Giải trình tự tự động trên máy giải trình tự CEQ 8000 – Beckman Coulter.
Nguyên tắc
Trong điện di, ADN dịch chuyển từ cực (-) sang cực (+). Mạch đơn ADN được đánh dấu bằng 4 màu khác nhau tại nucleotide tận cùng ở đầu 3’. Khi các
mạch này đi qua mắt cảm quan, tín hiệu sẽ đ ược ghi nhận lại và được máy tính mã hoá thành các nucleotide.
Tiến hành
Sau khi tủa sản phẩm chạy chu trình nhiệt, thêm 40l dung dịch SLS vào giếng điện di.
Nhỏ vào mỗi giếng 1 lớp dầu khoáng lên trên mặt giếng để tránh hiện tượng bốc hơi trong quá trình giải trình tự trên máy.
Chuẩn bị dung dịch buffer chứa trong các giếng. Dung dịch này sẽ hỗ trợ cho quá trình điện di mao quản khi máy hoạt động.
Nạp sản phẩm giải trình tự đã chuẩn bị vào máy giải trình tự tự động.
Đối với những giếng không chứa mẫu, ta cũng cần thêm vào 40 l dung dịch SLS để tránh điện di mà không có mẫu.
2đoạn trình tự ADN của đoạn gen của Cyt b được nối lại bằng tính năng Contig Express của phần mềm Vector NTI version 9. Các kết quả giải trình tựnày sẽ được so sánh với trình tự ADN trước khi bảo quản bằng phần mềm BioEdit, tính năng ClustalW Multiple Alignment và kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường.
Các loạt mẫu sẽ được tiến hành theo sơ đồ khối như sau:
Tách chiết ADN Phương pháp Phenol/Chloroform
Loạt mẫu I Loạt mẫu III
Điện di
Gel agarose 0.8% 135V, 50mA, 22 phút
Loạt mẫu II Điện di
Giải trình tự
Gel agarose 2% 135V, 50mA, 22 phút
Tinh sạch sản phẩm PCR Chạy chu trình nhiệt
Tủa sản phẩm chu trình nhiệt Giải trình tự tự động Biến tính:95ºC, 05 phút Bắt cặp: 94ºC, 30 giây 55.7ºC, 30 giây 72ºC, 01 phút Tổng hợp:72ºC, 10 phút PCR 40 lần
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN