đồ án tốt nghiệp tách chiết và bảo quản adn của tôm sú (penaeus monodon)

i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin cảm ơn người cha quá cố của con, mẹ v à những người thân yêu của con đã nuôi nấng, dạy dỗ con nên người. Cảm ơn ba mẹ đã luôn dành tình yêu thương, sự chăm sóc tốt nhất cho con, chắp cánh niềm tin cho con v ào đời. Em xin cảm ơn ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, viện nghiên cứu Công nghệ sinh học & Môi tr ường đã tạo điều kiện tốt nhất cho em đ ược học tập và rèn luyện trong suốt 4 năm qua. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã luôn tận tâm dạy dỗ chúng em, truyền đạt cho chúng em những kiến thức mới. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, cô ThS. Nguyễn Thị Hiệp đã tận tình chỉ dẫn cho em trong những b ước đầu làm quen với nghiên cứu, truyền cho em niềm say m ê khoa học và giúp em thực hiện đề tài này. Em xin cảm ơn công ty TNHH SX -TM-DV Nam Khoa, thầy TS.BS Phạm Hùng Vân cùng các anh ch ị làm việc ở công ty đã tạo điều kiện cho em đ ược thực tập tại công ty. Em cảm ơn chị Trang, chị Yến đ ã ân cần chỉ dạy cho em từ những thao tác nhỏ nhất, giúp đỡ em ho àn thành đề tài này. Và cuối cùng, mình muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả những người bạn thân thiết đã luôn chia sẻ những niềm vui, nỗi buồn c ùng với mình trong suốt thời sinh viên. Một lần nữa, xin chân th ành cảm ơn! Nha Trang, 06/2009 Sinh viên thực hiện Đào Hoài Thu ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục bảng iv Danh mục hình v Danh mục các thuật ngữ viết tắt vi Lời mở đầu 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHI ÊN CỨU 2 1.1. Cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể 2 1.2. Tách chiết ADN 5 1.3. Bảo quản ADN 6 1.4. Gen cytochrome b 13 1.5. Tôm sú 15 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu, cách thu và bảo quản mẫu 19 2.2. Phương pháp nghiên c ứu 19 2.2.1. Tách chiết ADN tôm sú 20 2.2.2. Phản ứng PCR 21 2.2.3. Kỹ thuật điện di 22 2.2.4. Giải trình tự 23 2.2.4.1. Tinh sạch sản phẩm PCR 23 2.2.4.2. Chạy chu trình nhiệt 24 2.2.4.3. Tủa sản phẩm chu trình nhiệt 24 2.2.4.4. Giải trình tự tự động 25 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 iii 3.1. Đánh giá chất lượng ADN sau khi bảo quản bằng kỹ thuật điện di 28 3.1.1. Loạt mẫu I 28 3.1.2. Loạt mẫu II 29 3.1.3. Loạt mẫu III 32 3.2. Đánh giá chất lượng ADN sau khi bảo quản bằng phản ứng PCR 34 3.2.1. Loạt mẫu I 34 3.2.2. Loạt mẫu III 36 3.3. Đánh giá bảo quản ADN qua giải tr ình tự 39 Kết luận và đề xuất ý kiến 45 Tài liệu tham khảo 46 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Bảng mức độ t ương đồng giữa các trình tự 43 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của một nucleotide 2 Hình 1.2. Hai mạch đối song song 3 Hình 1.3. Phức hợp nucleoprotein cuộn lại th ành nhiễm sắc thể 5 Hình 1.4. Cấu trúc của phân tử protein Cyt b 14 Hình 1.5. Tôm sú Penaeus monodon 15 Hình 3.1. Ảnh điện di dịch ly trích ADN tổng số của loạt mẫu I sau khi bảo quản 28 Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II sau bảo quản (mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) 29 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II sau bảo quản (mẫu 9, 10) 30 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II tr ước khi bảo quản (mẫu 1, 2) 30 Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR của loạt mẫu II tr ước khi bảo quản (mẫu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 31 Hình 3.6. Ảnh điện di dịch ly trích ADN tổng số của loạt mẫu III sau khi bảo quản 32 Hình 3.7. Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu I sau khi bảo quản (mẫu 1, 2) 34 Hình 3.8. Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu I sau khi bảo quản (mẫu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 34 Hình 3.9. Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu III sau khi bảo quản (mẫu 1, 2, 3) 37 Hình 3.10. Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b lo ạt mẫu III sau khi bảo quản (mẫu 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 37 Hình 3.11. Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu III tr ước khi bảo quản (mẫu 1, 2, 3, 4, 5) 38 Hình 3.12. Ảnh điện di kết quả PCR Cyt b loạt mẫu III tr ước khi bảo quản (mẫu 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10) 39 1A 550 bp vi DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT A Adenine ADN acid desoxyribonucleic bp base pair C Cytosine Cyt b cytochrome b DETs DMSO/EDTA/Tris/salt DMSO dimethyl sulfoxide dNTP deoxynucleotide triphosphate EDTA ethylene di-amine tetra-acetic acid FDA Food and Drug Administration G Guanine kb kilobase P/C/I Phenol/Chloroform/Isoamyl Alco hol PCR Polymerase Chain Reaction rARN ribosomal acid ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate SLS Solution Loading Sequencing T Thymine Ta nhiệt độ bắt cặp tARN transfer acid ribonucleic TBE Tris/Borate/EDTA TE Tris – EDTA Tm nhiệt độ chảy 1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam với 3260 km bờ biển, hơn 150000 ha có khả năng nuôi tôm nước lợ đã trở thành một trong những nước có ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản phát triển. Trong đó tôm sú chiếm ưu thế rất lớn. Hiện tại, loài này được nuôi ở hơn 22 quốc gia trên thế giới, đóng vai trò rất quan trọng trong việc cải thiện đời sống của các cộng đồng dân c ư ven biển và tạo nguồn thu ngoại tệ. Năm 2000 sản l ượng tôm sú nuôi đạt 571.5 nghìn tấn, chiếm 52.3% tổng sản l ượng các loại tôm (FAO , 2002). Ở nước ta, trị giá xuất khẩu to àn ngành thủy sản là 850 triệu USD (1998), trong đó tôm sú chiếm khoảng 50 – 60% trị giá kim ngạch này. Tuy nhiên nguồn tôm bố mẹ của tôm sú dựa ho àn toàn vào khai thác t ự nhiên. Sự lệ thuộc vào nguồn tôm bố mẹ khai thác từ tự nhi ên và tình trạng khan hiếm của nguồn cung cấp n ày đã trở thành một trong những trở ngại lớn nhất cho nghề nuôi tôm sú tr ên toàn thế giới và cản trở quá trình thuần hoá đối tượng này. Tôm sú nuôi nhân t ạo thường có tỷ lệ thành thục thấp, sức sinh sản không cao v à sức sống con non kém h ơn so với tôm bắt từ ngoài tự nhiên. Điều này dẫn đến tình trạng nguồn cá thể bố mẹ bị khai thác cạn kiệt và phá vỡ cấu trúc quần thể tự nhiên của tôm sú. Thêm vào đó, vi ệc phát triển khu nuôi tự phát, không quy hoạch đ ã gây ra các vấn đề về môi trường, sự lan tràn của dịch bệnh làm cho nguồn tôm bố mẹ này càng bị đe dọa. Do vậy, công tác bảo tồn nguồn gen tôm sú rất quan trọng để l ưu giữ những gen quý nhằm mục đích kinh tế hay làm đa dạng nguồn gen, hệ sinh thái thuỷ sản. Được sự cho phép của Viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Tr ường và thầy PGS.TS Ngô Đăng Ngh ĩa, cô ThS. Nguyễn Thị Hiệp, tôi thực hiện đề t ài nghiên cứu: “Tách chiết và bảo quản ADN của tôm sú ( Penaeus monodon )” với mục tiêu là tách chiết ADN tổng số của tôm sú v à kiểm tra chất lượng ADN tôm sú sau thời gian bảo quản khác nhau, ở những điều kiện khác nhau để xác định điều kiện phù hợp cho bảo quản ADN tô m sú, phục vụ cho những nghi ên cứu tiếp theo. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHI ÊN CỨU 1.1. Cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể [2] Phân tử ADN, vật chất mang thông tin di truyền của hầu hết sinh vật, l à một chuỗi xoắn kép gồm hai sợi đ ơn, mỗi sợi đơn là một chuỗi polymer hình thành từ những monomer là nucleotide. Mỗi một nucleotide gồm có gốc phosphoric acid, đường 5-desoxyribose, và 1 trong 4 nitrogenous base ( hai purine là adenine (A), guanine (G) và hai pyrimidi ne là cytosine (C), thymine (T)). Tính đặc hiệu của nucleotide do base quy ết định, nên khi nói tới nucleic acid, base th ường được dùng thay cho nucleotide. Cách g ọi thường dùng là cặp base, kí hiệu bp (base pair) hay kb (kolibase – 1000 cặp base). Hình 1.1. Cấu trúc của một nucleotide Mô hình xoắn kép của ADN bao gồm hai mạch polynucleotide bắt cặp bổ sung tạo thành lò xo xoắn kép quanh trục giữa, mỗi b ước xoắn của lò xo dài 34 Å. 3 Hai mạch được gắn với nhau bằng các li ên kết hydro giữa các base đối diện với nhau theo nguy ên tắc bổ sung trong từng cặp: đối diện adenine l à thymine và đối diện với guanine l à cytosine. Các base purin và pyrimidine có c ấu trúc phẳng, mặt phẳng của chúng xếp vuông góc với trục d ài của mạch polynucleo tide và chúng chồng cái này lên cái kia, khoảng cách trung tâm của hai mặt phẳng kề nhau l à 3.4Å. Như vậy, phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép m à hai mạch gồm khung đường xen kẽ với các nhóm phosphate, đ ược gắn với nhau nhờ các li ên kết hydro giữa adenine với thymine ở mạch đối diện và giữa guanine với cytosine ở mạch đối diện. Hình 1.2. Hai mạch đối song song Các base của nucleic acid bắt cặp bổ sung: A bắt cặp với T bằng 2 li ên kết hydro và G bắt cặp với C bằng 3 li ên kết hydro Kích thước phân tử ADN rất khác nhau, có phân tử có kích th ước rất lớn, dài hơn cả triệu cặp nucleotide, lớn h ơn cả phân tử protein nh ư phát hiện của Carpersson năm 1930 nhưng c ũng có những phân tử rất nhỏ, chỉ chứa khoảng v ài nghìn nucleotide. T ất cả sinh vật đều có chung một cấu trúc ADN. Tính đặc tr ưng 4 của ADN của một lo ài biểu hiện ở trình tự sắp xếp các nucleotide dọc theo chiều d ài và số lượng của chúng. Trong tế bào Eukaryote, ADN n ằm trong nhân ở dạng mạch thẳng d ưới dạng nhiễm sắc thể, hoặc nằm ở t rong ty thể và lục lạp dưới dạng mạch vòng. Tuy nhiên, dù ở dạng nào thì các phân tử ADN này đều tồn tại theo kiểu cuộn chặt. ADN Eukaryote có kích thư ớc rất lớn (ví dụ, ADN ở ng ười có thể dài đến 1m) nên phân tử này phải được nén chặt ở nhiều mức độ khác nhau, mức độ thấp nhất là nucleosome và mức độ cao nhất là cấu trúc nhiễm sắc chất. Các nhiễm sắc thể của Eukaryote có tổ chức phức tạp gồm ADN v à nhiều loại protein gắn vào. Trong số đó, histon là những protein nhỏ chứa nhiều aminoacid mang điện tích dương (lysine và arginine) nên g ắn chặt với ADN điện tích âm, protein giữ vai trò cốt lõi trong việc cuộn lại và điều hoà hoạt tính ADN. Các nhiễm sắc thể có số lượng và hình dạng đặc trưng cho tế bào của mỗi loài sinh vật. Sự hình thành nhiễm sắc thể kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép ADN qua hệ thống các bậc cấu trúc sau:  Nucleosome là đơn v ị cấu trúc của nhiễm sắc thể đ ược tạo nên do sợi ADN dài quấn quanh các protein histon, h ình thành sợi 11nm. Đơn vị này là phức hợp gồm 146 cặp base của ADN quấn quanh 8 phân tử h iston. Các nucleosome k ề nhau được nối qua một phân tử histon trung gian.  Sợi chromatin dày 30 nm: các nucleosome x ếp khít nhau tạo th ành phức hợp nucleoprotein.  Vùng xếp cuộn dày 300 nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúc tạo nên.  Chất dị nhiễm sắc 700 nm.  Nhiễm sắc thể kỳ giữa 1400 nm. [...]... khô bằng cách sấy bảo quản ở nhiệt độ thường và sấy khô rồi bảo quản ở 20ºC Đối với ADN ty thể sau 1 tuần, tất cả các ph ương pháp đều cho hiệu quả bảo quản lớn hơn 75%, nhưng thời gian bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả bảo quản bằng phương pháp làm khô bằng silica Mẫu bảo quản ethanol cho hiệu quả bảo quản tốt nhất đối với cả ADN ty thể (86.5%) v à ADN nhân (84%) Khuếch đại ADN nhân cho tỷ lệ... mẫu và bảo quản: Mẫu tôm được thu làm hai đợt Đợt 1: năm 2007 Loạt mẫu I: 10 mẫu tôm sú thu tại Bạc Liêu được tách bỏ lớp vỏ cứng phần đốt cuối, lấy phần mô cơ rồi ngâm chìm trong dung dịch ethanol 96% Sau đó, 10 m ẫu này được bảo quản ở - 70°C Trước khi bảo quản, 10 mẫu tôm sú này được tách chiết ADN, khuếch đại gen Cyt b và giải trình tự, thu kết quả để làm đối chứng Loạt mẫu II: đồng thời với bảo quản. .. pháp bảo quản mô động vật, thực vật, bảo quản hạt giống, tinh tr ùng, trứng hay phôi nhưng điều kiện để bảo quản tốt mô cho mục tiêu phân tích ADN lại chưa thật sự được tìm hiểu, xác định nhiều Năm 1989, Marla Meeth Pyle, Robert P Adams nghiên cứu xác định chất lượng và số lượng ADN trong lá thực vật Lá đ ược xử lý bằng phương pháp sấy khô, bảo quản lạnh và chất bảo quản hoá học Chất lượng ADN được bảo. .. t ốt nhất giữ cho ADN không bị đứt g ãy trong vòng 2 năm ADN phân tử lượng lớn có thể tách chiết được từ dung dịch đệm ly giải ngâm mô trong 2 năm nh ưng vẫn tồn tại một lượng lớn ADN đứt gãy Ethanol cũng bảo quản tốt mô để tách chiết ADN nhưng hiệu quả tương đối thấp hơn so với 2 phương pháp kia Đa số sự đứt gãy ADN trong mô bảo quản bằng ethanol xảy ra trong quá tr ình tách chiết và có thể giảm thiểu... trọng của ADN trong hoạt động sống của sinh vật (tham gia vào các quá trình cơ bản của sự sống như việc sinh tổng hợp protein, sin h trưởng, sinh sản và di truyền), cho nên việc nghiên cứu ADN ngày càng được chú trọng và những hiểu biết về ADN ng ày càng được mở rộng 1.2 Tách chiết ADN [1] Thành phần nucleic acid thường ở dưới dạng nucleoprotein Do vậy, việc tách chiết ADN sẽ bao gồm cả việc tách phân... hoá vào môi trường bảo quản Evans đã dùng 200 µM EDTA với 1% ehanol để giảm thiểu sự đứt gãy của plasmid Ứng dụng này có thể đạt hiệu quả bảo quản tr ên 90% sau 2 năm bảo quản ở nhiệt độ phòng [20] 10 Đông lạnh ADN Mặc dù có nhiều nghiên cứu khẳng định khả năng bảo quản tốt của dung dịch nhưng giữ ADN trong thời gian lâu (h ơn 10 năm) ta có thể sử dụng các điều kiện bảo quản mà ở đó sự dịch chuyển của. .. mô trong dung dịch ethanol, 10 mẫu ADN sau khi khuếch đại và tinh sạch (sản phẩm PCR) được bảo quản trong nước siêu sạch ở - 70°C Đợt 2: năm 2008 Loạt mẫu III: 10 mẫu tôm sú thu tươi tại Kiên Giang, giữ trong đá lạnh rồi vận chuyển nhanh về ph òng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ - 70ºC Trước khi bảo quản, 10 mẫu tôm sú này được tách chiết ADN, khuếch đại gen Cyt b và giải trình tự, thu kết quả để làm... VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá chất lượng ADN sau khi bảo quản bằng kỹ thuật điện di 3.1.1 Loạt mẫu I Kết quả điện di ADN tổng số sau khi tách chiết của loạt mẫu I thể hiện ở hình 3.1 Hình 3.1 Ảnh điện di dịch ly trích ADN tổng số của loạt mẫu I sau khi bảo quản Theo hình 3.1 ta thấy các mẫu 6, 7, 8, 9, 10 xuất hiện các vệt sáng mờ, kéo dài từ đầu tới cuối bản gel Điều này cho thấy ADN tổng số của tôm sú. .. xảy ra đối với một vài mẫu vật theo thời gian bảo quản Và mục đích của việc nghiên cứu phương pháp bảo quản là hạn chế quá trình đứt gãy này Mẫu ADN được bảo quản rất tốt ở nhiệt độ - 80ºC hay nitơ lỏng, nhưng lại rất tốn chi phí khi bảo quản hàng trăm, hàng ngàn mẫu vật trong điều kiện này Ngược lại, mẫu được khử nước có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng, nhờ đó sẽ giảm đáng kể chi phí và rất thuận tiện... kết quả tốt nhất đối với ADN nhân, nhưng 3 phương pháp c òn lại cho kết quả tốt tương tự nhau khi bảo quản ADN ty thể và mảnh ADN nhân ( . mục tiêu là tách chiết ADN tổng số của tôm sú v à kiểm tra chất lượng ADN tôm sú sau thời gian bảo quản khác nhau, ở những điều kiện khác nhau để xác định điều kiện phù hợp cho bảo quản ADN tô m sú, . cho phép của Viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Tr ường và thầy PGS.TS Ngô Đăng Ngh ĩa, cô ThS. Nguyễn Thị Hiệp, tôi thực hiện đề t ài nghiên cứu: Tách chiết và bảo quản ADN của tôm sú ( Penaeus. VẤN ĐỀ NGHI ÊN CỨU 2 1.1. Cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể 2 1.2. Tách chiết ADN 5 1.3. Bảo quản ADN 6 1.4. Gen cytochrome b 13 1.5. Tôm sú 15 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 19 2.1.