Khảo sát thành phần và độc tính của tuyến độc tố ba loài ốc cối conus stritatus, conus textile và conus vexillum

i L ỜI CÁM ƠN Để hoàn thành chương tr ình đ ại học và viết luận văn này, tôi đ ã nh ận được sự hướng dẫn và giúp đỡ của các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nha Trang. Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gửi lời cám ơn đến các thầy cô, đặc biệt là những thầy cô đ ã t ận tình dạy bảo và truyền đạt cho tôi những bài học bổ ích, những kinh nghiệm quý báu của bản thân trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến TS. Đặng Thúy Bình, người đ ã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình h ư ớng dẫn tôi suốt quá trình nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin cám ơn Cử nhân Nguyễn Thanh Sơn, cán bộ tổ nghiên cứu và thầy Nguyễn Ái Thưởng, Viện vaccine Nha Trang đ ã h ết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong việc phân tích sắc ký và thử nghiệm độc tố trên chuột. Xin cám ơn cô Nguyễn Thị Anh Thư và Văn Hồng Cầm đ ã t ận tình giúp đ ỡ để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cám ơn các thầy cô trong hội đồng xét duyệt đề tài đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn thiện đồ án tốt nghiệp này. Sau cùng, từ tận đáy l òng tôi xin đư ợc cám ơn gia đ ình đã v ất vả, hy sinh để tôi có được như ngày hôm nay. Xin được cám ơn bạn bè và các anh chị học viên cao học đ ã hư ớng dẫn, giúp đỡ, cổ v ũ đ ộng viên tiếp thêm nghị lực cho bản thân tôi. Mặc dù tôi đ ã có nhi ều cố gắng để hoàn thiện luận văn, nhưng trong quá tr ình thực hiện không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp của quý thầy cô và các bạn. Tôi xin chân thành cám ơn! Nha Trang, ngày 2 tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Ngô Thị Anh Khôi ii MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỞ ĐẦU IV DANH MỤC CÁC HÌNH VI DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU IX CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1 1.1. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI 1 1.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của ốc cối 1 1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố 3 1.1.3. Đặc điểm sinh học, sinh sản của ốc cối 5 1.1.4. Chế độ ăn và phương thức săn mồi 8 1.1.5. Giá trị kinh tế và dược liệu 10 1.1.5.1. Giá trị kinh tế 10 1.1.5.2. Giá trị dược liệu 11 1.2. TỔNG QUAN TUYẾN NỌC ĐỘC VÀ ĐỘC TỐ ỐC CỐI 12 1.2.1. Cấu tạo tuyến nọc độc 13 1.2.2. Tổng quan về độc tố ốc cối 17 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ ỐC CỐI 27 1.3.1. Một số nghiên cứu về di truyền độc tố ốc cối trên thế giới 27 1.3.2. Một số nghiên cứu ốc cối trong nước 32 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP THU MẪU 34 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.1.1. Conus stritatus 34 2.1.1.2. Conus textile 35 2.1.1.3. Conus vexillum 36 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu và phương pháp thu mẫu 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 iii 2.2.1. Giải phẫu tách tuyến độc tố 39 2.2.2. Tách chiết và tinh chế độc tố ốc thô 39 2.2.3. Tinh sạch và xác định các phân đoạn peptide bằng sắc ký lọc gel 39 2.2.4. Thử nghiệm độc tố trên chuột 41 2.2.5. Xác định các phân đoạn peptide bằng HPLC 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1. TINH SẠCH ĐỘC TỐ THÔ CỦA BA LOÀI ỐC CỐI BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CÁC PHÂN ĐOẠN PEPTIDE THU ĐƯỢC TRÊN CHUỘT 44 3.1.1. Conus stritatus 44 3.1.1.1. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 44 3.1.1.2. Thử nghiệm độc tính các phân đoạn peptide thu được sau khi tinh sạch trên chuột và xác định liều độc thấp nhất gây chết 45 3.1.2. Conus textile 46 3.1.2.1. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 46 3.1.2.2. Thử nghiệm độc tính các phân đoạn peptide thu được sau khi tinh sạch trên chuột và xác định liều độc thấp nhất gây chết 46 3.1.3. Conus vexillum 48 3.1.3.1. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 48 3.1.3.2. Thử nghiệm độc tính các phân đoạn peptide thu được sau khi tinh sạch trên chuột và xác định liều độc thấp nhất gây chết 48 3.2. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN PEPTIDE ĐỘC TỐ BẰNG HPLC 50 3.2.1. Conus stritatus 50 3.2.2. Conus textile 52 3.2.3. Conus vexillum 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 61 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 iv MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học biển phong phú. Đến nay, các nhà khoa học đ ã phát hi ện được trên 11.000 loài sinh vật sống trong vùng biển Việt Nam. Trong đó, có khoảng 6.000 loài động vật đáy; 2.458 loài cá với trên 100 loài cá kinh tế; 653 loài rong biển; 657 loài động vật nổi; 537 loài thực vật nổi; 94 loài thực vật ngập mặn; 225 loài tôm biển; 14 loài cỏ biển; 15 loài rắn biển; 25 loài thú biển; 5 loài rùa biển và 43 loài chim nước. Trong thành phần động vật biển, một số loài thuộc nhóm giáp xác bơi nghiêng (Amphipoda) có kích thước bé được phát hiện là những loài mới cho khoa học và đ ã đư ợc mô tả (http://vea.gov.vn). Tuy nhiên, hiện nay với tình trạng khai thác thủy hải sản một cách bừa bãi và thực trạng ô nhiễm môi trường thì sự suy thoái đa dạng sinh học đang ngày càng nghiêm trọng và là vấn đề cấp thiết cần phải giải quyết. Ốc cối là một trong những nguồn lợi hải sản có mức độ phong phú về thành phần loài, có giá trị thực phẩm và kinh tế cao ở nước ta. Song hiện nay, do sự khai thác bừa bãi và ô nhiễm môi trường nên số lượng ốc có chiều hướng suy giảm nghiêm trọng. Nhiều loài ốc có nguy cơ bị tuyệt chủng trong đó có ốc cối. Ốc cối là động vật thân mềm ăn thịt, có nọc độc và sống chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới trong những rạn san hô. Vỏ ốc cối có màu sắc sặc sỡ với những hoa văn đẹp mắt nên rất được ưa chuộng để làm đồ mỹ nghệ, đồ trang sức, đồ lưu niệm. Chính điều này đ ã d ẫn đến tình trạng khai thác quá mức cho phép làm cho ốc cối có khả năng bị tuyệt chủng vì vậy để bảo vệ đa dạng sinh học và các nguồn lợi do loài ốc này mang lại cần có biện pháp bảo vệ phù hợp. Ngoài giá trị về mặt thẩm mỹ, ốc cối còn mang lại các lợi ích vô cùng to lớn trong l ĩnh v ực y dược. Độc tố của ốc cối còn đư ợc biết đến như là một loại dược liệu quí để chữa các cơn đau mãn tính, ung thư và nhiều bệnh khác (Oliverra, 2002; Terlau và Olivera, 2004; Puillandre và cs, 2010). Thuốc tổng hợp từ độc tố ốc cối có tác dụng giảm đau gấp hàng ngàn lần morphine mà không gây nghiện. Tuy v nhiên, hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều đề tài nghiên cứu về độc tố của các loài ốc này. Vì các lý do trên nên đ ề tài của chúng tôi được tiến hành với các mục đích :  Tách chiết và tinh chế độc tố ốc thô, định hướng cho các nghiên cứu chuyên sâu  Thử nghiệm các phân đoạn peptide của độc tố 3 loài ốc cối: Conus stritatus, Conus textile, Conus vexillum trên chuột để xác định liều độc thấp nhất gây chết, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược  Bước đầu khảo sát thành phần của độc tố trên HPLC/UV-Vis vi DANH M ỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 : Hình ảnh một số loài ốc cối 2 Hình 1.2 : Cấu tạo bên trong của ốc cối 3 Hình 1.3 : Bản đồ phân bố ốc cối trên thế giới 5 Hình 1.4 : Conus lividus với viên nang trứng màu hồng nhạt ở phần miệng 7 Hình 1.5 : Phương thức săn mồi dạng móc câu 9 Hình 1.6 : Phương thức săn mồi dạng lưới 10 Hình 1.7 : Cấu trúc tuyến nọc độc của Conus textile 14 Hình 1.8 : Cấu trúc răng kitin 16 Hình 1.9 : Sơ đồ độc tố ốc cối gồm các superfamily, kiểu liên kết disulfide và các đích dược tính 19 Hình 2.1: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus stritatus 34 Hình 2.2: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus textile 35 Hình 2.3: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus vexillum 36 Hình 2.4: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 38 Hình 2.5: Nguyên lý ph ương pháp s ắc kí lọc gel 40 Hình 2.6: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 43 Hình 3.1: Kết quả tinh sạch độc tố thô của Conus stritatus bằng sắc ký lọc gel 44 Hình 3.2: Kết quả tinh sạch độc tố thô của Conus textile bằng sắc ký lọc gel 46 Hình 3.3: Kết quả tinh sạch độc tố thô của Conus vexillum bằng sắc ký lọc gel 48 Hình 3.4: Phổ sắc ký đồ của Conus stritatus ở 4 tube 50 Hình 3.5: Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở 4 tube 52 vii Hình 3.6: Phổ sắc ký đồ của Conus vexillum ở 4 tube 54 viii DANH M ỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các superfamily của conotoxin và conopeptide 21 Bảng 1.2: Các peptide độc của ốc cối có tiềm năng y học 23 Bảng 3.1: Kết quả thử độc tính các phân đoạn peptide của Conus stritatus sau khi được tinh sạch trên chuột 45 Bảng 3.2: Kết quả thử độc tính các phân đoạn peptide của Conus textile sau khi được tinh sạch trên chuột 47 Bảng 3.3: Kết quả thử độc tính các phân đoạn peptide của Conus vexillum sau khi được tinh sạch trên chuột 49 ix DANH M ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮ T VÀ KÍ HI ỆU ACN Aceton Nitrile CO1 Cytochrome oxydase 1 ESTs Express sequence tags HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC-ESI-MS High Performance Liquid Chromatography – Electrospray Tandem Mass Spectrometry ITS2 Internal Transcribed Spacer 2 MALDI MS Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Mass Spectrometry mtDNA mitochondria DNA nAChR nicotinic acetylcholine receptor NET Norepinephrine transporter NMDA N-methyl-D-aspastale NSADI Non Steroidal Anti-inflammatory PTMs Post-translational modifications TFA Tri Flo Acid acetic α alpha γ gamma δ delta κ kappa μ mu ρ rho x σ sigma τ tau χ chi ψ psi ω omega [...]... cứu về các conotoxin của ốc cối có thể ứng dụng vào y dược 1.2 TỔNG QUAN TUYẾN NỌC ĐỘC VÀ ĐỘC TỐ ỐC CỐI Ốc cối là loài di chuyển chậm nên dễ bị các loài động vật ăn thịt khác tấn công hoặc bị giành mất con mồi Do đó, muốn tồn tại và phát triển cơ thể chúng phải có cấu tạo đặc biệt để thích nghi với điều kiện môi trường, cơ quan đó chính là tuyến nọc độc Tuyến nọc độc tiết ra nọc độc giúp chúng bắt mồi... lượng tuyến độc và khối lượng túi độc là mạnh nhất vì túi đ ộc là bộ phận lớn nhất của tuyến nọc độc Giữa khối lượng thân và khối lượng tuyến độc có tương quan nhưng chưa mạnh, không phải lúc nào khối lượng thân lớn thì tuyến độc cũng lớn Tuyến nọc độc của ốc cối chuyên biệt cho từng loại con mồi, đối với cá là loài di chuyển nhanh nên thời gian phóng kim tiêm và tiêm nọc độc phải nhanh, nọc độc mạnh... (conopressin) và thụ thể neurotensin (contulakins) (Terlau và Olivera, 2004) Mỗi loài ốc chứa một loại độc tố riêng, mỗi loại độc tố lại là một hỗn hợp các peptide độc rất phức tạp, có cấu trúc và tính dược lý đặc trưng Sự phân bố các gốc cystein tạo nên các peptide đặc trưng cho từng loài và hoạt động sinh học của chúng cũng khác nhau Các peptide độc tố ốc cối có chiều dài ngắn hơn so với các loài có nọc độc. .. trục của cơ thể, lõm về phía đỉnh vỏ, lồi về phía ngược lại Túi nọc độc là cơ quan lớn nhất trong tuyến nọc độc, có chức năng tiết ra độc tố, đồng thời tạo ra áp lực khi bơm độc tố vào con mồi  Ống dẫn độc: là đường dẫn chính trong tuyến nọc độc, có vai trò dẫn chất độc từ túi nọc độc đi tới răng kitin để tiêm vào con mồi, có màu vàng nhạt, trong cơ thể ốc nó cuộn thành bó nằm trong phần lõm của túi... độc tố ốc cối chia làm 2 nhóm: các conotoxin giàu liên kết disulfide và nhóm không giàu liên kết này Ở đây chỉ trình bày các supperfamily của các peptide giàu liên kết disulfide Danh pháp sử dụng theo McIntosh và cs (1999) và Olivera (2002) 20 1.2.2.1 Phân loại độc tố ốc cối Độc tố ốc cối được phân ra thành 6 superfamily (A-, M-, O-, P-, S-, và T-) dựa trên khung cystein của chúng, sự tương đồng của. .. (Lewis, 2009; Terlau và Olivera, 2004) 1.2.1 Cấu tạo tuyến nọc độc Nghiên cứu của Marshall và cs (2002) mô tả cấu trúc mô học của ống dẫn độc và túi răng kitin đồng thời cho biết chức năng của các bộ phận trong tuyến nọc độc của Conus californicus Kết quả cho thấy phần đầu ống dẫn độc là một lớp biểu mô phức tạp chuyên biệt cho hoạt động vận chuyển chất độc, phần ống dẫn độc ngoại biên bao gồm một loạt... acid amin, ốc ăn cá 13-15 acid amin Mỗi loài ốc cối có tương tác sinh học khác nhau, do đó sự phân hóa của độc tố là điều tất nhiên Ốc cối phân bố rộng rãi ở vùng biển nhiệt đới, mạng lưới phức tạp của các tương tác sinh học trong khu hệ sinh vật biển đa dạng như vậy tạo cơ hội cho mỗi loài ốc cối tích lũy thành phần độc tố đặc trưng, khác biệt với các loài khác trong quá trình tiến hóa của chúng (Olivera,... ống dẫn độc ở loài cá ngắn hơn, túi nọc độc lớn hơn do chứa nhiều chất độc Ốc cối là giống có phương thức dinh dưỡng chuyên biệt quan hệ mật thiết với sự hình thành độc tố, chúng ngày càng thu hút sự quan tâm của con người bởi sự đa dạng và những peptide có giá trị Hình 1.7: Cấu trúc tuyến nọc độc của Conus textile (http://www.sydneyshellclub.net/shellers/0898/0898.htm) 15 Răng kitin của ốc cối giống... 23 cm, nhưng hầu hết các loài đều có kích thước dưới 8 cm và khối lượng dưới 100 g (Rockel và cs, 1995)  Tập tính sống Ốc cối thường sống đơn lẻ, nhưng một số loài được tìm thấy với số lượng lớn ở một số khu vực riêng biệt Ốc cối thuộc loài sống trong nước, thở bằng mang Chúng thường ẩn mình vào ban ngày và chỉ chui ra săn mồi vào ban đêm Ốc cối cảm nhận được sự hiện diện của những sinh vật khác ở... (Vermivorous) Ốc cối ăn các loài giun biển được gọi là vermivorous, đây là nhóm lớn nhất trong giống Conus, săn chủ yếu giun biển/ giun nhiều tơ, chúng sử dụng hệ thống phân loại độc tố tương tự như ốc ăn cá và nhuyễn thể Khi con mồi bị tiêm nọc độc và tê liệt, ốc cối sẽ nhanh chóng tiêu hóa chúng Hầu hết các loài ốc cối ăn giun biển thường không gây độc cho con người do tính chất vốn có của nguồn thức . ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus stritatus 34 Hình 2.2: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus textile 35 Hình 2.3: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus. ỐC CỐI 12 1.2.1. Cấu tạo tuyến nọc độc 13 1.2.2. Tổng quan về độc tố ốc cối 17 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ ỐC CỐI 27 1.3.1. Một số nghiên cứu về di truyền độc tố ốc cối trên thế giới 27 1.3.2 Conus stritatus, Conus textile, Conus vexillum trên chuột để xác định liều độc thấp nhất gây chết, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược  Bước đầu khảo sát thành phần của độc tố