Một số nghiên cứu ốc cối trong nước

Các nghiên cứu về ốc cối ở Việt Nam cho đến nay mới chỉ được thực hiện ở việc khảo sát, thu thập mẫu và tư liệu liên quan; xác định độc tính và kiểm chứng tính chất của một số độc tố (http://www.vnio.org.vn/). Nghiên cứu của Viện Hải

dương học Nha Trang (2003) chỉ mới dừng lại ở việc xác định các đặc điểm nhận dạng hình thái, sinh học, sinh thái, tính độc và triệu chứng ngộ độc của các sinh vật biển mang độc tố, trong đó có 2 loài ốc cối đó là ốc cối địa lý (Conus geographus) vàốc cối hoa lưới (C. textile).

Từ năm 2008 đến nay Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nha Trang đã tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm di truyền và độc tố của các loàiốc cối. Phạm Thu Thủy và cs (2011) đã phân loại 18 loài thu được bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử 16S rDNA ty thể. Ngô Đăng Nghĩa và cs (2011) nghiên cứu thành phần khối lượng của các bộ phận của tuyến độc, thành phần conopeptid và thửnghiệm độc tính trên chuột. Kết quảcho thấy mỗi loại ốc cối có số lượng peptid khá lớn từ 50 đến trên 100 loại và cóảnh hưởng đến thần kinh chuột, với liều lượng lớn có thểgây tửvong.

Để xác định di truyền quần thể của Conus textile tại 4 khu vực địa lý thuộc vùng biển Nam Trung Bộ(Lý Sơn, Cù Lao Chàm, Vân Phong và Sông Cầu), Lê Thị Thu Hà (2011) đã giải mã trình tự gen CO1 của DNA ti thểcủa 45 cá thể. Nghiên cứu cho thấy quần thểC. textile thểhiện sự đa dạng di truyền cao với 23 haplotype/ 45 cá thể. Haplotype gốc được tìm thấyởcả3 quần thể, trừquần thểCù Lao Chàm. Sự khác biệt trình tự dao động từ 0,2 – 1% ở trong và 0,5 – 4.8% giữa các cá thể trong quần thể. Quần thểLý Sơn và Cù Lao Chàm phân tách rõ rệt vềmặt di truyền, trong khi đó quần thể Vân Phong và Sông Cầu có sựtrộn lẫn. Với mức độ trôi dạt gen thấp, quần thể C. textileở vùng biển Nam Trung Bộcó thểmới được phân tách gần đây.

Bình Đặng Thúy và cs (2011) đã nghiên cứu xác định thành phần loài, đặc điểm phân bốcủaốc cối tại vịnh Vân Phong (Khánh Hòa) và xây dựng bản đồphân

bốcủa một số loài phổbiến. Tổng số 19 loài đãđư ợc tìm thấy tại 10 điểm thu mẫu đại diện cho mùa khô và mùa mưa. Số lượng cá thể/điểm thu mẫu vào mùa khô cao hơn mùa mưa và dao động từ15–55/100m2. Các loài phổ biến là Conus textile (83 cá thể/ 8 điểm thu mẫu); C. striatus (54 cá thể/10 điểm thu mẫu); C. vexilum (42 cá thể/8 điểm thu mẫu); và C. miles (38 cá thể/6 điểm thu mẫu). Bản đồ phân bố của các loài ốc phổ biến cho thấy ốc cối hiện diện ở hầu hết các điểm thu mẫu nhưng mật độ phân bố mùa khô cao hơn mùa mưa (lần lượt là 29-55 và 12-22). Dữ liệu trên làm cơ sở cho các nghiên cứu bảo tồn nguồn lợi giống ốc cối có giá trị kinh tế và y học.

Nguyễn Lương Hiếu Hòa và cs (2011)đã giải phẫu, tách chiết tuyến nọc độc và khảo sát mối quan hệ với phương thức dinh dưỡng ba loài ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ đại diện cho cácphương thức dinh dưỡng khác nhau C. striatus (ăn cá), C. textile (ăn động vật thân mềm) và C. vexillum (ăn giun biển). Kết quả cho thấy loài ăn cá có khối lượng tuyến nọc độc lớn hơn, răng kitin nhiều ngạnh hơn so với hai loài còn lại. Điều này có thể kết luận tuyến nọc độc và độc tính của ba loàiốc cối có quan hệmật thiết với môi trường sống và chế độ dinh dưỡng.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP THU MẪU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1. Conus stritatus

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lương Hiếu Hòa (2011) cho thấy : Conus

stritatus có vỏ dạng trứng thuôn dài, láng, miệng vỏ dài, hoa văn gồm có hai màu nâu và đen xen kẽ, tháp vỏnhỏdần từ đáy lên đỉnh vỏ cũng gồm hai màu nâu đen. Khối lượng trung bình 76,519,86 g và chiều dài vỏtrung bình 8,660,61 cm.

Túi nọc độc của C. stritatus có hình lưỡi liềm, màu trắng sữa, nằm vuông góc với trục của cơ thể, lõm về phía đỉnh vỏ, lồi về phía ngược lại, phình to hơn ởphần nối với ống dẫn độc. Vòi hút dài, màu cam nhạt. Ống dẫn độc màu vàng nhạt nối dài từ túi độc đến túi răng kitin. Túi răng kitin dài, màu vàng nhạt, hơi đục, cong như lưỡi liềm, gồm 2 nhánh: nhánh dài chứa các răng còn non, nhánh ngắn chứa các răng trưởng thành.

Hình 2.1 : Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus stritatus

Conus textile có hoa văn màu nâu, dạng lưới không đều, phân bốtoàn thân và vùng tháp vỏ, trên thân còn có những đốm lớn màu nâu, miệng vỏ hẹp và dài, mép ngoài miệng vỏ mỏng, tháp vỏcũng nhỏ dần từ đáy lên đỉnh vỏ nhưng cao hơn so với loài C. stritatus.

Khối lượng thân trung bình 62,92 15,76 g và chiều dài vỏtrung bình 7,97  0,83 cm. Túi nọc độc của C. textile cũng có hình lư ỡi liềm, màu trắng sữa, thuôn nhọn hai đầu. Ống dẫn độc rất dài, màu vàng nhạt. Vòi hút ngắn, màu hơi đỏ. Túi răng kitin thuôn nhọn, màu vàng đục hơi đỏ, cũng gồm nhánh dài và nhánh ngắn (Nguyễn Lương Hiếu Hòa, 2011).

Hình 2.2: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus textile

2.1.1.3. Conus vexillum

Conus textile có hoa văn màu nâu, dạng lưới không đều, phân bốtoàn thân và vùng tháp vỏ, trên thân còn có những đốm lớn màu nâu, miệng vỏ hẹp và dài, mép ngoài miệng vỏ mỏng, tháp vỏ cũng nhỏ dần từ đáy lên đỉnh vỏ nhưng cao hơn so với loài C. stritatus.

Khối lượng thân trung bình 62,92 15,76 g và chiều dài vỏtrung bình 7,97  0,83 cm. Túi nọc độc của C. textile cũng có hình lư ỡi liềm, màu trắng sữa, thuôn nhọn hai đầu.Ống dẫn độc rất dài, màu vàng nhạt. Vòi hút ngắn, màu hơi đỏ. Túi răng kitin thuôn nhọn, màu vàng đục hơi đỏ, cũng gồm nhánh dài và nhánh ngắn (Nguyễn Lương Hiếu Hòa, 2011).

Hình 2.2: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus textile

2.1.1.3. Conus vexillum

Conus textilecó hoa văn màu nâu, dạng lưới không đều, phân bốtoàn thân và vùng tháp vỏ, trên thân còn có những đốm lớn màu nâu, miệng vỏ hẹp và dài, mép ngoài miệng vỏ mỏng, tháp vỏ cũng nhỏ dần từ đáy lên đỉnh vỏ nhưng cao hơn so với loài C. stritatus.

Hình 2.2: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus textile

Conus vexillum có vỏ thay đổi từnâu nhạt đến nâu đen, giữa thân có các vạch màu vàng nhạt song song với đường xoắn ốc, so với C. textile và C. stritatus,

C. vexillum có tháp vỏ mở rộng ở dưới đáy và bề ngang thân rộng hơn, phần dưới miệng vỏ tóp lại và có màu sậm hơn so với vùng thân trên. Khối lượng thân trung bình 74,50  20,14 g và chiều dài vỏ trung bình 8,88 0,63 cm. Tuyến nọc độc ở

loài C. vexillum có kích thước và khối lượng nhỏ hơn hai loài còn lại, túi nọc độc màu trắng sữa, cong hình lưỡi liềm. Ống dẫn độc có màu cam nhạt. Vòi hút ngắn, màu cam nhạt. Túi răng kitin rất nhỏ, nhỏ nhất trong 3 loài (C. vexillum: 1,05 

0,20, C. textile: 1,980,30, C. stritatus: 2,65 0,39) đoạn nối với hầu có màu trắng sữa, đoạn còn lại có màu cam hơi đỏ(Nguyễn Lương Hiếu Hòa, 2011).

Hình 2.3: Hình dáng bên ngoài và hình thái tuyến nọc độc của Conus vexillum

2.1.2. Địa điểm nghiên cứuvà phương pháp thu mẫu

 Địa điểm nghiên cứu

Ba loài ốc cối: Conus stritatus, C. textile và C. vexillum thu thập tại vùng biển Vịnh Vân Phong (Khánh Hòa)được sửdụng đểnghiên cứu độc tố.

 Phương pháp thu mẫu

Mẫu được thu 2 lần/năm, đại diện cho mùa mưa và mùa khô (tháng 5 và tháng 10 năm 2010) tại Vịnh Vân Phong, mẫu được giữ ở -70oC. Mẫu được thu theo phương pháp lặn quan sát mặt cắt (Transect surveys) và quan sát tự do không theo mặt cắt (free-swimming observations) (Hodgson, 1998; English và cs, 1997). Mẫu ốc cối được vận chuyển nhanh vềphòng thí nghiệm trong nitơ lỏng, lưu giữ ở-70oC cho các nghiên cứu tiếp theo.

Các thông tin liên quan đến địa điểm khảo sát (vị trí, thời gian) được mô tảvà ghi chép đầy đủ vào sổ nhật kí thực địa làm cơ sở cho việc lập bản đồvà phân tích sau này. Vị trí các mặt cắt (điểm khảo sát) có diện tích khoảng 100m2 và được định vị bằng máy định vị cầm tay GPS (Magellan JPS colour tract, hệqui chiếu GW 84, Đài Loan).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.4: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu Mẫuốc

Giải phẫu tách chiết tuyến độc tố

Cân, cắt nhỏ, nghiền nhuyễn, ngâm trong dung dịch TFA:CAN tỷlệ1:1

Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel Đông khô 24h Ly tâm 5000v/phút trong 15 phút Làm lạnh nhanh trong cồn và CO2rắn Phân tích HPLC/UV-Vis

2.2.1. Giải phẫu tách tuyến độc tố

Mẫuốc được lấy ra từtủ đông-70oC. Dùng búa đập vỡvỏ ốc (không đượcảnh hưởng đến nội quan bên trong). Đặt nội quan lên đĩa peptri (được giữ lạnh trên khay đá). Dùng dao mổ và kéo, cắt tại vị trí chứa tuyến nọc độc. Dùng panh, kéo loại bỏ các mô không dùng để nghiên cứu, chuyển tuyến nọc độc qua đĩa peptri mới đểphântách các cơ quan.

2.2.2. Tách chiết và tinh chế độc tố ốc thô

Chuẩn bị CO2 rắn: đầu tiên lắp khuôn đựng CO2 rắn có nối ống thông với bình CO2. Vặn xả van cho khí CO2 đi vào khuôn đến khi thấy tạo một lớp tuyết trắng bao phủ ngoài khuôn thì đóng van xả lại. Mở hộp khuôn sẽ thấy một khối CO2 rắn, màu trắng. Cắt khối CO2 này thành các khối nhỏ và cho vào cốc nhựa đựng sẵn cồn tuyệt đối.

Sau khi tách tuyến nọc độc, dùng pank và kéo cắt nhỏtuyến nọc độc, nghiền nhuyễn trong dung dịch TFA:CAN=1:1 để hòa tan độc tố. Dịch nghiền nhuyễn được ly tâmở 5000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏcặn và thu dịch lọc. Làm lạnh dịch lọcở -20oC trong 6h. Sau đó dịch lọc được ngâm chìm trong dịch cồn và CO2 rắn khoảng 15-30 phút rồi đưa vào máy đông khô. Mẫu được đưa vào máy đông khô (Thermo Savant-Mỹ) với chương trình như sau: Nhiệt độbuồng ngưng:-54oC. Áp suất buồng chứa mẫu: <100mT bar. Sau thời gian đông khô: 24 - 48h. Mẫu sau khi đông khô có dạng bột mịn màu trắng, xốp, nhẹ, được giữtrong lọ hàn kín nắp để bảo quản trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.3. Tinh sạch và xác định các phân đoạn peptide bằng sắc ký lọc gel

 Nguyên lý hoạt động

Phân tách protein, peptide hoặc các oligonucleotide dựa trên cơ sở kích thước. Các phân tửdi chuyển qua các cột trong đó có chứa các hạt gel, chúng có thểkhếch tán vào các hạt ở mức độ nhiều hay ít. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ đi vào các lỗ của các hạt gel, do đó sẽ di chuyển ra khỏi cột chậm hơn trong khi các phân tửcó

kích thước lớn sẽ đi vào hạt ít hơn hoặc không đi vào hạt khi đó chúng sẽ ra khỏi cột nhanh hơn. Cảtrọng lượng phân tửvà hình dạng phân tử đềuảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của chúng khi đi qua cột. Sắc kí lọc gel có thể được dùng để xác định kích thước phân tử, phân ly các thành phần trong hỗn hợp,…

Các hạt gel là những polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao, các loại gel thường dùng là: dextran, agarose, polyacrylamide, sephadex, sepharose và Bio-gel, đây là những loại gel phổbiến trên thị trường và có sẵn những hạt có lỗvới đường kính chuẩn là 100 µm.

Hình 2.6 : Nguyên lý phương pháp sắc kí lọc gel

(http://bricker.tcnj.edu/tech/BIOL311chromatography.htm)

 Tiến hành sắc kí

 Vật liệu:

- Cột sắc kí: d = 2,5 cm, h = 100 cm–Amersham

- Bộthu mẫu Collector Fraction 920–Amersham

Hình 2.6 : Nguyên lý phương pháp sắc kí lọc gel

(http://bricker.tcnj.edu/tech/BIOL311chromatography.htm)

 Tiến hành sắc kí

 Vật liệu:

- Cột sắc kí: d = 2,5 cm, h = 100 cm–Amersham

- Bộthu mẫu Collector Fraction 920–Amersham

Hình 2.6 : Nguyên lý phương pháp sắc kí lọc gel

(http://bricker.tcnj.edu/tech/BIOL311chromatography.htm)

 Tiến hành sắc kí

 Vật liệu:

- Cột sắc kí: d = 2,5 cm, h = 100 cm–Amersham

- Pump–LKB

- Gel Biogel P2–Amersham

- Acid acetic–Merck

- Tube 15–Nunc.

 Tiến hành

o Chuẩn bịcột Biogel

Cân 40 g gel Biogel–P2 cho vào 200 ml nước cất khuấy đều trong 4h. Cho từ từ dung dịch chứa gel vào cột để lắng tự nhiên đến khi lượng gel đầy cột. Dùng dung môi acid acetic 1% cân bằng cột với thể tích bằng 5 lần thể tích cột, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút.

o Tinh chế

Nạp mẫu bằng cách cho từ từ 2 ml vào cột, chờ cho mẫu thấm hoàn toàn vào gel. Cho thêm 1ml acid acetic vào cột để đưa mẫu vào hoàn toàn trong gel. Thôi mẫu: chạy mẫu bằng dung dịch acid acetic 1%, dòng chảy 1ml/phút, thu mẫu qua collector vào các tube, mỗi tube 2 ml.Đo OD280 nm các tube thu được.

2.2.4. Thửnghiệm độc tốtrên chuột

Sử dụng phương pháp sinh hoá trên chuột để quan sát những triệu chứng ngộ độc của độc tố ốc cối theo qui trình của Viện Vaccine Nha Trang. Thử nghiệm các peak độc tố trên chuột với các liều tiêm khác nhau (giảm dần từ1500-150 μl) theo đường tiêm vào tĩnh mạch đuôi và quan sát biểu hiện của chuột.

2.2.5. Xác định các phân đoạn peptide bằng HPLC

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột đi kèm với một detector nhạy để phát hiện các chất tách ra trong quá trình sắc

ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về detetor và cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độchảy thích hợp. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễphân