Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo một số đặc tính nông sinh học ở Ngô và Lúa Mì

Bảng 1 Đánh giá một số chỉ tiêu nông học của các dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 quacác thời vụ trồng trong điều kiện Việt nam 30 Bảng 2 Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 32 Bả

Viện Di truyền Nông nghiệp

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài

ở ngô và lúa mỳ

Chủ nhiệm Đề tài: PGS TS Lê Huy Hàm

Cơ quan chủ trì: Viện Di truyền Nông nghiệp

Cơ quan chủ quản: Bộ Nông nghiệp & PTNT

Thời gian thực hiện: 1/2002 – 12/2004

5885

19/6/2006

Hà Nội, 2006

Bản báo cáo viết xong ngày 1/04/2006

Tài liệu này đ−ợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài Nghị định th− hợp tác KHCN với CHLB Đức

Lời cảm ơn

Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và nhân lực cho cán bộ chủ trì và các cán bộ tham gia thực hiện đề tài này

Chủ nhiệm đề tài và cán bộ thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý Khoa học & Công nghệ các ngành kinh tế của Bộ Khoa học & Công Nghệ; Vụ Hợp tác Quốc tế của Bộ Khoa học & Công Nghệ; Bộ Nông nghiệp và PTNT đã tạo điều kiện về kinh phí và quản lý quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2006

Cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài

PGS TS Lê Huy Hàm

Danh sách những người tham gia thực hiện đề tài 1

Bài tóm tắt 2

Những chữ viết tắt 4

Lời mở đầu 5

Chương 1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 8

1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và trong nước 8

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây chuyển gen 8

1.3 Công nghệ sinh học và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô ở Việt nam 11

1.3.1 Các nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn ngô 11

1.3.2 Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh 12

1.4 Các nghiên cứu chuyển gen ở cây ngô 12

1.5 Một số hướng mới nhằm cải tạo giống ngô 13

1.5.1 Chọn tạo giống chín sớm 13

1.5.2 Chọn tạo giống có khả năng chịu lạnh 14

1.5.3 Tăng cường khả năng hấp thụ nitơ 14

Chương 2 Lựa chọn đối tượng và phương pháp nghiên cứu 16

2.1 Mục tiêu của đề tài 16

2.2 Nội dung nghiên cứu cần thực hiện 16

2.2.1 Tách chiết và tái tổ hợp gen, thiết kế vectơ mang gen 16

2.2.2 Xây dựng hệ thống tái sinh và biến nạp di truyền 16

2.2.2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và mô đơn bội ở ngô 16

2.2.2.2 Thiết lập hệ thống chuyển gen ở cây ngô 17

2.2.2.3 Chuyển gen vào ngô với các gen quan tâm 18

2.2.2.4 Phân tích cây chuyển gen 18

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Vật liệu 18

2.3.1.1 Vật liệu thực vật 18

2.3.1.2 Các chủng vi khuẩn Agrobacterium, plasmid DNA, vật tư và hoá chất 19

2.3.2 Phương pháp 20

2.3.2.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 20

2.3.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 20

2.3.2.3 Cải thiện khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam bằng phương pháp di truyền 20

2.3.2.4 Phương pháp biến nạp gen 21

2.3.2.5.Phương pháp đánh giá cây chuyển gen 21

2.4 Dạng sản phẩm kết quả tạo ra 22

3.1 Xây dựng hệ thống tái sinh 23

3.1.1 Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non 23

3.1.1.1 Cơ sở khoa học và các nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro 23

3.1.1.2 Vật liệu và phương pháp 27

3.1.1.3 Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non 29

3.1.1.4 Quy trình tái sinh cây từ phôi non ở ngô 39

3.1.1.5 Đánh giá khả năng tái sinh của một số dòng ngô Việt Nam 41

3.1.2 Xây dựng hệ thống tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn 42

3.1.2.1 Đặt vấn đề 42

3.1.2.2 Vật liệu và phương pháp 43

3.1.2.3 Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn 45

3.1.2.4 Tối ưu hoá quy trình tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn 46

3.1.2.5 Quy trình tái sinh cây từ bao phấn 51

3.1.3 Tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao bằng phương pháp di truyền 52

3.1.3.1 Vật liệu và phương pháp 53

3.1.3.2 Kết quả chọn tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao 53

3.1.4 Kết luận 57

3.2 Xây dựng hệ thống chuyển gen 59

3.2.1 Xây dựng hệ thống chuyển gen bằng súng bắn gen 59

3.2.1.1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen bằng súng bắn gen 59

3.2.1.2 Vật liệu và phương pháp 62

3.2.1.3 Hoàn thiện quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen 64

3.2.1.4 Kết luận 74

3.2.1.5 Quy trình biến nạp bằng súng bắn gen 75

3.2.2 Xây dựng hệ thống biến nạp gen thông qua Agrobacterium 77

3.2.2 1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium 77

3.2.2 2 Vật liệu và phương pháp 79

3.2.2.3 Hoàn thiện quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium 82

3.2.2.4 Quy trình biến nạp gen thông qua Agrobacterium 90

3.2.2.5 Đánh giá khả năng biến nạp gen của một số dòng ngô thuần và ngô lai 92

3.2.2.6 Kết luận 94

3.3 Chuyển gen vào ngô với các gen quan tâm 95

3.3.1.Vật liệu và phương pháp 95

3.3.1.1 Vật liệu 95

3.3.1.2 Phương pháp 96

3.3.2 Kết quả và thảo luận 97

3.3.3 Những khó khăn tồn tại 104

3.4.1 Vật liệu và phương pháp 106

3.4.1.1 Vật liệu 106

3.4.1.2 Phương pháp 107

3.4.2 Kết quả đánh giá biểu hiện bền vững của gen chỉ thị trong các dòng ngô chuyển gen 109

3.4.2.1 Biểu hiện bền vững của gen gfp trong các dòng ngô chuyển gen 109

3.4.2.2 Biểu hiện bền vững của gen gus trong các dòng ngô chuyển gen 111

3.4.3 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen 113

3.4.3.1 Phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen gfp và pat 113

3.4.3.2 Phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen gus và nptII 114

3.4.4 Kết quả phân tích lai Southern các dòng ngô chuyển gen 115

3.4.4.1 Phân tích lai Southern các dòng ngô chuyển gen pat 115

3.4.4.2 Phân tích lai Southern các dòng ngô chuyển gen nptII 117

3.4.5 Thử nghiệm cây chuyển gen trong nhà kính 119

3.4.6 Kết luận 122

Chương 4 Tổng quát hoá và đánh giá kết quả thu được 123

4.1 Kết quả về khoa học 123

4.2 Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng 124

4.3 Trình độ công nghệ 126

4.4 Khả năng áp dụng 126

4.5 Đào tạo 126

4.6 Sản phẩm khoa học của đề tài 127

4.7 Hợp tác quốc tế 128

4.8 Tình hình sử dụng kinh phí 128

4.9 Danh sách các công trình công bố 129

4.10 Hạn chế của đề tài 129

Chương 5 Kết luận và đề nghị 131

5.1 Kết luận 131

5.2 Đề nghị 132

Tài liệu tham khảo 134

Tài liệu Tiếng Việt 134

Tài liệu Tiếng Anh 135

Phụ lục

Bảng 1 Đánh giá một số chỉ tiêu nông học của các dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 qua

các thời vụ trồng trong điều kiện Việt nam

30

Bảng 2 Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 32 Bảng 3 Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR9 32 Bảng 4 ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy (tuổi phôi) lên khả năng tạo mô sẹo và

tái sinh cây

cấy bao phấn

Nam và dòng nhập nội HR8/HR9

54

Bảng 16 Phản ứng tái sinh in vitro của các dòng ngô chọn tạo bằng phương pháp lai

ngược giữa dòng ngô Việt Nam và dòng nhập nội HR8

Bảng 20 ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen tạm thời 71

Bảng 21 ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus và khả

Bảng 24 Biểu hiện tạm thời của gen gus khi biến nạp các chủng Agrobacterium và

vector khác nhau vào phôI non dòng ngô HR8

83

Bảng 26 ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy phôi đến hiệu quả chuyển gen thông qua

Agrobacterium

87

Bảng 27 ảnh hưởng của acetosyringone (AS) đến biểu hiện tạm thời của gen gus 89

Bảng 28 Phản ứng của các dòng ngô khác nhau trong biến nạp gen thông qua

Agrobacterium

93 Bảng 29 Trình tự các đoạn mồi (Biozym) sử dụng trong nghiên cứu 97

Bảng 30 Kết quả chọn lọc và tái sinh cây sau khi biến nạp phôi non dòng HR8 với các

gen quan tâm

98

Bảng 31 Tóm tắt các thí nghiệm chuyển gen quan tâm vào phôi non dòng HR8 100

Bảng 32 Trình tự các đoạn mồi (Biozym) sử dụng trong nghiên cứu 108

Bảng 33 Tóm tắt các thí nghiệm chuyển gen bằng súng bắn gen vào phôi non dòng ngô

HR8

109

Bảng 34 Tóm tắt các thí nghiệm chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 111

Bảng 35 Theo dõi sinh trưởng và phát triển của các dòng HR8 chuyển gen trồng trong

nhà kính

120

Hình 1 Mô tả hình thái, sinh trưởng và phát triển của hai dòng ngô nhập nội HR8 và

HR9 qua các thời vụ trồng trong điều kiện Việt Nam

31

Hình 2 Tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non dòng ngô nhập nội HR8 32

Hình 4 Tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các phôi nuôi cấy có kích thước khác nhau 35 Hình 5 ảnh hưởng của AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 37 Hình 6 ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo của phôi non dòng ngô HR8 39 Hình 7 Khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam 42 Hình 8 Khả năng tái sinh cây từ phôi non của các dòng ngô lai giữa dòng Việt Nam và

Hình 13 Biểu hiện gus tạm thời ở phôi sau khi bắn gen 66 Hình 14 Tạo mô sẹo phôi hoá và tái sinh chồi từ phôi non bắn gen 67 Hình 15 Biểu hiện gus tạm thời ở phôi ngô non sau khi biến nạp với plasmid mang đoạn

Hình 18 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở phôi non dòng HR8 biến nạp với các chủng

Agrobacterium mang các vector khác nhau

84

Hình 19 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi non có kích thước khác nhau sau khi

biến nạp với Agrobacterium ATHV(pBINGUSINT)

Hình 22 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi non dòng ngô HR8, GA35 và GC8

sau khi biến nạp với ATHV(pBINGUSINT)

93

Hình 23 Sơ đồ cấu trúc vectơ pBIN4F4 và pBINIIIE9 sử dụng trong các thí nghiệm biến

nạp gen ở ngô thông qua Agrobacterium

Hình 26 Kết quả phân tích PCR các cây ngô HR8 được biến nạp với vectơ

pPLANTA195Zmm4 mang gen chín sớm Zmm4

102

Hình 28 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đ−ợc biến nạp với vectơ pBINIIIE9

mang gen chịu lanh IIIE9

104

Hình 29 Sơ đồ cấu trúc plasmid p35PAT sử dụng cho các nghiên cứu chuyển gen bền vững vào

phôi ngô non bằng súng bắn gen

107

Hình 30 Biểu hiện bền vững của gen gfp ở mô sẹo tạo thành từ phôi non bắn gen và rễ

cây chuyển gen tái sinh

110

Hình 31 Biểu hiện của gen gus ở chồi và rễ cây ngô tái sinh đã chuyển gen 112

Hình 32 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen gfp 113

Hình 33 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen pat 113

Hình 34 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 và GA35 đã đ−ợc chuyển gen gus 114

Hình 35 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen nptII 115

Hình 36 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen thông qua

Agrobacterium

115 Hình 37 Kết quả lai DNA của các dòng ngô HR8 chuyển gen pat (cắt bằng NcoI) 116

Hình 38 Kết quả lai DNA của các dòng ngô HR8 chuyển gen pat (cắt bằng SacI) 117

Hình 39 Kết quả lai Southern của các dòng ngô GA35 chuyển gen nptII 118

Hình 40 Dòng ngô GA35 chuyển gen hữu thụ trồng trong nhà kính 119

Hình 41 Đánh giá biểu hiện bền vững của gen pat ở các dòng ngô HR8 chuyển gen

trồng trong nhà kính

121

Danh sách những người tham gia thực hiện đề tμi

B Cán bộ tham gia nghiên cứu

1 PGS.TS Đỗ Năng Vịnh Phòng thí nghiệm trọng

điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp

Bμi tóm tắt

ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai đứng sau lúa Trong lĩnh vực chọn tạo giống ngô mặc dù đã có những chuyển biến hết sức tích cực nhưng công nghệ sinh học vẫn chưa được áp dụng rộng rãi vào công tác chọn tạo giống ngô, đặc biệt là việc tạo ra các giống ngô có các đặc tính mới bằng kỹ thuật di truyền Những hạn chế làm giảm hiệu quả của việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong chọn tạo giống ngô ở nước ta là: i) Chúng ta chưa có hệ thống tái sinh có hiệu quả sử dụng cho chuyển gen; ii) Chúng ta chưa có nguồn gen (gen có giá trị kinh tế) và các vật liệu sử dụng cho chuyển gen (các plasmid, các chủng

Agrobacterium, các promotor đặc hiệu ); iii) Chúng ta chưa có cán bộ lành nghề

trong lĩnh vực tạo cây trồng chuyển gen Đề tài “Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền

cải tạo một số đặc tính nông sinh học ở ngô và lúa mỳ” được thực hiện trên cơ sở

hợp tác khoa học với Trung tâm nghiên cứu PLANTA/KWS (CHLB Đức) là một trong những cố gắng theo hướng khắc phục các nhược điểm trên để tiến tới ứng dụng thành công công nghệ gen vào cải tạo giống cây trồng

Mục tiêu của đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn đề sau: i) Xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho chuyển gen thích hợp với điều kiện về giống và khí hậu ở Việt nam; ii) Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào ngô bằng cả

hai phương pháp dùng súng bắn gen và Agrobacterium; iii) Đào tạo cán bộ lành

nghề trong lĩnh vực chuyển gen tạo giống cây trồng và tăng cường tiềm lực trong

lĩnh vực này như thu thập các plasmid vectơ, các chủng Agrobacterium, các vật liệu

khác sử dụng cho chuyển gen thông qua hợp tác với đối tác nước ngoài; và iv) Chuyển một số gen có giá trị kinh tế mà phía bạn đã phân lập, thiết kế vào ngô Theo kế hoạch dự kiến, phía CHLB Đức sẽ phân lập và thiết kế 3 gen (chín sớm, chịu lạnh và tăng cường hấp thụ nitơ) để chuyển vào ngô Tuy nhiên, trên thực tế 2 gen (chín sớm, và chịu lạnh) đã được thiết kế và chuyển vào ngô, gen tăng cường hấp thụ nitơ không phân lập thành công

Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu được những kết quả chính sau:

Xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho chuyển gen: Phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được áp dụng để xây dựng và hoàn thiện quy trình tái sinh cây từ phôi non và tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn có tần suất tái sinh cao Bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp tái sinh cây từ phôi non đề tài đã tạo được 5 dòng ngô có khả năng tái sinh cao và thích ứng tốt trong điều kiện Việt Nam

Hoàn thiện quy trình chuyển gen: Hệ thống chuyển gen vào cây ngô đã được hoàn thiện Các quy trình biến nạp gen bằng súng bắn gen và thông qua

Agrobacterium đã được xây dựng và cải thiện trên cơ sở tối ưu hoá các yếu tố chính

ảnh hưởng đến quá trình biến nạp

Chuyển các gen vào ngô: Sử dụng các quy trình biến nạp đã xây dựng để

chuyển các gen: gfp/gus, pat/nptII, các gen mang các đặc tính quan tâm: chín sớm,

chịu lạnh vào ngô Đề tài đã nhận được 10 dòng ngô HR8 chuyển gen kháng thuốc

diệt cỏ và 6 dòng ngô GA35 chuyển gen mang gen nptII Các dòng ngô chuyển gen

đã được phân tích và đánh giá bằng các phương pháp sinh học phân tử Hạt R1 của các dòng chuyển gen này cũng đã nhận được

Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu

được những kết quả bước đầu rất khả quan Các kết quả nghiên cứu đạt được mang tính khoa học và lý luận

Những chữ viết tắt

2,4- D: Dichlorophenoxy acetic acid

Act1: rice actin promoter : đoạn gen khởi động tách từ cây lúa

Adh1: alcohol dehydrogenase 1 promoter: đoạn gen khởi động Adh1

AS: acetosyringone

bar / pat: gen mã hoá phosphinothricin acetyl transferase

gus: β- Glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase

bp: base pair

CNSH: Công nghệ Sinh Học

DNA: Axit Deoxyribonucleic

EC: embryogenic callus: mô sẹo phôi hoá

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

Et-Br: Ethidium bromide

gfp: green fluorescent protein: gen chỉ thị mã hoá cho protein phát huỳnh quang màu

xanh

nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase

CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter

CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide

Ubi1: maize ubiquitin promoter

X-gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

GMC: Cây trồng chuyển gen

GMO: Sinh vật chuyển gen

HR8 = C18: Dòng ngô nhập nội A188

HR9= C19: Dòng ngô nhập nội H99

Km: Kanamycine

Kp: Kilobase

LB: Luria and Bertani

MS: Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962)

NOS-P: Nopaline Synthase Promotor

PCR: Polymerase Chain Reaction

STF (%): tần số chuyển gen bền vững (%)

T-DNA: Transfer- DNA= DNA chuyển

Ti- Plasmit: Tumor inducing plasmit= plasmit gây khối u thực vật

TTF (%): tần số chuyển gen tạm thời (%)

Vir : Virulence Region = Vùng gây độc có khả năng tạo khối u

Lời mở đầu

Công nghệ sinh học hiện đại và các cây trồng biến đổi di truyền đang được ứng dụng rộng rãi và có nhiều đóng góp có giá trị cho sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trên lĩnh vực tạo giống cây trồng mới Công nghệ sinh học sử dụng kỹ thuật di truyền để cải tạo cây trồng bằng cách đưa trực tiếp những gen có giá trị vào hệ gen của thực vật, cho phép tạo ra hàng loạt cây trồng mang các gen hữu ích, có những

đặc tính nông học quan trọng như kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, chín sớm và các

đặc tính có lợi khác

Trong thập niên vừa qua, thế giới đã chứng kiến các bước phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học Từ những nghiên cứu cơ bản trong những năm 70-80 của thế kỷ trước, con người đã bước đầu tạo ra được giống cây trồng như ý muốn Đó là các giống ngô, bông, đậu tương, cải dầu kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ Đó là thế hệ cây chuyển gen đầu tiên đã hiện thực hoá giấc mơ cải tạo thiên nhiên của con người Trên diện tích trồng cây chuyển gen, năng suất cây trồng cao hơn, hoá chất

sử dụng ít hơn và lợi nhuận thu được cao hơn Đó chính là lý do vì sao diện tích cây trồng chuyển gen lan nhanh trên toàn thế giới Tính đến năm 2005, trên thế giới đã

có 90 triệu ha cây trồng chuyển gen, 8,5 triệu nông dân đã trồng cây chuyển gen

Dự kiến đến năm 2010, trên thế giới sẽ có khoảng 150 triệu ha cây trồng chuyển gen và số nước áp dụng công nghệ này sẽ lên tới 30 nước (Clive, 2005) [59] Năm

2005, ngô có hàm lượng lysin cao đã được đưa vào sản xuất, mở đầu cho thế hệ ngô chuyển gen thứ hai: cải tiến hàm lượng dinh dưỡng và các đặc tính nông sinh học Tuy nhiên, các đặc tính rất quan trọng khác như hàm lượng chất vi lượng, tính chín sớm (ngắn ngày), khả năng hấp thụ nitơ, chịu hạn, chịu lạnh còn chưa được chú ý

ở Việt Nam, chúng ta chưa tạo ra được giống cây trồng chuyển gen, các nghiên cứu chuyển gen chỉ là những nghiên cứu lẻ tẻ, không mang tính chất hệ thống và chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm Để làm chủ được công nghệ hiện đại tạo giống cây trồng như ý muốn của con người, chúng ta cần phải làm chủ được công nghệ tái tổ hợp ADN, trong đó có xác định các gen có ích, phân lập và thiết kế

vectơ biểu hiện ở các loài thực vật khác nhau, xây dựng hệ thống chuyển gen và

đánh giá biểu hiện của gen chuyển, làm cơ sở cho việc tạo ra các giống cây trồng mới, đáp ứng với yêu cầu của sản xuất và xã hội

Cây ngô là một trong những đối tượng quan trọng để áp dụng các phương pháp công nghệ sinh học ở nước ta đây là cây lương thực quan trọng thứ hai đứng sau lúa Trong lĩnh vực chọn tạo giống ngô mặc dù đã có những chuyển biến hết sức tích cực nhưng công nghệ sinh học vẫn chưa được áp dụng rộng rãi vào công tác chọn tạo giống ngô Chúng ta mới chỉ giới hạn ở việc ứng dụng các công nghệ như công nghệ đơn bội, đánh giá khoảng cách di truyền vào chọn tạo giống ngô ở quy mô rất hạn chế Do đó, đóng góp của công nghệ sinh học vào sản xuất ngô hầu như chưa đáng kể Trong khi đó, do đặc thù của điều kiện tự nhiên nước ta, từ Nam ra Bắc với 6 vùng sinh thái khác nhau đặt ra cho công tác chọn tạo giống những đòi hỏi rất đặc thù, thậm chí nghiêm ngặt cho từng vùng Việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo ra các giống ngô có các đặc tính mới mà phương pháp truyền thống không tạo ra được là hết sức cần thiết để tạo ra các giống ngô thích hợp với các vùng sinh thái khác nhau, nâng cao năng suất và sản lượng ngô

Do đặc thù của nền nông nghiệp luân canh nhiều vụ nên ở đồng bằng Bắc Bộ ngô thường được trồng xen giữa hai loài cây trồng khác Do vậy, việc tạo ra các giống ngô ngắn ngày sẽ góp phần tăng cường luân canh xen vụ Qua đó làm tăng diện tích trồng trọt và sản lượng

ở Việt Nam, vụ ngô đông bị ảnh hưởng bởi gió lạnh cuối tháng 10 Các giống ngô không chịu lạnh thường có tỷ kệ kết hạt rất thấp nếu tung phấn vào các dịp thời tiết lạnh Người trồng ngô khắc phục hiện tượng này bằng cách trồng giống ngắn ngày hoặc trồng sớm để tránh thời tiết lạnh Như vậy sẽ ảnh hưởng đến vụ thu hoạch trước đó Vì thế các giống ngô chịu lạnh sẽ đảm bảo an toàn cho vụ ngô đông tại các vùng trồng ngô phía Bắc

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng các giống cây trồng ngắn ngày, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường như lạnh, hạn có thể được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền Trong hàng loạt các yêu cầu cần phải có để tạo được giống

chuyển gen thì việc xây dựng được quy trình chuyển gen thuận lợi và có hiệu quả cao là một trong những đòi hỏi cần thiết Các cây ngũ cốc chính bao gồm ngô và lúa mì là những đối tượng chuyển gen quan trọng kể từ khi các cây chuyển gen được tái sinh thành công (Rhodes & CS, 1988; Vasil & CS, 1992) [88], [110] Một trong những hạn chế làm giảm hiệu quả của việc chuyển gen vào cây trồng nói chung và

đối với cây ngô nói riêng là tần số tái sinh thấp Để nâng cao hiệu quả tạo cây chuyển gen người ta đã xây dựng hệ thống tái sinh cây với tần số tái sinh cao từ nuôi cấy phôi non Tuy vậy, chỉ có một số giống ngô ôn đới: A188 và H99, một số giống ngô có nguồn gốc Trung quốc: G10, G11 là những giống có khả năng tái sinh cao, được dùng làm đối tượng trong các nghiên cứu chuyển gen ở ngô (Stamp 1994) [101] Một trong những nhược điểm lớn của các giống ngô này là chúng chỉ thích nghi với điều kiện khí hậu ôn đới mà rất khó thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới như ở nước ta., vì vậy cần phải có các nghiên cứu để thích ứng các quy trình tái sinh trên trong các điều kiện của Việt Nam

Mặt khác, nguồn gen để cải tạo giống cây trồng bằng kỹ thuật di truyền hiện nay chưa có được ở trong nước Trong thoả thuận hợp tác nghiên cứu với đối tác nước ngoài là Trung tâm nghiên cứu PLANTA, thuộc Công ty giống hàng đầu của CHLB Đức (Công ty KWS), nguồn gen ngắn ngày và gen chịu lạnh sẽ được PLANTA phân lập, thiết kế và chuyển giao cho phía Việt Nam sử dụng Các vật liệu khác sử dụng cho chuyển gen, như giống ngô có khả năng tái sinh cao, các chủng

Agrobacterium đặc hiệu cũng được chuyển giao cho Việt Nam

Xuất phát từ những đòi hỏi thực tế trên và khả năng của đối tác nước ngoài

bổ sung những thiếu hụt của nước ta trong vấn đề áp dụng kỹ thuật di truyền cải tạo giống cây trồng, Viện Di truyền Nông nghiệp đã được Bộ Khoa học Công nghệ cho

phép thực hiện đề tài “Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo một số đặc tính

nông sinh học ở ngô và lúa mỳ” Đây là một trong những đề tài thuộc chương trình

hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và CHLB Đức, đề tài vừa có định hướng ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ, xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ lĩnh vực công nghệ ADN cải tạo giống cây trồng

Chương 1

Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước

vμ ngoμi nước

1 1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và trong nước

Vào những năm cuối thế kỷ 20 nghề trồng ngô đã có bước phát triển vượt bậc nhờ những ứng dụng rộng rãi công nghệ giống ngô lai và các thành tựu khoa học về

di truyền tạo giống

Diện tích trồng ngô trên thế giới biến động từ 130-145 triệu ha, trong đó Mỹ

là nước có diện tích trồng ngô lớn nhất, gần 30 triệu ha Tổng sản lượng ngô hạt thế giới năm 2004 đạt 705 triệu tấn, năng suất bình quân đạt trên 4,8 tấn/ha ở châu á, Trung Quốc là cường quốc về ngô lai, có diện tích trồng ngô trên 25 triệu ha, năng suất bình quân 5,1 triệu tấn/ha (Ngô Hữu Tình & CS, 1997) [13]

ở Việt nam ngô được trồng trong các điều kiện sinh thái khác nhau trên nhiều vùng, các thời vụ trồng ngô chủ yếu căn cứ vào tác động của chế độ nhiệt, lượng mưa Trong vài năm gần đây diện tích và sản lượng ngô tăng rất mạnh (Ngô Hữu Tình & CS, 1997) [13]

1 2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây chuyển gen

Năm 1984, trên thế giới đã có một số nghiên cứu thành công khi chuyển gen vào cây trồng Đến nay, vấn đề cải biến giống cây trồng đã phát triển vượt bậc, góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm chi phí phòng trừ sâu bệnh, tạo ra những giống cây thích ứng với nhiều vùng sinh thái khắc nghiệt Những thành tựu này có

ý nghĩa rất quan trọng không chỉ đối với Việt Nam mà trên toàn cầu, đặc biệt khi dân số thế giới ngày càng tăng cùng nguồn tài nguyên thiên nhiên bị giảm sút

Hiện nay, phần lớn những nghiên cứu về GMO đều được tiến hành ở các nước phát triển, chủ yếu là ở Bắc Mỹ và Tây âu Tại các nước công nghịêp, các công ty công nghệ sinh học đã đi đầu trong việc ứng dụng kỹ thuật biến đổi gen vào

DuPont/Pioneer, Monsanto và Syngenta Tuy nhiên, gần đây, nhiều nước đang phát triển cũng đang bắt đầu những nghiên cứu về công nghệ gen

Thử nghiệm ngoài đồng ruộng đầu tiên là cây thuốc lá biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ, được tiến hành ở Mỹ và Pháp năm 1986 Trong giai đoạn 1986-1997, tức là bắt đầu thời điểm thương mại hoá cây trồng biến đổi gen, trên toàn cầu có tới

25000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây trồng biến đổi di truyền Các thử nghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên đối tượng là 60 loại cây trồng Trong thời kỳ này, những loại cây biến đổi gen được thử nghiệm là: Ngô, cà chua,

đậu nành, cải dầu, khoai tây và bông với các đặc tính được quan tâm nhất như kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu và kháng virus Cho tới năm 2004 ước tính có 63 quốc gia áp dụng kỹ thuật biến đổi gen ở cây trồng

Từ thời điểm 1996, diện tích GMO thương mại bắt đầu tăng liên tục và ổn

định Từ năm 1996-2004 tổng số diện tích trồng cây biển đổi gen là 385 ha Theo báo cáo của cơ quan quốc tế về các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA), năm 2004 được đánh giá là năm có thành tích phát triển nhanh thứ hai – diện tích trồng cây biến đổi gen tăng 13,3 triệu ha Diện tích trồng đạt 81 triệu ha tại 17 nước Năm 2003 tổng diện tích cây trồng biến đổi gen trên toàn thế giới đạt 67,7 triệu ha, tăng 15%, trong đó 1/3 diện tích là ở các nước đang phát triển (tỉ lệ này trong năm 2002 là 1/4) Năm 2003 có khoảng 7 triệu người làm nông nghiệp thuộc 18 nước trên thế giới sử dụng loại cây trồng biến đổi gen, tăng 1 triệu người

so với năm 2002, trong đó 85% là ở các nước đang phát triển Số hộ nông dân trồng cây biến đổi gen tăng từ 7 triệu của năm 2003 lên 8,25 triệu năm 2004, trong số đó chiếm 90% (7,5 triệu người) là nông dân sản xuất nhỏ tại các nước đang phát triển

Số lượng các nước đang phát triển trồng cây biến đổi gen là 11 nước, gần gấp đôi số lượng các nước công nghiệp

Diện tích trồng cây biến đổi gen ở các nước đang phát triển đã tăng 7,2 triệu

ha (35%) trong năm 2004 so với 6,1 triệu ha (13%) ở các nước công nghiệp Năm

n-ước đang phát triển Trung Quốc, ấn Độ, Argentina, Brazil và Nam Phi – với tổng số dân là 2,6 tỉ người, chiếm 40% dân số toàn thế giới, hiện là các nước đứng đầu về

cây chuyển gen, đã trồng 26 triệu ha cây biến đổi gen trong năm 2004, tương đương với 1/3 diện tích trồng cây chuyển gen toàn thế giới Trung Quốc và Nam Phi là những nước phát triển mạnh nhất việc sử dụng cây trồng biến đổi gen Năm 2004 Trung Quốc có 7 triệu nông dân đang trồng cây bông kháng sâu Bt Khoản lợi nhuận 5 tỉ USD được dự tính vào năm 2010 thu được từ cây lúa và bông biến đổi gen Người dân ấn Độ đã chấp nhận cây bông kháng sâu Bt từ năm 2002; diện tích trồng loại cây này tăng gấp 5 lần, đạt 500.000ha vào năm 2004; Bên cạnh đó, hơn

15 giống cây biến đổi gen đang trong giai đoạn thử nghiệm Argentina là nước đứng thứ 2 về cây biến đổi gen – diện tích trồng cây chuyển gen chiếm 20% diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn thế giới Lợi nhuận đạt được 2 tỉ USD/năm từ đậu t-

ương, ngô và bông chuyển gen ở Brazil cây đậu tương chuyển gen đã được người dân chấp nhận vào năm 2003; diện tích trồng đạt 5 triệu ha năm 2004 Lợi nhuận

đạt được 1 tỉ USD/năm từ đậu tương, ngô và bông chuyển gen Nam Phi là một nước

đứng đầu về công nghệ sinh học ở châu Phi Từ năm 2004 các cây ngô, đậu tương

và bông biến đổi gen đã được phép trồng thương mại Trong Liên minh Châu âu (EU), Tây Ban Nha là nước có diện tích trồng cây biến đổi gen lớn nhất, trong đó riêng ngô chuyển gen đã chiếm tới 32.000 ha, đậu tương biến đổi gen vẫn đứng đầu trong các loại cây trồng biến đổi gen, chiếm 55% diện tích trồng trọt của thế giới (Clive, 2005) [59]

Một số nước ASEAN như Thái lan, Philippin, Malaysia cũng đã tham gia vào lĩnh vực nghiên cứu cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam, nghiên cứu chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng cũng đã bắt đầu với mong muốn tạo ra và đưa vào ứng dụng các giống cây trồng có khả năng tự chống chịu sâu bệnh Tại Viện Công nghệ Sinh học, gen mã hoá lectin và α-AI ở đậu cô ve đã được phân lập và tạo dòng (Lê Thị Thu Hiền & CS, 1999) [7], gen mã hoá RIP cũng được phân lập và biểu hiện thành công trong vi khuẩn, nấm men (Nguyễn Văn Đạt & CS, 2000; Nguyễn Thuý Hà & CS, 1999; Nguyễn Huy Hoàng & CS, 2000) [3], [4], [8]

Đặc biệt, phương pháp chuyển gen nhờ A tumefaciens cũng đã được áp dụng

ở một số phòng thí nghiệm và thu được những kết quả khả quan trên các loại cây

trồng như lúa, cải bắp, bông, đu đủ, khoai tây, khoai lang, ngô…(Nguyễn Thị Liên Chi & CS, 1994; Trần Bích Lan & CS, 1998; Hoàng Kim Oanh & CS, 1998; Nguyễn Thị Thanh & CS, 1999; Mai Trường & CS, 1998; Đặng Trọng Lương, 2001;

Đặng Trọng Lương & CS, 2001; Nguyễn Hữu Hổ & CS, 2003) [2], [11], [12], [14], [16], [9], [10], [6] Tuy nhiên, nghiên cứu về biến nạp gen ở cây ngô vẫn còn rất ít

ỏi Các nghiên cứu trên cơ sở dự án hợp tác giữa Viện Di truyền Nông nghiệp và Công ty KWS là những nghiên cứu mở đầu đối với đối tượng cây trồng quan trọng này

1.3 Công nghệ sinh học và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô ở Việt nam

Thành công của kỹ thuật gen trong tạo giống cây trồng phụ thuộc vào 3 yếu

tố cơ bản sau:

- Thiết kế hợp lý gen và hệ điều hành của gen

- Kỹ thuật chuyển và lắp ghép gen vào vị trí thích hợp trong nhiễm sắc thể và hệ gen của tế bào

- Hệ thống nuôi cấy và tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh

Thành tựu nổi bật trong lĩnh vực này là hệ thống tái sinh cây lúa từ nuôi cấy

tế bào phôi hoá Thông qua chuyển gen vào hệ thống tế bào có khả năng tái sinh cao này, vài nghìn dòng lúa chuyển gen với các tính trạng khác nhau đã được tạo ra (Cheng & CS, 1998) [37] ở ngô và một số cây trồng khác, người ta chưa thể chuyển các gen mong muốn vào các dòng giống có giá trị thương mại một cách trực

tiếp do các giống này không có hoặc có khả năng tái sinh rất yếu trong nuôi cấy in

vitro Vì vậy, trước hết người ta chuyển gen vào hệ thống tế bào nuôi cấy tái sinh

mạnh Sau khi tạo ra cây mang gen mới, người ta phải thực hiện phép lai ngược (back-cross) để tạo ra dòng thuần có giá trị thương mại (Đỗ Năng Vịnh, 1989) [45]

Sử dụng các giống có khả năng tái sinh cao in vitro là cơ sở không thể thiếu

của các thao tác chuyển gen Viện Di truyền NN đã thành công trong việc xây dựng

hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây ngô in vitro từ tế bào phôi non, nuôi cấy noãn và

bao phấn ngô

1.3.1 Các nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn ngô

Nghiên cứu về đơn bội ở ngô đã bắt đầu tại Viện Di truyền nông nghiệp từ năm 1995 Các nghiên cứu này đã khẳng định khả năng ứng dụng có hiệu quả của quy trình nuôi cấy bao phấn trong chọn giống ngô ở Việt nam

1.3.2 Nuôi cấy no∙n chưa thụ tinh

Ngoài nuôi cấy bao phấn, Viện Di truyền Nông nghiệp cũng phát triển công nghệ tạo dòng thuần bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Phương pháp này có khả năng khắc phục các nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bao phấn, tạo dòng thuần với hiệu quả cao hơn và dễ ứng dụng hơn trong điều kiện ở Việt Nam Bằng phương pháp này, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo ra một số cặp lai có triển vọng đang được khảo nghiệm để phát triển thành giống

Viện Di truyền Nông nghiệp đã trao đổi nguồn gen với các đồng nghiệp quốc

tế và nhập nội các dòng ngô có khả năng tái sinh cao dùng để chuyển gen Viện đã tiến hành lai các dòng nhập nội này với các giống ngô Việt Nam để chuyển nguồn gen có khả năng tái sinh cao, thích hợp cho chuyển gen vào ngô Việt Nam Quy trình tái sinh cây từ phôi non các dòng ngô nhập nội có khả năng tái sinh cao đã

được nghiên cứu hoàn thiện

1.4 Các nghiên cứu chuyển gen ở cây ngô

Trên cơ sở chuyển gen vào tế bào trần ở ngô nhiều quy trình chuyển gen khác nhau ở ngô đã được thiết lập Những thành công đầu tiên được tiến hành bằng các phương pháp xung điện hay sử dụng polyethylene glycol Tuy nhiên, hệ thống tái sinh từ tế bào trần ở ngô có hiệu quả rất thấp do thời gian tạo tế bào huyền phù lâu, trong khi đó khả năng tái sinh của tế bào giảm nhanh cùng với thời gian nuôi (Fromm & CS, 1985; Rhodes & CS, 1988) [53], [88]

Nghiên cứu của Graves và Goldman (1986) [57] cho thấy các tế bào phôi và

tế bào lá mầm của hạt ngô nảy mầm đã được lây nhiễm với Agrobacterium để tạo ra

các cây chuyển gen Shen & CS (1993) [96] đã nhận được cây ngô chứa gen ngoại

lai GUS thông qua phương pháp chuyển gen gián tiếp Agrobacterium Ishida & CS

(1996) [67] đã thành công trong chuyển gen vào phôi non bằng cách lây nhiễm với

Agrobacterium Nghiên cứu của Yuji và CS (1996) [30], biến nạp gen có hiệu quả

đối với dòng ngô A188 ở giai đoạn hợp tử, với tần số biến nạp đạt 5-30%, phần lớn các thể biến nạp đã thể hiện rõ sự phát sinh hình thái bình thường, trên 70% cá thể trổ cờ, phun râu tốt Các con lai F1 giữa A188 và 5 dòng nội phối khác mang gen ngoại lai ở tần số thấp Đặc biệt với nghiên cứu gần đây nhất của Frame và CS (2002) [51] đã thu được các cây ngô chuyển gen (tần số biến nạp gen đạt 5,5%) khi

sử dụng dòng lai Hi II và chủng A tumefaciens EHA 101 mang vectơ nhị phân chứa gen bar và gen gus

Các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển gen cũng đã được tối ưu hoá

(chủng Agrobacterium, kiểu gen thực vật, thành phần môi trường nuôi cấy, nhiệt

độ ) (Kaeppler & CS, 2001) [71]

Năm 1996, Artzen đã tìm ra phương pháp tăng cường hiệu quả chuyển gen ở

cây một lá mầm thông qua Agrobacterium bằng cách làm tổn thương mô trước khi

ở Việt nam, với đặc thù của nền nông nghiệp luân canh nhiều vụ nên ngô thường được trồng xen giữa hai loài cây trồng khác do vậy mà các nhà chọn giống Việt nam cũng rất quan tâm đến các giống ngô ngắn ngày (giống ngắn ngày không làm ảnh hưởng đến vụ thu hoạch trước và sau ngô)

Một trong những hướng mới trong chọn tạo các giống ngô ngắn ngày là phương pháp sử dụng kỹ thuật di truyền để xác định các gen liên quan tới quá trình

điều khiển thời gian ra hoa và sử dụng các gen này để biến đổi các dòng chín muộn thành các giống chín sớm

Một trong những gen có tiềm năng rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây

trồng là phân đoạn ADN được tách chiết từ Sinapis alba - FPF1 - Flower Promoting

Factor Sau khi chuyển vào Arabidopsis thailiana đã rút ngắn rất đáng kể thời gian sinh trưởng của Arabidopsis Nhiều phòng thí nghiệm đang nghiên cứu chuyển gen

này vào cây ngô cũng như các loại cây trồng khác nhằm rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây

1.5.2 Chọn tạo giống có khả năng chịu lạnh

Tác động lạnh là một vấn đề chính ảnh hưởng đến sản xuất ngô ở các vùng

ôn đới Khả năng mẫn cảm với nhiệt độ lạnh ở ngô là do nguồn gốc nhiệt đới của

nó Nhiệt độ lạnh là nhiệt độ từ 5-160C ảnh hưởng không tốt đến cây ngô con trong giai đoạn sinh trưởng đầu tiên, ảnh hưởng tới sự hình thành lá và sự phát triển của

bộ máy quang hợp trong sinh trưởng dị dưỡng của cây con mới nảy mầm (Artus &

CS, 1996; Jaglo-Ottosen & CS, 1998) [21], [68]

Các yếu tố stress của môi trường như nhiệt độ thấp, mất nước đều dẫn đến tổn thương màng tế bào hoặc làm tăng các radical tự do trong tế bào Một số gen mã hoá các protein làm ổn định cấu trúc màng hay tiêu diệt các radical tự do như dehydrine, superoxy dismutase, peroxidase, catalase là những gen hiện nay đang

được quan tâm để tách chiết và chuyển vào cây trồng với mục đích làm tăng khả năng chống chịu đối vơi các điều kiện bất lợi của môi trường (Stamp, 1994; Thomashow, 1998) [101], [103]

1.5.3 Tăng cường khả năng hấp thụ ni tơ

ở các nước công nghiệp, việc sử dụng phân nitơ ngày càng tăng trong vài thập kỷ qua Điều này dẫn đến làm ô nhiễm nước bề mặt bởi nitrat Bên cạnh các yếu tố về môi trường, việc nhập khẩu phân bón cũng cần phải được xem xét Cộng

đồng châu Âu đang giảm dần trợ cấp giá cho các sản phẩm nông nghiệp Hậu quả của các yếu tố này là lợi nhuận của việc nhập khẩu phân bón đang giảm Do vậy cải tạo cây trồng với việc cải thiện hiệu quả sử dụng nitơ là rất cần thiết để đáp ứng nhu cầu của hệ thống sản xuất nông nghiệp trong tương lai (Engels & Marschner, 1995) [47]

Các nghiên cứu về ngô nhiệt đới và ngô Corn-Belt cho thấy chọn giống ngô thích nghi với điều kiện thiếu nitơ là có thể thực hiện được Các nghiên cứu về hiệu

quả sử dụng nitơ ở trường Đại học Hohenheim (Đức) cũng đã khẳng định rằng khả năng thay đổi về mặt di truyền thích nghi với hàm lượng nitơ trong đất thấp tồn tại sẵn trong các giống ngô lai châu Âu (Agrama & CS, 1999) [17] Các giống ngô có kiểu gen cố định nitơ có khả năng quang hợp cao hơn và kết hạt tốt hơn so với các giống ngô trồng trong điều kiện cung cấp nitơ cao Thời kỳ ra hoa và giai đoạn ngắn sau khi ra hoa là giai đoạn phát triển quan trọng cần nhiều nitơ (Presterl & CS,

1997) [83]

Các nhà khoa học Đức ở các công ty KWS và Planta hiện nay đã phân lập

đựơc các gen khử nitơ, gen vận chuuyển nitrat, gen vận chuyển ammonium, urea, aminoacid, gen nitrate reductase Một trong các gen này sẽ được lựa chọn để chuyển vào ngô

Chương 2

Lựa chọn đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Mục tiêu của đề tμi

Đề tài tập trung giải quyết các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau đây: Xây dựng quy trình chuyển gen hiệu quả cao ở ngô (tại Việt nam) và lúa mỳ (tại

CHLB Đức) sử dụng phương pháp biến nạp thông qua Agrobacterium và súng bắn

gen Trên cơ sở đó thực hiện việc chuyển các gen ngắn ngày, gen tăng cường hấp thụ nitơ, gen chịu lạnh và một số gen kháng bệnh khác vào ngô và lúa mỳ nhằm mục đích cải thiện các đặc tính chất lượng quan trọng ở hai cây trồng quan trọng này

2.2 Nội dung nghiên cứu cần thực hiện

2.2.1 Tách chiết và tái tổ hợp gen, thiết kế vectơ mang gen

Các vectơ mang gen chỉ thị (gus, gfp) & gen chọn lọc nptII, các gen chín sớm,

gen chịu lạnh, gen tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, do phía đối tác là Công ty KWS/PLANTA (CHLB Đức) thiết kế Các vectơ chuyển gen này sẽ được chuyển giao cho Viện Di truyền Nông nghiệp để chuyển vào cây ngô

2.2.2 Xây dựng hệ thống tái sinh và biến nạp di truyền

Nội dung nghiên cứu của đề tài được tiến hành trên hai đối tượng cây trồng: ngô và lúa mỳ, trong đó Viện Di truyền Nông nghiệp (Việt Nam) sẽ thực hiện các nghiên cứu trên cây ngô, Trung tâm nghiên cứu PLANTA/KWS (CHLB Đức) sẽ triển khai các nghiên cứu ở cây lúa mỳ

2.2.2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và mô đơn bội ở ngô

2.2.2.1.1 Tái sinh cây từ phôi non

Các dòng ngô H99 và A188 là những dòng ngô có khả năng tái sinh cây từ phôi non rất cao Phần lớn các công trình chuyển gen ở ngô trên thế giới đều dựa vào hệ thống tái sinh của 2 dòng này hoặc các con lai của chúng

Trên cơ sở các dự án hợp tác quốc tế, Viện Di truyền nông nghiệp đã nhập nội các dòng ngô có khả năng tái sinh cao dùng để chuyển gen là các dòng A188 và H99 Viện đã tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng nhập nội này trong điều kiện Việt Nam Quy trình tái sinh cây từ phôi non sử dụng các dòng ngô A188 và H99 và các con lai của chúng đang được nghiên cứu hoàn thiện

2.2.2.1.2 Tái sinh cây từ mô đơn bội

Mô đơn bội có thể là mô hình lý tưởng cho việc chuyển gen Sau khi chuyển gen có thể dùng các tác nhân lưỡng bội hoá để tạo ra dòng đồng hợp tử ngay từ thế

hệ đầu tiên thay vì phải làm thuần trong nhiều thế hệ khi chuyển gen vào mô soma Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo ra những giống ngô có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn – CM8, CM7, CM2, F18, F4 Từ 30 bao phấn nuôi cây trong đĩa Petry có thể tạo ra hàng trăm phôi đơn bội Quy trình tái sinh các phôi này thành cây sẽ được tối ưu hoá để nâng cao hiệu quả tái sinh

2.2.2.1.3 Tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao bằng phương pháp di truyền

Các nghiên cứu trước đây tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp trên một

số giống ngô đã cho thấy rằng bằng phương pháp lai hữu tính các giống ngô có phản ứng thấp trong nuôi cấy bao phấn với các giống ngô nhập nội có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn kèm với tái sinh cây từ F1 và lai ngược với các giống ngô Việt nam có thể tạo ra giống ngô Việt nam có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn (Lê Huy Hàm & CS 1999) [5]

Đối với cây ngô, vấn đề tái sinh in vitro gặp rất nhiều khó khăn, ngoại trừ

một số dòng có khả năng tái sinh cao như: A188, H99, HiII, hầu hết các dòng ngô khác có khả năng tái sinh kém Vì vậy việc chọn tạo được các dòng ngô Việt Nam

có khả năng tái sinh cao là hết sức cần thiết Các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao sẽ được tạo ra bằng phương pháp lai hữu tính giữa các giống Việt Nam với dòng nhập nội có khả năng tái sinh cao, kết hợp tái sinh cây từ phôi non Các công việc lai tạo đã được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp từ năm 2001

2.2.2.2 Thiết lập hệ thống chuyển gen ở cây ngô

Hai phương pháp chuyển gen sẽ được nghiên cứu và tối ưu hoá: Chuyển gen

thông qua Agrobacterium và chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

Phương pháp biến nạp dùng súng bắn gen: Sẽ nghiên cứu tối ưu hoá các chỉ tiêu sau: áp suất He, khoảng cách bắn cho từng loại mô sử dụng để chuyển gen

Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium: Các điều kiện lây nhiễm của Agrobacterium, tác dụng của các aldehit đối với từng loại mô (phôi non, mô sẹo

từ phôi non, phôi đơn bội, mô sẹo đơn bội) sẽ được nghiên cứu để tăng cường hiệu quả chuyển gen

2.2.2.3 Chuyển gen vào ngô với các gen quan tâm

Các gen chín sớm, gen chịu lạnh, gen tăng cường hấp thụ nitơ sẽ được biến nạp vào ngô bằng các phương pháp chuyển gen đã được tối ưu hoá

2.2.2.4 Phân tích cây chuyển gen

Các dòng ngô chuyển gen tạo được phải được phân tích và khẳng định là cây chuyển gen thực sự thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử Xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây ngô chuyển gen được tiến hành bằng kỹ thuật PCR, với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển

Lai DNA Southern Blot được thực hiện nhằm xác định gen chuyển được gắn vào genom của cây chuyển gen tái sinh hay không

Mặt khác, hoạt tính gen chuyển còn được thử bằng các phép thử chỉ thị như: thử tính kháng kháng sinh, thử tính kháng thuốc diệt cỏ ở quy mô phòng thí nghiệm

và nhà lưới

2.3 Vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu

2.3.1.1 Vật liệu thực vật

Các dòng ngô được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

• Hai dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 là 2 dòng có khả năng tái sinh cao, do Viện Công nghệ liên bang Thuỵ sỹ ETH cung cấp

• 10 dòng ngô thuần của Việt nam: GA, GB, G35, G2, G3, G5, GC2, GC8, GS3, GX2, được chọn lọc từ tập đoàn ngô của Viện Di truyền nông nghiệp

• 10 dòng ngô lai F1: GAA (GAxHR8); GAB (GBxHR8); GA35 (G35xHR8); GA2 (G2xHR8); GA3 (G3xHR8); GA5 (G5xHR8); GCA2 (GC2xHR8); GCA8 (GC8xHR8); GSA3 (GS3xHR8); GXA2 (GX2xHR8); GCH8 (GC8xHR9); GH35 (G35xHR9); đ−ợc tạo ra trên cơ sở phép lai giữa các dòng ngô Việt Nam và dòng nhập nội HR8/HR9, trong đó dòng HR8/HR9 đ−ợc sử dụng làm dòng bố

2.3.1.2 Các chủng vi khuẩn Agrobacterium, plasmid DNA, vật t− và hoá chất

Các chủng vi khuẩn E coli, Agrobacterium, plasmid DNA đ−ợc sử dụng

trong các thí nghiệm biến nạp gen vào cây ngô do Công ty KWS/Planta; Đại học Tổng hợp Hamburg (CHLB Đức) và Viện Công nghệ liên bang ETH, (Thuỵ sỹ) cung cấp thông qua thoả thuận chuyển giao nguyên vật liệu (MTA) gồm:

• Các chủng vi khuẩn E coli mang plasmid pDB1; pSLGUSINTPAT; pAHC25 mang gen chỉ thị gus mã hoá cho protein β-glucuronidase và gen chọn lọc bar mã

hoá cho enzym phosphynothrycin transferase mã hoá cho enzym phosphynothrycin transferase

Plasmid pUB-GFP mang gen gfp mã hoá cho protein phát huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent protein); Plasmid p35PAT: mang gen chọn lọc pat mã

hoá cho enzym phosphynothrycin transferase, đ−ợc điều khiển bởi đoạn khởi động CaMV35S

• Chủng Agrobacterium ATHV mang vectơ:

- pBINGUSINT mang gen chỉ thị gus-intron mã hoá cho protein β-glucuronidase và gen chọn lọc nptII mã hoá cho enzym neophosphotransferase Các trình tự mã hoá cho gen gus và nptII đã đ−ợc thêm đoạn khởi động CaMV35S-P và NOS

- pBIN4F4 và pBINIIIE9: mang gen chọn lọc nptII mã hoá cho enzym neophosphotransferase và gen 4F4/IIIE9 quy định đặc tính chống chịu lạnh Các trình tự mã hoá cho gen 4F4/IIIE9 và nptII đã đ−ợc thêm đoạn khởi động NOS và

Chúng tôi sử dụng hệ thống chuyển gen PDS 1100/He (BioRad, USA) để tiến hành các thí nghiệm bắn gen Các hạt vàng có kích thước 0.6/1um , màng nổ (900-1800psi), màng dừng, màng mang do hãng BioRad (Đức) cung cấp

2.3.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

2.3.2.2.1 Phương pháp tách, nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non

Bắp non sau khi thụ phấn khoảng 18-20 ngày được thu để tách phôi trong

điều kiện vô trùng Phôi non được cấy trong môi trường với cách đặt phôi theo mô tả của Green & Phillips (1975) [78]

Tạo mô sẹo, tái sinh cây theo quy trình của Armstrong & Green (1985) [20]

có cải tiến

2.3.2.2.2 Phương pháp tách, nuôi cấy và tái sinh cây từ bao phấn

Cờ ngô được thu vào giai đoạn tiểu bào tử đơn nhân, được xử lý lạnh 140C thời gian 7 ngày Khử trùng và cấy mẫu với mật độ 30 bao phấn/đĩa Petry Đĩa Petry cùng với bao phấn được xử lý lạnh 140C, 7 ngày trong tối sau đó được chuyển sang

260C trong tối Sau 21 ngày kể từ khi cấy, bao phấn được cấy chuyển sang môi trường tái sinh Các phôi tạo thành được cấy chuyển sang môi trường tái sinh mới khi đạt kích thước 2-3 mm

2.3.2.3 Cải thiện khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam bằng phương

pháp di truyền

Tiến hành lai hữu tính các dòng ngô Việt Nam (VN) có phản ứng thấp trong nuôi cấy phôi non với các dòng ngô nhập nội HR8/HR9 có phản ứng cao trong nuôi cấy phôi non Tái sinh cây từ phôi non (FN)

Chọn lọc các dòng FN có khả năng tái sinh cao, sinh trưởng tốt và lai ngược trở lại với các dòng ngô Việt nam Tái sinh cây từ phôi non, thu nhận dòng FNBcr1

Tiến hành liên tục các phép lai ngược dòng FNBcr với dòng VN và tái sinh cây, chọn lọc các dòng có khả năng sinh trưởng tốt, mang các đặc tính giống dòng

VN Sau 3-5 thế hệ có thể tạo ra dòng ngô Việt nam có phản ứng cao trong nuôi cấy phôi non và thích ứng tốt trong điều kiện Việt Nam (Lê Huy Hàm & CS 1999,

2000) [5], [72]

2.3.2.4 Phương pháp biến nạp gen

2.3.2.4.1 Phương pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen

• Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli

ADN plasmid được tách, tinh sạch theo quy trình của Sambrook & CS, (2001) [91]

• Các phần tử vàng được bọc bởi ADN plasmid theo phương pháp của Sanford

& CS, (1993) & Becker & CS, (1994) [93], [23] có cải tiến

• Tối ưu hoá các chỉ tiêu sau: áp suất He, khoảng cách bắn cho từng loại mô

sử dụng để chuyển gen, kích thước và hàm lượng hạt vàng

• Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy, chọn lọc cây tái sinh để thu được hiệu quả chuyển gen cao

2.3.2.4.2 Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

• Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy mô tế bào và tái sinh cây,

• Tiến hành lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Agrobacterium, diệt khuẩn và chọn

dòng mô sẹo và cây tái sinh

• Tối ưu hoá các điều kiện lây nhiễm, tác dụng của các aldehit, nuôi cộng sinh, chọn lọc cây tái sinh để thu được hiệu quả chuyển gen cao

2.3.2.5 Phương pháp đánh giá cây chuyển gen

• Tiến hành sàng lọc cây chuyển gen tái sinh trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc

• Sàng lọc cây chuyển gen bằng phản ứng PCR gen chuyển

• Lai DNA Southern Blot để xác định số lượng bản gen chuyển trong genom

cây chuyển gen nhận được

• Đánh giá hoạt tính gen chuyển bằng phép thử

• Đưa cây chuyển gen ra đất trồng, theo dõi khả năng sinh trưởng, phát triển,

độ hữu thụ và thu hạt thế hệ R1

2.4 Dạng sản phẩm kết quả tạo ra

• Các dòng ngô có khả năng tái sinh cao, thích hợp cho biến nạp di truyền trong

điều kiện Việt Nam

• Các dòng ngô mang gen chín sớm, gen chịu lạnh, gen tăng cường hấp thụ nitơ

• Quy trình tái sinh cây từ phôi non hiệu quả cao

• Quy trình tái sinh phôi tạo thành từ nuôi cấy bao phấn

• Quy trình chuyển gen vào cây ngô thông qua thông qua vi khuẩn

Agrobacterium và súng bắn gen

2.5 Nhu cầu kinh tế, xã hội và địa chỉ áp dụng

• Tạo được những quy trình kỹ thuật nền về chuyển gen ở cây trồng, góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chọn tạo giống cây trồng bằng công nghệ sinh học

• Các giống ngô, lúa mỳ ngắn ngày sẽ góp phần tăng cường luân canh xen vụ, qua đó làm tăng diện tích trồng trọt và sản lượng Các giống ngô được cải thiện khả năng hấp thụ nitơ cho phép giảm chi phí phân bón, chống ô nhiễm môi trường Những giống này đặc biệt thích nghi với các vùng miền núi nơi khả năng đầu tư của người dân hạn chế Các giống ngô chịu lạnh đảm bảo an toàn cho vụ ngô đông tại các vùng trồng ngô phía Bắc

• Đưa công nghệ tạo cây chuyển gen thành một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống truyền thống, đồng thời nâng cao năng lực tiếp cận các lĩnh vực khoa học hiện đại trong tạo giống cây trồng

Chương 3

Những nội dung vμ kết quả đ∙ thực hiện

3.1 Xây dựng hệ thống tái sinh

3.1.1 Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non

3.1.1.1 Cơ sở khoa học và các nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro

Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh là tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu biến nạp gen Sau đây là những hệ thống nuôi cấy thường

được sử dụng:

• Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di truyền thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di

truyền cao Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan của thực vật như

thân, rễ, lá, hoa trong môi trường chứa chất điều hoà sinh trưởng nhóm auxin với điều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo có thể được duy trì liên tục trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kì (Lê Trần Bình & CS, 1997 [1])

3.2 Xây dựng Hệ thống tái sinh

3.2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non

3.2.1.1 Cơ sở khoa học và các nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro

3.2.1.2 Vật liệu và phương pháp

3.2.1.3 Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non

3.2.1.4 Quy trình tái sinh cây từ phôi non

3.2.1.5 Đánh giá khả năng tái sinh của một số dòng ngô Việt Nam

3.2.2 Xây dựng hệ thống tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn

3.2.2.1 Đặt vấn đề

3.2.2.2 Vật liệu và phương pháp

3.2.2.3 Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn

3.2.2.4 Tối ưu hoá quy trình tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn

3.2.2.5 Quy trình tái sinh cây từ bao phấn

3.2.3 Tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao bằng phương pháp di

truyền

3.2.3.1 Vật liệu và phương pháp

3.2.3.2 Kết quả chọn tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao

3.1.4 Kết luận

• Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi trường lỏng Các tế bào này cũng được tạo từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là thời gian nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây (Dix, 1986 [44])

• Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh khi được nuôi cấy trên môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo

và tái sinh thành cây hoàn chỉnh ứng dụng có ý nghĩa nhất của phương pháp này là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và biến nạp gen

Nhằm mục đích xây dựng một hệ thống nuôi cấy tái sinh cây phục vụ chuyển gen chúng ta cần nghiên cứu đến khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển gen trên môi trường chọn lọc Do vậy hệ thống nuôi cấy huyền phù thường hiếm khi

được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen, đặc biệt chuyển gen nhờ vi khuẩn

Agrobacterium Trong khi đó, hệ thống nuôi cấy qua mô sẹo lại rất thích hợp với

một số ưu điểm như có tỉ lệ tái sinh cây cao, thời gian nuôi cấy không quá dài, thao tác nuôi cấy đơn giản Tái sinh cây qua con đường mô sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh tạo chồi trực tiếp Tuy nhiên, cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một

tế bào đơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh nên duy trì được tính

đồng nhất của hệ gen và do vậy hạn chế hiện tượng khảm ở cây chuyển gen (Lê Trần Bình & CS, 1997 [1])

Lần đầu tiên cây ngô in vitro đã được Green và Philips (1975) [58] tái sinh từ

các mẫu phôi non Tiếp theo đó có nhiều nghiên cứu thành công về tái sinh cây ngô

từ các nguồn vật liệu khác nhau như bao phấn (Ting & CS, 1981) [104], phôi non (Lu & CS, 1982; Lu và Vasil, 1983; Vasil & CS, 1984) [75] [74] [112], tế bào mày ngô (Suprasanna & CS, 1986) [102], hoa non (Pareddy và Petolino, 1990) [82], cờ non (Rhodes & CS, 1986; Songstad & CS, 1992) [87], [99], mẩu lá (Conger & CS, 1987; Ray và Gosh, 1990) [41], [86], đoạn thân cây con (Santos & CS, 1984) [94],

chồi đỉnh (O’Connor-Sánchez & CS, 2002; Zhong & CS, 1992) [80], [120] và mô phân sinh chồi đỉnh (Sairam & CS, 2003; Zhang & CS, 2002) [90], [119]

Nhìn chung, hệ thống tái sinh cây đạt hiệu quả cao hơn cả là tái sinh thông qua mô sẹo tạo thành từ phôi non Phôi non được sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ở ngô (Lu & CS, 1982; Lu và Vasil, 1983; Vasil

& CS, 1984) [75], [74], [112], nhưng việc thu nhận thường xuyên vật liệu phôi non gặp nhiều khó khăn và việc có được phôi non ở giai đoạn thích hợp cho nuôi cấy cũng bị hạn chế (Huang & Wei, 2004) [66] Để có được hiệu quả tái sinh cao thì

cần phải nghiên cứu sự phát sinh hình thái của phôi non trong điều kiện in vitro và

các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi

Sự phát triển của phôi ngô non trong điều kiện in vitro

Matthys-Rochon & CS (1998) [77] khi nghiên cứu sự phát triển in vitro của

phôi ngô non từ các tế bào tiền phôi cho thấy thời gian để các tế bào này phát triển thành phôi ở giai đoạn 1-2 dài hơn so với ở cây từ 1-2 ngày và cần khoảng 2 tháng

để phát triển thành cây trưởng thành Và cũng cần lưu ý rằng mùa vụ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào tiền phôi Từ tháng 5 đến tháng 9, khả năng phát triển của chúng đã tăng một cách đáng kể Loại đường sử dụng trong môi trường nuôi cấy cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi Đường sucrose sẽ

được biến đổi thành glucose và fructose Fructose được xem như là một nguồn cacbon không có hiệu quả (Vasil, 1984) [112] do vậy có thể các tế bào phôi hoá sẽ

sử dụng glucose trước sau đó mới sử dụng fructose Maltose sẽ được biến đổi thành hai phân tử đường glucose, do vậy loại đường này sẽ là nguồn dinh dưỡng có hiệu quả hơn đối với phôi Nhận xét này cũng tương tự với kết luận của một số tác giả khi nghiên cứu vai trò kích thích của đường maltose trong quá trình nuôi cấy các tế bào sinh dục của các cây ngũ cốc

Việc xác định đúng vị trí đặt phôi trên môi trường nuôi cấy là rất cần thiết

đối với sự sinh trưởng bình thường của phôi Trong tự nhiên, tế bào scutellum tiếp xúc trực tiếp với nguồn dinh dưỡng: nội nhũ Việc tiếp xúc trực tiếp của các tế bào

scutellum với lớp tế bào dưới sẽ dẫn tới việc cung cấp đầy đủ dinh dưỡng từ môi trường cho phôi

Một yếu tố quan trọng cuối cùng đó là ảnh hưởng của kiểu gen lên sự phát

triển của phôi A188 được xem như là kiểu gen thích hợp cho nuôi cấy in vitro

(Armstrong và Green, 1985) [20]

Để tránh sử dụng phôi non, Zhong & CS (1992) [120] đã tạo cụm chồi thành

công với tần số cao từ chồi đỉnh của các cây con nảy mầm từ hạt trong điều kiện in

vitro 36 dòng ngô khác nhau đã được thí nghiệm bằng phương pháp này và tần số

tái sinh dao động từ 24% đến 97% Hệ thống tái sinh cây từ chồi đỉnh này cũng đã

được áp dụng thành công trong các nghiên cứu cải thiện di truyền ở ngô Zhong &

CS (1996) [18] đã tái sinh hiệu quả các cây ngô chuyển gen bằng phương pháp bắn gen sử dụng chồi đỉnh Cũng tương tự, O’Connor-Sánchez & CS (2002) [80] đã nhận được các cây chuyển gen của các dòng ngô nhiệt đới và cận nhiệt đới bằng cách bắn gen vào các mô sẹo đã biệt hoá và các mô sẹo phôi hoá tạo thành từ chồi

đỉnh Zhang & CS (2002) [119] cũng đã chuyển gen vào các tế bào mô phân sinh chồi nhận được từ các cây con nảy mầm từ hạt của các dòng ngô thuần bằng phương pháp bắn gen Sairam & CS (2003) [90] cũng đã thu được các cây ngô chuyển gen bằng cách lây nhiễm trực tiếp mô phân sinh chồi đỉnh với các chủng vi khuẩn

Agrobacterium mang vectơ chứa gen gfp

Các nghiên cứu tái sinh cây thông qua mô sẹo tạo thành từ phôi trưởng thành

đã được thực hiện ở các cây ngũ cốc (Rueb & CS, 1994; Ozgen & CS, 1998; Akula

& CS, 1999; Ward & Jordan, 2001) [89], [81], [18], [117] Green & CS (1974) [59] lần đầu tiên đã báo cáo về sự hình thành mô sẹo từ phôi ngô trưởng thành, tuy nhiên

họ đã không tái sinh được cây Việc sử dụng phôi trưởng thành tách từ hạt khô làm nguồn vật liệu ban đầu có nhiều ưu điểm hơn so với phôi non: phôi dễ tách, có thể

có số lượng lớn cho mỗi thí nghiệm và chủ động hơn trong việc cung cấp nguồn vật liệu Tuy nhiên, tái sinh cây từ phôi trưởng thành sẽ khó hơn từ phôi non Wang (1987) [116] đã tái sinh cây thành công từ phôi trưởng thành của hai dòng ngô B73

và Mo17, nhưng khả năng tái sinh phụ thuộc nhiều vào kiểu gen và tần số tái sinh

rất thấp (chỉ đạt 4-5%), đối với dòng ngô A632 đã không thu được cây tái sinh Tiếp theo đó, Huang & Wei (2004) [66] đã tái sinh cây thành công từ phôi trưởng thành của 7 dòng ngô thuần với tần số tương đối cao (dao động từ 19,8% đến 32,4%), và

đặc biệt với dòng Mo17 đạt 25,6% So sánh với khả năng tái sinh rất cao của các cụm chồi nhân từ chồi đỉnh, tần số tái sinh cây từ mô sẹo phôi hoá tạo thành từ phôi trưởng thành vẫn còn thấp hơn (Huang & Wei, 2004) [66]

3.1.1.2 Vật liệu và phương pháp

3.1.1.2.1 Vật liệu

Các dòng ngô được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

• Hai dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 là 2 dòng có khả năng tái sinh cao, do Viện Công nghệ liên bang Thuỵ sỹ ETH cung cấp

• 10 dòng ngô thuần của Việt nam: GA, GB, G35, G2, G3, G5, GC2, GC8, GS3, GX2, được chọn lọc từ tập đoàn ngô của Viện Di truyền nông nghiệp

• 10 dòng ngô lai F1: GAA (GAxHR8); GAB (GBxHR8); GA35 (G35xHR8); GA2 (G2xHR8); GA3 (G3xHR8); GA5 (G5xHR8); GCA2 (GC2xHR8); GCA8 (GC8xHR8); GSA3 (GS3xHR8); GXA2 (GX2xHR8) được tạo ra trên cơ sở phép lai giữa các dòng ngô Việt Nam và dòng nhập nội HR8, trong đó dòng HR8

b) Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Thu mẫu và tách phôi

Cây ngô mẹ cho phôi nuôi cấy được gieo trồng vào vụ đông và vụ xuân hàng năm (từ tháng 9 đến tháng 5) Bắp non sau khi thụ phấn khoảng 18-20 ngày được thu và giữ ở 40C tối đa 5 ngày để tách phôi Khử trùng bề mặt ngoài của bắp bằng ethanol

70%, bóc bỏ các lá bao ngoài và tách phôi trong điều kiện vô trùng Phôi non được cấy trong môi trường với cách đặt phôi theo mô tả của Green & Phillips (1975) [78]

Môi trường và điều kiện nuôi cấy (phụ lục 1, bảng 1.1)

Hai loại môi trường cơ bản được sử dụng: môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) [79] và môi trường N6 (Chu & CS, 1975) [40]

Môi trường tạo mô sẹo (CN6): môi trường N6 bổ sung 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D,

100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline (Armstrong & Green, 1985) [20]

Trong thí nghiệm nghiên cứu cải thiện khả năng tái sinh chồi từ phôi non chúng tôi sử dụng môi trường cơ bản với thành phần khoáng và vitamin khác nhau (MS hoặc N6) có bổ sung AgNO3 nồng độ từ 0-30mg/l

Mẫu phôi non được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo CN6, trong điều kiện tối ở nhiệt độ 260C ± 2, thời gian từ 2-3 tuần Mô sẹo tạo thành được tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện chiếu sáng thời gian 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 1200-1600 lux

Tất cả các môi trường nuôi cấy đều sử dụng chất giá thể là phytagel 0.3%,

pH môi trường được điều chỉnh bằng 5,8 trước khi khử trùng Mật độ cấy 15 phôi/đĩa Petri chứa 10ml môi trường Mỗi công thức thí nghiệm được làm với 12

đĩa, tương ứng với 180 phôi tách từ 3 bắp

c) Cải thiện khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam bằng phương pháp di truyền

Tiến hành lai hữu tính các dòng ngô Việt Nam (VN) có phản ứng thấp trong nuôi cấy phôi non với các dòng ngô nhập nội HR8/HR9 có phản ứng cao trong nuôi cấy phôi non Tái sinh cây từ phôi non (FN)

Chọn lọc các dòng FN có khả năng tái sinh cao, sinh trưởng tốt và lai ngược trở lại với các dòng ngô Việt nam Tái sinh cây từ phôi non, thu nhận dòng FNBcr1

Tiến hành liên tục các phép lai ngược dòng FNBcr với dòng VN và tái sinh cây, chọn lọc các dòng có khả năng sinh trưởng tốt, mang các đặc tính giống dòng

phôi non và thích ứng tốt trong điều kiện Việt Nam (Lê Huy Hàm & CS 1999,

2000) [5], [72] Các bước tiến hành được mô tả trong sơ đồ dưới đây

d) Các chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%): số mô sẹo tạo thành/tổng số phôi nuôi cấy;

Tỷ lệ mô sẹo phôi hoá (%): số mô sẹo phôi hoá/tổng số mô sẹo tạo thành;

Tỷ lệ tái sinh chồi (%): số chồi tái sinh/tổng số mô sẹo phôi hoá

3.1.1.3 Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non

3.1.1.3.1 Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của 2 dòng ngô nhập nội HR8, HR9 trong điều kiện Việt Nam

Hai dòng ngô HR8 và HR9 là 2 dòng ôn đới có khả năng tái sinh cao, do vậy việc xác định thời vụ thích hợp để gieo trồng trong điều kiện khí hậu Việt nam là rất cần thiết Chúng tôi đã tiến hành gieo trồng dòng HR8 và HR9 trong các vụ đông,

vụ xuân và vụ hè từ năm 2000-2003

Tiếp tục lai ngược với dòng VN vμ tái sinh cây từ nuôi cấy phôi non con lai, sau 4-5 thế hệ tạo ra các giống ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao Các dòng nμy có thể hoμn toμn sử dụng

để chuyển gen ngô ở Việt Nam

FNBcr2 x VN (nuôi cấy FN, tái sinh cây)

FNBcr3 x VN (nuôi cấy FN, tái sinh cây)

Sơ đồ chọn tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao

Bảng 1 Đánh giá một số chỉ tiêu nông học của các dòng ngô nhập nội HR8 vμ HR9

qua các thời vụ trồng trong điều kiện Việt nam

Số nhánh

cờ

Chiều dài cờ (cm)

Chiều cao cây (cm)

Đường kính bắp (cm)

Số hạt/bắp

Trọng lượng

1000 hạt (g)

Mặt khác, khi gieo trồng vào vụ hè thì khả năng sinh trưởng và phát triển của cả 2 dòng HR8 và HR9 rất kém: dòng HR8 cây không phát triển được, cờ bé, lép, không có phấn (hình 1.6), cây chỉ đạt chiều cao khoảng 30-40cm sau đó lụi dần và chết; đối với dòng HR9 thì khả năng sinh trưởng và phát triển cũng kém hơn hẳn so với vụ đông và vụ xuân, cây thấp, yếu, chiều cao cây trung bìmh đạt 73,7cm, cờ bé,

ít nhánh (2,4 nhánh) và hầu như không có phấn (hình 1.7), bắp nhỏ, đường kính bắp

đạt 2,3cm, ít hạt (25,6 hạt/bắp) (hình 1.8)

3.1.1.3.2 Đánh giá khả năng tái sinh cây từ phôi non của 2 dòng nhập nội HR8

và HR9 trong điều kiện Việt Nam

Bắp của 2 dòng HR8 và HR9 sau khi thụ phấn 18-20 ngày được thu để tách phôi Các phôi có kích thước tương đối đồng đều, khoảng 1-2mm được cấy trong môi trường CN6 có bổ sung 10mg/l AgNO3 (các phôi có kích thước lớn hơn hoặc nhỏ hơn đều bị loại bỏ) Kết quả thu được trình bày ở bảng 2 và 3

Xét ảnh hưởng của thời vụ trồng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 và HR9: tỷ lệ tạo mô sẹo cũng như tái sinh cây của cả hai dòng HR8 và HR9 trong vụ đông đạt giá trị cao hơn vụ xuân, tuy nhiên sự sai khác này không

Hình 1 Mô tả hình thái, sinh trưởng vμ phát triển của hai dòng ngô nhập nội HR8 vμ HR9 qua các thời vụ trồng trong điều kiện Việt Nam: 1, 2, 3 Cây, cờ vμ bắp dòng HR8 trồng vμo vụ đông; 4, 5 Cây vμ bắp dòng HR9 trồng vμo vụ đông 6 Cờ dòng HR8 trồng vμo vụ

hè (cờ lép, không có phấn); 7, 8 Cờ vμ bắp dòng HR9 trồng vμo vụ hè