CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT pptx

PHẦN V CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 345 CẤU TRÚC vector plasmid MANG GEN KHÁNG SÂU VÀ ỨNG DỤNG TRONG TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính, gây đột biến…, ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã và đang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có lợi vào thực vật để tạo ra những cây trồng có tính trạng mà chúng ta mong muốn. Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi phí trong việc phòng trừ sâu hại. Các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào cây trồng để cây trồng tự sản sinh các protein gây chết sâu hại. Cây trồng mang gen kháng sâu Bt là một trong những thành tựu của công nghệ sinh học trong việc cải tiến cây trồng. Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính thuộc bộ Lepidoptera, Coleoptera và Diptera. Hiện nay ngoài việc cải tiến kỹ thuật chuyển gen Bt còn phải cải tiến gen thích hợp sao cho gen Bt, một gen của vi khuẩn có thể biểu hiện có hiệu quả trong thực vật. Phương pháp có hiệu quả để tạo cây chuyển gen là sử dụng súng bắn gen; tuy nhiên, đối với những cơ sở nghiên cứu chưa thể trang bị được thiết bị này thì việc chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp được lựa chọn; ngoài ra phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens còn có các ưu điểm riêng của nó mà các phương pháp khác không có được. Theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp, chúng tôi đã nghiên cứu tái cấu trúc vector plasmid mang ba gen là gen bar (gen chọn lọc), gen gusA (gen chỉ thị) và gen Bt cryIA nhằm tạo một số vector plasmid mới - được đặt tên là plasmid pITB (Institute of Tropical Biology). Nội dung bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tái cấu trúc và sử dụng các plasmid qua tái cấu trúc trong nghi ên cứu tạo cây cây hông và cây cải ngọt chuyển gen. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Cấu trúc plasmid mới  Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 được sử dụng để chuyển gen.  Chuẩn E. coli DH5: được dùng làm vi khuẩn có khả năng biến nạp. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 346  Plasmid pCAMBIA 3301, plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi. cryIA(c). 2. Chuyển gen vào cây Vật liệu và dòng vi khuẩn: Cây trong ống nghiệm được dùng làm vật liệu chuyển gen. Sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) EHA 105 chứa plasmid ITB mang gen cryIA(c), gen bar và gen gusA. Phương pháp chuyển gen vào cây hông (Paulownia fortunei): Sử dụng vi khuẩn At được lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 10mg/l BA) có bổ sung chất acetosyringone nồng độ 100 µM trong hai ngày. Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa 4mg/l PPT và 500mg/l cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh được cấy truyền sang môi trường cho ra rễ có chứa 4mg/l PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm. Phương pháp chuyển gen vào cây cải ngọt (Brassica integrifolia L.): Lá mầm với cuống lá dài 1-2mm của cây con từ hạt nẩy mầm 5-6 ngày tuổi được sử dụng làm mẫu chuyển gen. Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau đó các lá mầm được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 2mg/l NAA, 4mg/l BA và 3,3mg/l AgNO 3 ) trong hai ngày (có bổ sung acetosyringone nồng độ 100 µM). Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong thời gian 30 phút, chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa chất chọn lọc PPT và 500mg/l cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 4-5 tuần, mẫu có chồi tái sinh được cấy truyền sang môi trường ra rễ (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 6mg/l PPT). Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen:  Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37C, mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng sẽ không chuyển màu.  PCR gen cryIA(c): DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi chuyên biệt, quy trình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của Dellaporta (1983).  Các cây chuyển gen được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c) qua khả năng kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá trong đĩa pétri. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Cấu trúc plasmid mới Việc gắn gen cryIA(b) và cryIA(c) vào plasmid pCAMBIA 3301 để tạo plasmid mới như sau: Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 347  Vectơ plasmid CAMBIA 3301 có độ dài 12 Kb chứa gen gusA và gen bar. Có 14 enzyme giới hạn tại vị trí cloning site trong vùng T-DNA, ở đó cho phép tách hoặc ghép các đoạn gen mong muốn. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn Hind III (A/AGCTT) để cắt tạo hai đầu Hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301.  Plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) chứa gen cryIA có độ dài 4 kb, ở hai đầu của toàn bộ gen này (promoter-gen-terminator) có vị trí cắt bởi enzyme giới hạn Hind III. Nên chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn Hind III để cắt ở hai vị trí này.  Sau khi cắt bởi enzyme giới hạn Hind III các đoạn plasmid DNA đã được chạy điện di cho kết quả: với plasmid pCAMBIA đã được mở ra với hai đầu cắt bởi Hind III và được xử lý bởi AP (alkaline phosphat) để chúng khó có thể tự nối lại với nhau. C òn plasmid pUbi.cryIA do có hai vị trí cắt nên tạo ra hai đoạn: 6 kb DNA tương ứng với thân còn lại của plasmid và đoạn 4 kb tương ứng với đoạn gen cryIA. Sau đó tiến hành nối kết 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 12 kb và đoạn gen cryIA 4 kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4 o C trong thời gian 16 giờ. Kết quả đã tạo được 2 plasmid mới dài khoảng 16 kb. Để kiểm tra kết qủa này chúng tôi đã chuyển 2 plasmid mới vào vi khuẩn biến nạp E.coli, nhân bản E. coli và tách chiết ADN. Sử dụng lại enzyme giới hạn Hind III để cắt cho kết quả mỗi plasmid đã cho được hai băng DNA với 1 đoạn 12 kb và 1 đoạn 4 kb (xem ảnh 2 điện di) hoàn toàn phù hợp với kích thước plasmid mới được chúng tôi đặt tên là plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) chứa 3 gen và được chuyển vào dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105. Chuyển gen vào cây hông: Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn At, mẫu lá được đăt trên môi trường có PPT nồng độ 4mg/l, đa số các mảnh lá bắt đầu vàng sau 2 tuần nuôi cấy, một số mảnh lá vẫn duy trì màu xanh nhưng không hình thành mô sẹo, chỉ một số ít khoảng 10% hình thành mô sẹo và một số trong đó bắt đầu tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy. S au giai đoạn chọn lọc này các chồi con được chuyển sang môi trường MS để ra rễ với 4mg/l PPT. Và chỉ có vài dòng cây tiếp tục phát triển và ra rễ, được chúng tôi giả định là cây chuyển gen. Kết quả quá trình chuyển gen được thể hiện như sau: Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trường có 4mg/l PPT sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens và mẫu lá đối chứng Thí nghiệm Số mẫu lá Số mẫu lá tạo mô sẹo Số mẫu lá tái sinh chồi Số lượng dòng cây chuyển gen Tần số chuyển gen (%) Chuyển gen 580 52 21 5 0,8 Đối chứng 30 0 0 0 0 Để khẳng định đây là những cây hông chuyển gen, chúng tôi cấy cây hông giả định chuyển gen và cây đối chứng vào môi trường ra rễ với chất chọn lọc PPT nồng độ 4mg/l để thử khả năng chống chịu, sau 2 tuần toàn bộ cây đối chứng chết hoàn toàn, trong khi các cây chuyển gen vẫn tiếp phát triển và ra rễ, giúp chúng tôi khẳng định đây là những cây hông đã được chuyển gen. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 348 Sự biểu hiện gen gusA của cây chuyển gen: Các chồi nhỏ, mảnh lá của cây chuyển gen đã được xử lý với dung dịch X-Gluc, kết quả cho thấy chồi và mảnh lá này có màu xanh chàm đặc trưng khẳng định sự biểu hiện của gen gusA trong cây chuyển gen. Sự biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen: gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏ đã được khẳng định trong cây in vitro, tuy nhiên chúng tôi muốn tiếp tục khảo sát sự tồn tại ổn định và khả năng biểu hiện của gen này trên cây sau khi được trồng ra môi trường tự nhiên ngoài vườn ươm. Chúng tôi sử dụng nồng độ 300mg/l PPT để phun lên các cây đối chứng và cây chuyển gen 1 tháng tuổi tại vườn ươm. Sau 2 tuần nhận thấy các cây hông chuyển gen tiếp tục sinh trưởng và phát triển bình thường, chỉ có một dòng cây hơi bị vàng lá phía dưới nhưng vẫn sống và phát triển cho phép chúng tôi khẳng định một lần nữa đây là những cây hông đã nhận được gen chuyển. Sự hiện diện của gen cryIA(c) và khả năng kháng sâu của cây chuyển gen: Phân tích PCR với cặp mồi chuyên biệt cho gen cryIA(c) cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng. Qua đó chúng tôi khẳng định sự hiện diện của gen cryIA(c) trong nhiễm sắc thể của cây chuyển gen. Sau đó các cây hông chuyển gen được chuyển ra trồng trong vườn ươm. Để thử nghiệm tính kháng sâu các lá nhỏ được đặt trong đĩa pétri cùng sâu xanh Heliothis armigera. Sau 3 ngày, với các lá đối chứng diện tích lá bị hại lớn, kích thước sâu tăng rõ rệt, trong khi đó ở lá cây chuyển gen diện tích lá bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng tr ưởng rất kém và sau 3 ngày sâu hoàn toàn không còn ăn và chết nhiều vào ngày thứ 5 hoặc 6. Chuyển gen vào cây cải ngọt: Với phương pháp sử dụng lá mầm của cây con từ hạt nẩ y mầm 5-6 ngày tuổi, cấy lá mầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi nhúng cuống lá mầm vào dịch vi khuẩn để lây nhiễm, thời gian ủ với vi khuẩn l à hai ngày trên môi trường có bổ sung 100 µM Acetosyringone và sau khi rửa được cấy trên môi trường tái sinh có Cefotaxime 500mg/l và 4mg/l PPT thì sau 3-4 tuần các chồi tái sinh hình thành và chúng được cấy truyền trên môi trường MS có 6mg/l PPT để kiểm tra khả năng kháng PPT của cây. Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen nhiều lần với số mẫu trun g bình từ 80- 120 mẫu/lần. Kết quả được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Tỷ lệ tái sinh chồi và cây, trên môi trường có 4mg/l PPT, của các lá mầm được nhiễm với Agrobacterium tumefaciens v à của mẫu lá mầm đối chứng Thí nghiệm Số lá mầm thí nghiệm Số lá mầm tạo mô sẹo Số lá mầm tái sinh chồi Số lượng dòng cây giả định chuyển gen Tần số chuyển gen (%) Chuyển gen 1380 52 (3,7%) 21 ( 1,5%) 2 0,14 Đối chứng 30 0 0 0 0 Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy số lượng lá mầm chống chịu với chất chọn lọc 4mg/l PPT để hình thành mô sẹo khoảng 3,7% nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ở mức 1,5% và gần như đa số các chồi đều không phát triển và chết ở các lần cấy truyền sau, theo chúng tôi đây là hiện tượng được coi là escape khá phổ biến trong quá trình chuyển Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 349 gen hoặc chồi ở thể khảm và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với 6mg/l PPT - điều này cho thấy tần số chuyển gen thấp (0,14%). Chúng tôi cho rằng khi chuyển gen trên các đối tượng cây trồng khác như cây thuốc lá và cây hông thì mẫu lá có khả năng tái sinh chồi cao từ xung quanh rìa lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có thể xâm nhập vào nhiều vị trí có khả năng tái sinh này, trong khi ở cây cải ngọt lá mầm chỉ có thể tái sinh tại cuống lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chỉ có một vị trí duy nhất để có thể xâm nhiễm tạo cây chuyển gen. Các cây cải giả định chuyển gen đ ược phân tích PCR với cặp mồi chuyên biệt của gen cryIA(c) - cho thấy các mẫu DNA của cây giả định chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kíc h thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng. KẾT LUẬN Với việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB để chuyển gen, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây hông và cây cải ngọt chuyển gen mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử và sinh học chúng tôi đã xác định được của gen này hiện diện trong cây hông và cây cải ngọt chuyển gen và gen chuyển đã có biểu hiện tính trạng khá rõ rệt. Plasmid ITB (lane 2 và 3 mang gen cryIA(b) và cryIA(c) Phân tích PCR gen cryIA(c) ở cây hông chuyển gen (băng DNA 0,65 kb) Phân tích PCR gen cryIA(c) ở cây cải ngọt chuyển gen (băng DNA 0,65 kb) Cây cải ngọt giả định chuyển gen phát triển trên môi trường chọn lọc PPT Cây hông giả định chuyển gen phát triển trên môi trường chọn lọc PPT Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 350 LỜI CÁM ƠN Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình KC-04-13, Chương trình nghiên cứu cơ bản đã tài trợ thiết thực cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Tạo cây hông (Paulownia fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 16- 17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1088-1090. 2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt ( Brassica integrifolia) và nghiên cứu tạo cây cải ngọt chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống”, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr. 1194-1197. 3. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Khảo sát khả năng tái sinh cây in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống”, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr. 498-500. 4. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, 2003. Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây hông (Paulownia fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 866-869. 5. Murashige, T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497. 6. Pua, E. C., Barfield D. G., 1991. Gene transfer in plants of Brassica juncea using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Reports 10: 308-314. SUMMARY Construction of plasmid vector and utilization for production of transgenic plants resistant to insect via Agrobacterium tumefaciens Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen Institute of Tropical Biology New plasmid vector pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) consisting bar, cryIA(c) and gusA genes was constructed and applied to transfer into Agrobacterium tumefaciens EHA 105 for Paulownia and Brassica plants genetic transformation. Many transgenic lines of both plant cultivars were obtained. PCR analyses and indigogenic GUS assay were performed to confirm the presence and the expression of bar, cryIA(c) and gusA genes. Insect bioassays with larvae showed an improvement of resistance against Heliothis armigera. Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 351 TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀ CÔN TRÙNG Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới ĐẶT VẤN ĐỀ Một trong những yếu tố làm giảm năng suất cây trồng trên đồng ruộng hiện nay là những tác hại do sâu bệnh gây ra và việc phòng trừ dịch hại này thường gây sự ô nhiễm môi trường ngày càng nghiêm trọng. Vấn đề này chỉ có thể được giải quyết thông qua sự kết hợp giữa khoa học hiện đại v à ý thức giữ gìn sinh thái môi trường. Một trong những ứng dụng của công nghệ sinh học để giải quyết vấn đề tr ên là tạo ra những cây trồng tự bản thân có khả năng chống chịu với các loại sâu bệnh. Trong các loại côn trùng gây hại thì rầy, rệp chiếm vai trò quan trọng, việc chích hút nhựa của chúng làm cây không phát triển đồng thời chúng là nguồn lây lan một số bệnh virus quan trọng như virus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được xem là một phương pháp có hiệu quả, là phương pháp qua đó kết quả chuyển gen thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) t ương đối đơn giản, phù hợp với ý muốn của các nhà công nghệ gen. Nội dung báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu tái cấu trúc plasmid mới mang gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ), gen gna (gen kháng côn trùng chích hút) và gen gusA; chuyển plasmid mới cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và dùng dòng vi khuẩn biến nạp trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và côn trùng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Vật liệu  Vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBluescript SK + -GNA mang cassette gen nguyên vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hoá protein GNA (gen gna) + Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb.  Chủng vi khuẩn E. coli chứa pCAMBIA 3301 mang gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ) và gusA (gen chỉ thị). Gen chỉ thị gusA: được phân lập từ vi khuẩn E. coli (Jefferson & ctv., 1987), mã hóa enzym -glucuronidase (không màu). Enzyme này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronide (không màu) để tạo thành Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 352 sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết. Glucuronide thường dùng gọi là X-gluc, công thức hóa học: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide. Gen bar kháng chất phosphinothricin (PPT) được phân lập từ vi khuẩn S. hygroscopicus. Gen này mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase (PAT), giúp biến đổi PPT từ dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết cây trồng sang dạng bị acetyl hóa không c òn gây độc cho cây. Vì vậy, ngoài tác dụng chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật, gen bar còn có vai trò kháng thuốc trừ cỏ Basta trong sản xuất nông nghiệp.  Chủng vi khuẩn E. coli DH5 được dùng trong biến nạp nhằm khuếch đại số lượng bản sao các plasmid.  Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid mới.  Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB) chứa kháng sinh được sử dụng trong nuôi cấy và biến nạp.  Enzym giới hạn SacI, KpnI và enzym nối DNA ligase T4. 2. Phương pháp a. Cấu trúc các plasmid mới Phương pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình của Sambrook và ctv. (1989). Các phản ứng nối kết được thực hiện ở nhiệt độ 14 0 C trong thời gian 3-4g. Biến nạp E. coli và Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp sốc nhiệt, 42 0 C trong 2 phút. Môi trường LB được bổ sung các kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biến nạp. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng các kháng sinh nh ư kanamycin (50mg/l) và streptomycin (25mg/l). Các hợp chất hóa sinh như IPTG (Isopropyl-D-thiogalactoside) 50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D galactopyranoside) 40mg/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp để hoạt hoá enzym -galactosidase, cho phép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng. Phương pháp tách DNA plasmid các khuẩn lạc để kiểm tra cloning theo phương pháp của bộ kit công ty Promega. b. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ và kháng côn trùng Sử dụng giống thuốc lá sợi vàng Kutsaga 326. Lá cây thuốc lá trong ống nghiệm được cắt kích thước khoảng 1x1cm được dùng làm nguyên liệu chuyển gen. Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá đ ược nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 1mg/l BA) trong hai ngày. Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch Cefotaxim e 500mg/l trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi trường tái sinh tạo chồi có 10mg/l PPT và 500mg/l Cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần / lần trên cùng loại môi trường. Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh được cấy truyền sang môi trường ra rễ có chứa 20 mg/l PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen  Khảo sát khả năng phát triển và ra rễ của cây chuyển gen và cây đối chứng in vitro trên môi trường MS có chứa chất chọn lọc nồng độ 20mg/l PPT. Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 353  Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá và chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37 0 C, mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ không chuyển màu.  Sự hiện diện của gen gna trong cây được kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt như sau: Mồi 1: 5’CGG ATC CAT GGC TAA GGC AAG TCT CCT C-3’ và mồi 2: 5’CGG TAC CTC ATT ACT TTG AAG TCA CAA G -3’. Kích thước đoạn DNA của gen gna khuếch đại của phản ứng PCR được mong đợi là 0,47 kb.  Sự hiện diện của gen bar được kiểm tra qua phân tích PCR với các cặp mồi như sau: Mồi 1: 5’ ATG AGC CCA GAA CGA CG 3’ v à mồi 2: 5’ TCA GAT CTC GGT GAC GG 3’. Gen bar ở cây chuyển gen qua phân tích PCR sẽ có đoạn DNA được khuếch đại là 0,5 kb.  Các cây chuyển gen và đối chứng được phun dung dịch Basta (PPT nồng độ 4g/l) có bổ sung chất bám dính Tween 80 để kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Cấu trúc plasmid mới Trong thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý cassette gen nguyên vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hoá protein GNA (gen gna) + Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thước khoảng gần 4 kb nằm trên plasmid Bluescript SK+ được cắt bởi hai enzym giới hạn Kpn I và Sac I. Cassette này sẽ được chèn vào vị trí Lac Z alpha (trong vùng T-DNA, cũng được cắt bởi Kpn I và Sac I) ở plasmid pCAMBIA 3301. Tiếp theo chạy điện di trên gel agarose 0,8% kết quả điện di sau khi cắt bởi 2 enzym cho thấy plasmid pBluescript SK+-GNA được cắt làm hai đoạn, đoạn khoảng gần 4 kb là nguyên cassette chứa gen gna còn plasmid pCAMBIA chỉ có 1 đoạn khoảng 12 kb. Tách và làm sạch đoạn cassette và plasmid backbone trước khi đưa vào nối kết (ligation). Phản ứng nối kết giữa gen gna và vector pCAMBIA bằng enzym ligase T4 ở 14 o C trong 3 giờ. Sau đó các sản phẩm trên được biến nạp vào E. coli DH5 khả biến trong môi trường LB có 50 mg/l kháng sinh kanamycin, nuôi 37 o C qua đêm. Kết quả cho thấy trên các đĩa đối chứng (biếp nạp không có plasmid), các tế b ào E. coli DH5 do không được bổ sung plasmid khi thực hiện biến nạp n ên không có khả năng kháng Kanamycin, do vậy chúng không sinh trưởng được trên môi trường LB có bổ sung kanamycin. Ngược lại, các thể được biến nạp mang plasmid mới phát triển đ ược trên môi trường chọn lọc này chứng tỏ chúng chính là các thể mong muốn. Bên cạnh đó, môi trường chọn lọc có bổ sung X-gal, dựa trên nguyên tắc sàng lọc, các khuẩn lạc trắng trên đĩa biến nạp sẽ được sơ chọn để nhân bản plasmid mới. Để xác định kết quả, chúng tôi lấy [...]... tạo sự biểu hiện gen khi cây ở điều kiện đặc Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 359 thù [1,5,9,10,13] trong đó có promote r SAG12 (tạo sự sinh tổng hợp cytokinin khi mô đi vào trạng thái lão hoá) [5,13] mà chúng tôi s ử dụng trong nghiên cứu này Theo xu hướng trên, ở nghiên cứu này, qua kết hợp công nghệ nuôi cấy mô v à công nghệ gen, chúng tôi nghiên cứu tái sinh cây in vitro và chuyển gen ipt vào cây... (Phosphinothricin) Many transgenic tobacco plants with aphid resistance gene gna, herbicide resistance gene bar, and reporter gene gusA were obtained via Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 carrying the plasmid pCAMBIA 3301-GNA PCR analyses and indigogenic GUS assay were pe rformed to confirm the presen ce and the expression of gna, bar and gusA genes 357 Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT Hình 1 Ảnh điện di... NGHIÊN CỨU HƯỚNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO vắc-xin VIÊN GAN B TỪ CÂY TRỒNG Nguyễn Hữu Hổ, Trương Thiện Trí, Lê Tấn Đức, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Hữu Tâm Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Thời gian gần đây, công nghệ sinh học đặc biệt l à công nghệ gen đã có những bước tiến vượt bậc, qua đó các nhà khoa học nhiều nước (Mỹ, Cuba, Đức, Hàn Quốc, Trung Quốc, Tây Ban Nha…) có thể sản xuất vắc... đã được công bố [4] Ngoài nghiên cứu sản xuất vắc-xin viêm gan siêu vi B, hiện nay các nhà khoa học còn đang nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh viêm gan C từ cây trồng [14] Các cây chuyển gen đang được trồng và theo dõi ở vườn ươm đến khi ra hoa, kết quả Chúng tôi sẽ thực hiện một số nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của gen HBsAg và gen gusA ở giai đoạn quả 371 Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT Kết... tính, gây đột biến , phương pháp công nghệ sinh học (chuyển nạp gen) đ ã và đang chứng tỏ là công cụ hỗ trợ rất đắc lực cho nghi ên cứu tạo giống và song hành với các phương pháp tạo giống truyền thống Đến nay đ ã có khá nhiều giống cây trồng biến đổi gen (gen nhân) được trồng trên diện rộng nhằm mục đích th ương mại Nghiên cứu tạo giống bằng công nghệ gen đã và đang được thực hiện đối với cây lan một... (hình 3, 4) 379 Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 5 1 2 3 4 Hình 1, 2: Thử GUS dương tính ở PLB và chồi 3, 4: PLB và chồi phát sáng xanh lục qua xử lý tia UV sóng dài 365 nm 5: Kết quả PCR dương tính gen gfp v ới băng DNA được khuếch đại 500 bp KẾT LUẬN Qua sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pCAMBIA 1303 mang gen gfp5, gen gusA và gen hph để chuyển gen vào PLB cây hoa phong... V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 15 Ramírez, N., et al., 2003 Expression and characterization of an anti -(hepatitis B surface antigen) glycosylated mouse antibody in transgenic tobacco ( Nicotiana tabacum) plants and its use in the immunopurification of its target antigen Biotechnol Appl Biochem 38: 223-230 16 Richter, L J., Y Thanavala, C J Arntzen, H S Mason, 2000 Production of hepatitis B surface antigen... nhiều thời gian và nguồn gen đích mong muốn dùng lai tạo không phong phú [12] Trên thế giới, đã có khá nhiều thông báo đề cập chuyển một số gen v ào cây hoa lan (vào nhân) như gen bar, gen gusA, gen nptII, gen hpt [11, 14, 16, 17, 18, 24, 25], gen mã hoá protein vỏ virus (papaya ringspot virus ) [12], trình tự ACC antisense [1]; cũng đã ghi nhận được công trình nghiên cứu chuyển gen phát sáng gfp [16],... sáng gfp [16], luc [5,6] Cây phong lan Dendrobium lai (hybrid) mang gen luc phát sáng sinh học (bioluminescent orchid) đã được rao bán đấu giá trên thị trường thế giới với giá khởi điểm 200.000 đô -la Singapore [4] [ở lĩnh vực chuyển gen v ào động vật, cá cảnh Zebra - Zebra fish Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 375 Brachydanio rerio mang gen gfp [1] phát sáng có điều kiện (chiếu tia UV) cũng đ ã được thương... of the Clinotech Diagnostics Inc The trans genics are being grown in the greenhouse for further studies 374 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG gfp VÀO CÂY HOA PHONG LAN Dendrobium cv Burana White NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Phong lan . PHẦN V CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 345 CẤU TRÚC vector plasmid MANG GEN KHÁNG SÂU VÀ ỨNG DỤNG TRONG TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium. armigera. Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 351 TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀ CÔN TRÙNG Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học. ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã và đang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có lợi vào thực vật để tạo ra những cây trồng có tính trạng