ADN: bảo quản trong dung dịch DMSO/EDTA/Tris/salt (DETs), ethanol,bảo quản lạnh – 20ºC, sấy khô Bảo quản trong DETs cho kết quả tốt nhất đối vớiADN nhân, nhưng 3 phương pháp c òn lại cho kết quả tốt tương tự nhau khi bảoquản ADN ty thể và mảnh ADN nhân (<200bp) [ 13]

Nhằm mục đích thiết lập ph ương pháp thuận tiện và đáng tin cậy trong việcthu mẫu và bảo quản lưu trữ côn trùng và những vi sinh vật cộng sinh trong chophân tích phân tử, năm 1999, Takema Fukatsu đã kiểm tra khả năng bảo quản ADN

của Acyrthosiphon pisum, Buchnera sp bằng acetone, ehanol và một số các dung

môi hữu cơ khác Kết quả cho thấy sau 6 tháng, cả ADN và rRNA đều được bảoquản tốt trong acetone, ethanol, 2 propanol, diethyl ether, ethyl acetate nh ưng lạikhông cho kết quả tốt khi bảo quản trong methanol, chloroform Acetone đ ược đánhgiá tốt hơn về khả năng chống ngoại nhiễm Do đó, có thể bảo quản mô trongacetone ở nhiệt độ phòng trong vài năm [18]

Năm 2001, C William Kilpatrick đ ã so sánh 3 phương pháp bảo quản ADNkhỏi sự đứt gãy trong khoảng thời gian 2 năm 3 ph ương pháp bảo quản bao gồm:

 Bảo quản mô trong dung dịch muối DMSO ở nhiệt độ ph òng

 Bảo quản mô trong dung dịch đệm ly giải ở nhiệt độ ph òng

 Bảo quản mô trong dung dịch ethanol 95% ở nhiệt độ ph òng

Kết quả cho thấy cả 3 ph ương pháp trên đều ngăn chặn được sự đứt gãyADN trong ít nhất là 6 tháng Trong đó, ngâm trong DMSO là phương pháp t ốt nhấtgiữ cho ADN không bị đứt g ãy trong vòng 2 năm ADN phân tử lượng lớn có thểtách chiết được từ dung dịch đệm ly giải ngâm mô trong 2 năm nh ưng vẫn tồn tạimột lượng lớn ADN đứt gãy Ethanol cũng bảo quản tốt mô để tách chiết ADNnhưng hiệu quả tương đối thấp hơn so với 2 phương pháp kia Đa số sự đứt gãyADN trong mô bảo quản bằng ethanol xảy ra trong quá tr ình tách chiết và có thểgiảm thiểu bằng cách ngâm ch ìm mô trong đệm ly giải khoảng vài tiếng trước khibắt đầu tách chiết Hiệu quả sản phẩm PCR cao nhất khi ADN tách chiết từ môngâm trong dung dịch muối DMSO, trong khi ADN tách từ mô bảo quản trong đệm

ly giải và ethanol đều cho hiệu suất thấp [ 3]

Năm 2002, Melanie A Murphy, Lisette P.Waits, Katherine C.Kendall,Samuel K Wasser, Jerry A Higbee và Robert Bogden b ảo quản phân gấu xám

Ursus arctos theo 5 phương pháp: ethanol 90%, đ ệm DETs, làm khô bằng silica,

làm khô bằng cách sấy bảo quản ở nhiệt độ thường và sấy khô rồi bảo quản ở 20ºC Đối với ADN ty thể sau 1 tuần, tất cả các ph ương pháp đều cho hiệu quả bảoquản lớn hơn 75%, nhưng thời gian bảo quản ảnh h ưởng rất lớn đến hiệu quả bảoquản bằng phương pháp làm khô bằng silica Mẫu bảo quản ethanol cho hiệu quảbảo quản tốt nhất đối với cả ADN ty thể (86.5%) v à ADN nhân (84%) Khu ếch đạiADN nhân cho tỷ lệ thành công trong khoảng 26 – 88% Thời gian bảo quản có ảnhhưởng đáng kể đối với tất cả các ph ương pháp trừ ethanol [17]

-Năm 2003, J R King và S D Porter ti ến hành bảo quản kiến thợ của 3 lo ài:

Solenopsis invicta, Camponotus floridanus và Dorymyrmex bureni trong

isopropanol và ethanol v ới bốn nồng độ: 70, 85, 95, 100% qua 24 giờ, 1 tháng, 6tháng Kết quả cho thấy mẫu vật đ ược bảo quản tốt trong isopropanol 95% hayethanol 95% sau 24 giờ ADN được bảo quản tốt nhất trong 95 – 100% ethanol [8]

Năm 2006, Mauro Mandrioli, Federica Borsatti v à Lucrezia Mola đã tiến

hành bảo quản mọt bắp cải tr ưởng thành Mamestra brassicae ở những điều kiện

khác nhau nhằm mục tiêu làm phong phú thêm phương pháp thích h ợp nhất để bảoquản mẫu vật côn trùng dạng bướm cho nghiên cứu ADN Mẫu vật được bảo quảntrong các điều kiện: làm khô nhanh với silica gel, acetone, 2 -propanol, Carnoy’s,ethanol 75%, ethanol 100%, nhi ệt độ đông sâu và nitơ lỏng Bảo quản trong acetoneđược xem là phương pháp thích h ợp nhất cho đối tượng mọt, là môi trường bảo

quản tốt cho phân tích ADN, không chỉ áp dụng được cho lĩnh vực khảo sát m à cònhiệu quả, chi phí thấp trong việc bảo t àng mẫu vật mọt bắp cải [16].

Năm 2008, Jennifer M Zaspel và Marjorie A Hoy bảo quản ADN

Wolbachia từ loài E kuehniella trong 4 điều kiện: ethanol 95% ở nhiệt độ ph òng,

ethanol 95% ở -80ºC, acetone ở nhiệt độ phòng và acetone ở -80ºC trong 2 năm chokết quả tương tự nhau [10]

1.4 Gen cytochrome b

ADN ty thể là ADN chuỗi kép, dạng vòng duy nhất trong ty thể, có hàmlượng A, T cao, chiều dài có thể tới 15000 – 17000 bp Nó tương đương v ới1/10000 ADN nhân Bộ gen ty thể và gen nhân khác nhau v ề dạng di truyền, mức

độ tái tổ hợp, số lượng intron, tốc độ đột biến, c ơ chế sửa sai… [23]

ADN ty thể mã hoá cho 37 gen, trong đó có 24 gen mã hoá cho cơ cấuchuyển động của chính ADN ty thể (22 tRNA v à 2 rRNA) 13 gen còn l ại mã hoácho các dưới đơn vị của chuỗi truyền điện tử, n ơi mà cacbonhydrate và chất béođược oxy hoá sản sinh ra CO2, nước và ATP [3]

Khác với gen nhân, ADN ty thể tồn tại h àng trăm đến hàng ngàn bản saotrong 1 tế bào, được sao chép trong suốt quá tr ình sống của tế bào Trong phần lớnđộng vật, kể cả con ng ười, ADN ty thể mang thông tin di truyền theo hệ mẹ Độtbiến ADN ty thể vì thế mà có khả năng di truyền theo mẫu hệ [ 15]

ADN ty thể đang gây ra sự tranh c ãi khi cho rằng ADN là một phân tử đánhdấu trung tính Sự tiến hoá của ADN ty thể th ường kéo theo những dạng đột biến cóhại nhẹ hoặc gần như trung tính Dựa trên những kiểm tra về tính trung tính củaphân tử từ 14 nghiên cứu, Fry (1999) đề nghị giữa các lo ài có dạng thể đơn bộihiếm vượt quá và những thể đơn bội này kéo theo sự hình thành những đột biến cóhại nhẹ Ballard và Kreitman (1995) chỉ ra rằng việc lựa chọn phần n ào của ADN tythể đều ảnh hưởng tới hiện tượng đa hình trong toàn bộ phân tử trong quần thể bởi

vì ADN ty thể không thể tái tổ hợp đ ược đã làm cho bộ gen ty thể dễ bị ảnh h ưởngkhi chèn thêm một đoạn gen vào nó Tốc độ thay thế không đồng nhất trong suốtdòng giống và sự vượt quá giới hạn của sự thay thế đa h ình (sự thay thế dẫn tới sựthay đổi những aminoacid không thể dịch chuyển được) gây ra sự đa hình ADN tythể Yet, Ballard và Kreitman cho rằng hiện tương trôi dạt gen có thể hiện hữu trong

sự tiến hoá của ty thể Tuy nhi ên, giá trị sử dụng ADN ty thể trong nghi ên cứu phát

sinh loài lại không bị giảm đi bởi sự không chắc chắn về tính trung tính của ty thể.Những hiểu biết về tính trung tính của ADN ty thể l à rất cần thiết cho những phântích đánh giá khoảng cách di truyền.

Trong tế bào, mô, cơ quan hay toàn b ộ cá thể có thể chứa 2 quần thể ADN tythể: một dạng bình thường và một dạng đột biến (một dạng của hiện tượng biếnthể) Các cá thể bình thường chỉ chứa các phân tử ADN ty thể xác định gọi l à hiệntượng đa thể [15]

Tốc độ tiến hoá trình tự ADN ty thể rất cao, khoảng 2% trong 1 tỷ năm.Người ta đánh giá tốc độ tiến hoá của gen ty thể gấp 10 lần gen nhân [ 3]

ADN ty thể đã được sử dụng để nghiên cứu sinh thái ở mức độ phân tử v àđịa lý trong vòng hơn 30 năm qua ADN ty thể còn rất hữu dụng trong phân tíchđánh giá khoảng cách di truyền, nghi ên cứu mối quan hệ phát sinh lo ài giữa cácnhóm loài gần nhau, chỉ ra những sự kiện lịch sử nh ư hiện tượng nút thắt cổ chaihay phân tích vùng lai

Cytochrome được mô tả lần đầu tiên bởi MacMunn năm 1884 như nhữngchất màu Trong những năm 1920, Keilin đặt tên cho chúng là cytochrome hay ch ấtmàu tế bào và được phân loại vào nhóm protein có ch ứa vòng heme Gồm có 3 dạngcytochrome là: Cyt a, Cyt b, Cyt c dựa vào loại vòng heme mà nó gắn kết [23]

Hình 1.4 Cấu trúc của phân tử protein Cyt b

Gen của Cyt b là một đoạn gen nằm trong ADN ty thể, tổng hợp n ên proteinCyt b Cyt b là một trong những cytochrome chứa đựng chuỗi vận chuyển điện tửtrong chuỗi hô hấp của ty thể Nó chứa 8 vật chất chuyển m àng có hình xoắn ốcđược nối bởi vùng màng trong hay màng ngoài Nó là cytochrome duy nh ất được

mã hoá bởi ADN ty thể

Gen của Cyt b được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu hệ thống cácmức độ phân loại khác nhau, đóng vai tr ò như một phân tử đánh dấu cho phỏngđoán mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài gần nhau hay các nhóm địa lý trongcùng một loài Mặc dù nó tiến hoá chậm trong đột biến thay thế không đồng nghĩanhưng tốc độ tiến hoá trong vị trí im lặng lại t ương đối nhanh

Gen của Cyt b rất đa dạng và được bảo tồn để nghiên cứu sâu về mối quan hệphát sinh loài Tuy nhiên, gen của Cyt b lại tiến hoá mạnh mẽ bởi một số phần củagen được bảo tồn tốt hơn đã dẫn tới sự giới hạn về chức năng Đa số những v ùngbiến đổi được cho rằng chúng đặt giữa v ùng mã hoá cho vùng chuyển màng hay chođầu tận amino và cacbonxy

Gen của Cyt b được coi là một trong những gen được ứng dụng nhiều nhấtcho hệ thống phát sinh loài, và là gen được biết đến nhiều nhất về cấu trúc v à chứcnăng protein [6]

Hơn nữa, gen của Cyt b lại là nguồn dữ liệu trình tự được dùng phổ biến đểnghiên cứu động vật Mặc dù sử dụng gen của Cyt b có những sai sót nhưng Moore,DeFilipps (1997) chỉ rõ nó là sự lựa chọn tốt nhất nghi ên cứu lịch sử tiến hoá gầnđây [12]

1.5 Tôm sú [26]

Hình 1.5 Tôm sú Penaeus monodon

Tôm sú thuộc hệ thống phân loại

Ngành chân khớp: Arthopoda

Lớp giáp xác: Crustacea

Bộ mười chân: Decapoda

Bộ phụ bơi lội: Natantia

Họ tôm he: Penaeidae Rafinesque, 1815

Giống: Penaeus Fabricius, 1798 Loài: Penaeus monodon Fabricius, 1798

Tên thường gọi:

Tên tiếng Việt: Tôm súTên tiếng Anh: Giant tiger pawnTên tiếng Pháp: Crevette geante tigreeTên tiếng Tây Ban Nha: Camaron tigre giganteTôm sú có màu xanh thẫm, có khoang trắng ở thân, khoa ng vàng ở chânngực, đầu chân có màu đỏ hồng hoặc da cam

Vùng phân bố

Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng trong v ùng nước nhiệt đới và cận nhiệtđới: Ấn Độ Dương và tây Thái Bình Dương: từ đông và đông nam châu Phi vàPakistan đến Nhật Bản, phía nam đến Indonesia và bắc Australia

Tôm có khả năng chịu đựng trong môi tr ường có nồng độ muối từ 0‰ - 45‰nhưng thích hợp cho tăng trưởng ở độ mặn khoảng 15‰ - 25‰ pH trong khoảng từ6,5- 9,5 nhưng thích hợp nhất là trong khoảng 7,5-8,3 Hàm lượng oxy hoà tan tốtnhất là trên 5mg/l Tôm sú thu ộc loại rộng nhiệt, thích hợp nhất cho sinh tr ưởng vàphát triển là khoảng 25ºC- 30ºC

Đặc điểm dinh dưỡng

Tôm sú là loại ăn tạp, thích các động vật sống v à di chuyển chậm hơn là xácthối rữa hay mảnh vụn hữu c ơ, đặc biệt ưa ăn giáp xác, thực vật dưới nước, mảnhvụn hữu cơ, giun nhiều tơ, loại 2 mảnh vỏ, côn trùng Tôm sống ngoài tự nhiên ăn85% là giáp xác, cua nh ỏ, động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, c òn lại 15% là cá, giunnhiều tơ, thuỷ sinh vật, mảnh vụn hữu c ơ, cát bùn Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi

nhiều hơn khi thuỷ triều rút Nuôi tôm sú trong ao, hoạt động bắt mồi nhiều v àosáng sớm và chiều tối Tôm bắt mồi bằng c àng, sau đó đẩy thức ăn vào miệng đểgặm, thời gian tiêu hoá 4-5 giờ trong dạ dày.

Tập tính sống

Tôm sú thích sống dưới đáy nơi có cát bùn hay bùn cát S ống vùi mình và cótập tính lột xác để lớn Chúng thích hoạt động bắt mồi về đ êm Tôm sú sống chủyếu ở môi trường nước lợ, vùng cửa sông ven biển Giai đoạn ấu ni ên và thiếu niên,tôm sống ở độ sâu không q uá 6m Giai đoạn sắp trưởng thành và và trưởng thànhtôm có xu hướng di chuyển ngày càng xa bờ, sống ở vùng triều và ngoài khơi Tômtrưởng thành thích sống ở các vùng nước xa bờ, có độ trong cao Trong điều kiệnmôi trường như vậy chúng có tập tính v ùi mình vào ban ngày để lẩn tránh kẻ thù

Vòng đời

Các giai đoạn phát triển ấu trùng tôm sú:

 Nauplli: kéo dài 36-51 giờ, bao gồm 6 giai đoạn Các Nauplli bơi từngđoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằ ng noãn hoàng,không cần cho ăn

 Zoea: kéo dài 105-120 giờ, bao gồm 3 giai đoạn Các Zoea bơi liên tụcgần mặt nước, lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vất phi êu sinh

 Mysis: kéo dài 72 giờ, bao gồm 3 giai đoạn Các Mysis bơi hướng xuốngsâu, đuôi đi trước, đầu đi sau

 Postlarvae: giai đoạn gần trưởng thành Juvenile

 Tuổi thành thục: tuổi thành thục sinh dục của tôm đực v à tôm cái từ thángthứ 8 trở đi Hormone điều khiển sự th ành thục sinh dục (GIH, gonal inhibitinghormone) được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vậnchuyển tới tuyến giáp sinap đ ưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra Sự thành thụcsinh dục của tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt tức l à thúcđẩy chu kỳ lột xác, đem lại sự th ành thục mau chóng hơn Số lượng trứng đẻ củatôm cái: nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng buồng trứng và trọng lượng cáthể: trọng lượng lớn cho trứng nhiều h ơn Khi con cái thành th ục ngoài tự nhiên cótrọng lượng từ 100-300g cho 300.000 -1.200.000 trứng Nếu cắt mắt nuôi vỗ trong

bể xi măng, thành thục và đẻ, cho số lượng trứng từ 200.000- 600.000 trứng Tôm

cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ) trứng sau khi đẻ đ ược 14-15giờ, ở nhiệt độ 27-28C sẽ nở thành ấu trùng (Nauplii) Tôm sú đ ẻ quanh năm,nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3 -4 và tháng 7-10 Tuổi thọ tôm sú conđực khoảng 1,5 năm, con cái chừng 2 năm.

Mặc dù đã có những nghiên cứu xác định được phương pháp thích hợp chobảo quản mô thực vật v à động vật nhưng lại chưa có phương pháp bảo quản tốt nhất

mô động vật không xương sống cho mục tiêu phân tích ADN Sự thiếu hụt đáng kểnày có rất nhiều lý do Phân tích ADN rất có giá trị trong nghi ên cứu tiến hoá, hệthống phân loại, quần thể gen của các động vật biển không x ương sống Hơn nữa,động vật biển không xương sống đang trở nên rất quan trọng trong ng ành côngnghiệp dược phẩm do những giá trị y học của chúng V à môi trường biển chứa đựng

sự đa dạng sinh học rất lớn, đặc biệt l à vùng biển Thái Bình Dương

Từ những yêu cầu thực tiễn đặt ra, chúng tôi x ác định điều kiện bảo quảnADN cho đối tượng tôm sú - một đối tượng nuôi rất phổ biến ở Việt Nam v à ngàynay đang khan hiếm nguồn giống do việc khai thác ngo ài tự nhiên, nhằm mục tiêunghiên cứu đặc tính bộ gen, lưu giữ nguồn gen quý và góp phần bảo tồn nguồn genđộng vật thuỷ sản

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, cách thu và bảo quản mẫu

- Đối tượng: tôm sú (Penaeus monodon).

- Thu mẫu và bảo quản: Mẫu tôm được thu làm hai đợt

 Đợt 1: năm 2007

 Loạt mẫu I: 10 mẫu tôm sú thu tại Bạc Liêu được tách bỏ lớp vỏ

cứng phần đốt cuối, lấy phần mô cơ rồi ngâm chìm trong dungdịch ethanol 96% Sau đó, 10 m ẫu này được bảo quản ở - 70°C.Trước khi bảo quản, 10 m ẫu tôm sú này được tách chiết ADN,khuếch đại gen Cyt b và giải trình tự, thu kết quả để làm đốichứng

 Loạt mẫu II: đồng thời với bảo quản mô trong dung dịch ethanol,

10 mẫu ADN sau khi khuếch đại và tinh sạch (sản phẩm PCR)được bảo quản trong nước siêu sạch ở - 70°C

 Đợt 2: năm 2008

 Loạt mẫu III: 10 mẫu tôm sú thu tươi tại Kiên Giang, giữ trong

đá lạnh rồi vận chuyển nhanh về ph òng thí nghiệm, bảo quản ởnhiệt độ - 70ºC

Trước khi bảo quản, 10 m ẫu tôm sú này được tách chiết ADN,khuếch đại gen Cyt b và giải trình tự, thu kết quả để làm đốichứng

Tất cả các mẫu này đều được lưu giữ tại công ty Trách nhiệm hữu hạn SảnXuất-Thương Mại-Dịch Vụ Nam Khoa, 793/58 Tr ần Xuân Soạn - phường TânHưng - quận 7 - Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Phương pháp nghiên c ứu

Để đánh giá chất lượng ADN sau thời gian bảo quản, chúng tôi tiến hànhkiểm tra các loạt mẫu nh ư sau:

 Loạt mẫu I: lấy mẫu mô ra khỏi dung môi, đặt l ên giấy thấm, cắt một mẩu

mô cơ nhỏ (tương đương hạt mè), thấm khô dung môi rồi cho vào tube Eppendorf

 Loạt mẫu III: Lấy 10 mẫu tôm để rã đông hoàn toàn trong 3 giờ Dùngpank, kéo tách bỏ lớp vỏ cứng ở đốt cuối, cắt 1 mẩu mô cơ nhỏ, tương đương vớihạt mè, cho vào tube Eppendorf

2.2.1 Tách chiết ADN tôm sú

Hoá chất được dùng theo bộ kit NKADNPREP-PHCHL do công ty NamKhoa sản xuất

 Thêm 180 l TE 1X vào mỗi tube Eppendorf chứa mẫu

Tiền ly trích với protease K

 Thêm 20 l PROKPREP vào tube, tr ộn đều

 Ủ qua đêm ở 57ºC

 Sau khi ủ phải vortex mạnh để mẫu mô nát ra hết

 Thêm 200 l TE 1X vào tube

 Giữ tube trong tủ lạnh ngăn -20ºC trong 30 phút.

 Ly tâm 14000 vòng trong 5 phút

 Đổ bỏ phần nước nổi, thấm ethanol dính tr ên nắp và miệng tube bằnggiấy thấm sạch

 Rửa cặn ADN với 1000l ethanol 70%, không vortex mà chỉ úp ngửa vài lần

 Ly tâm 14000 vòng trong 5 phút, hút b ỏ ethanol bằng máy hút chânkhông

 Làm khô cặn bằng cách ủ ở máy ủ nhiệt khô, nhiệt độ 57 ºC trong 10 phút

 Hoà tan cặn ADN trong 50 l đệm TE

2.2.2 Phản ứng PCR

Sử dụng mix pha sẵn của công ty Nam Khoa Th ành phần mix gồm có Taqpolymerase, dNTP, Mg++, dung dịch đệm Tris-KCl và đoạn mồi cho phản ứng vớitổng thể tích là 45l

Đoạn gen Cyt b của tôm sú có chiều d ài khoảng 1000 bp Do đó, để khuếchđại hoàn toàn đoạn gen này, ta cần sử dụng 2 cặp mồi, gồm 2 mồi xuôi v à 2 mồingược Nguyên lý khuếch đại đoạn gen Cyt b nh ư sau:

Mix A chứa cặp đoạn mồi F-11, R-542 để khuếch đại đoạn gen của Cyt b cótrình tự từ nucleotide thứ 11 tới 542 Tr ình tự đoạn mồi F-11, R-542 như sau:

F-11 5’-ATT GAC CTC CCA GCA CCA GC -3’ Tm: 62°C

R-542 5’-GAA TAA TAG TTG CTG CTG CTA CGA T -3’ Tm: 59.8°C

Ta: 52°CMix B chứa cặp đoạn mồi F-473, R-1003 để khuếch đại đoạn gen Cyt b cótrình tự từ nucleotide thứ 473 tới 1003 T rình tự đoạn mồi F-473, R-1003 như sau:F-473 5’-GCT GCA TTA ACT CGA TTC TTC AC -3’ Tm: 58.8°CR-1003 5’-AAT TAC ATA AGG ATC TTC AAC TGG C -3’ Tm: 58.6°C

Ta: 50°C

R-1003

R-542