Hóa mô: kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng cách ngâm chồi con trong dung dịch X- Gluc.Ủ qua đêmở 370C.
PCR (Polymerase Chain Reaction): t ách chiết DNA nhiễm sắc thể từ mô lá theo
phương pháp của Dellaporta (1983) và sử dụng cặp mồi (primer) đặc hiệu cho gen
kháng kháng sinh kanamycin (nptII):
* Primer (f): 5’ ACA CGC TGA AAT CAC CAG TCT C 3’ * Primer (r): 3’ CTC GTC CTG CAG TTC ATT C 5’
* Chương trình nhiệt độ cho PCR:
* Khởi đầu: 940C / 5 phút - Tách sợiDNA : 940C / 1 phút - Gắn mồi: 550C / 1 phút - Tổng hợpDNA: 720C / 2 phút * Kết thúc: 720C / 7 phút 35 chu kỳ
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Các đĩa lá đối chứng (không xử lý với sóng siêu âm và vi khuẩn) trên môi trường
do bị ức chế mạnh bởi kháng sinh kanamycin ở nồng độ 20mg/l, nên sự phát sinh
hình thái chồi không diễn ra. Đa phần mô sẹo hình thành ngay vết cắt, hóa nâu và chết sau 45 ngày nuôi cấy.
Tác động của kháng sinh kanamycin ở nồng độ 20mg/l lên khả năng tái sinh chồi
của mẫu lá đã xử lý chuyển gen và mẫu xử lý sóng siêu âm trước khi chuyển gen
trên môi trường bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng TDZ, 2,4-D sau 45 ngày: Mẫu xử lý chuyển gen trên môi trường MSDT cho thấy sự tăng sinh mô sẹo rõ rệt trên
cuống lá, rìa lá xung quanh vết cắt đĩa lá, dần hóa nâu và chết. Chỉ thu nhận duy nhất 1
mẫu lá tái sinh chồi và phát triển được trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc.
Mẫu xử lý sóng siêu âm trước và chuyển gen sau đó trên môi trường MSDT, sự
phát sinh hình thái chồi xuất hiện ở vị trí cuống lá, rìa lá. Sơ khởi thu nhận 2 mẫu lá
tái sinh chồi trên môi trường chọn lọc sau 45 ngày.
Bảng 1: Tần số tái sinh chồi của thí nghiệm 1 v à 2 trên môi trường chọn lọc chứa kanamycin nồng độ 20 mg/l sau 45 ng ày
Môi trường nuôi cấy MSDT (có kanamycin 20 mg/l)
Số mẫu lá thí nghiệm
Số mẫu lá tái sinh chồi
Tỉ lệ tái sinh chồi (%)
Thí nghiệm 1 150 1 0,66
Thí nghiệm 2 150 2 1,33
Hình 1: Mẫu nuôi cấy trên môi trường MSDT+ kanamycin 20 mg/l sau 45 ng ày