Agrobacterium tumefaciens
Nguyễn Thị Phương Nam, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Hữu Tâm
Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển
Phòng Công nghệ genthực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Ngô (Zea mays L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới cũng như ở nước ta.
Ngoài việc dùng làm lương thực cho con người, ngô cònđược dùng làm thức ăn trong chăn nuôi gia súc, gia c ầm, làm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất r ượu, cồn, tinh
bột… Ngô là nguồn xuất khẩu thu ngoại tệ lớn đối với một số n ước như Mỹ, Pháp,
Argentina, Trung Quốc…
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen, các nhà khoa học thường dùng vật
liệu phôi non (10-20 ngày sau thụ tinh) [3,4,5,6,16,18,22] để nghiên cứu do có khả năng đáp ứng cao với nuôi cấy (tỷ lệ tạo mô sẹo sinh phôi và tái sinh cao). Tuy nhiên, thường
khó chủ động trong việc thu phôi non và cần nhiều thời gian, công sức cho công việc
tách lấy phôi. Để chủ động h ơn trong nghiên cứu, chúng tôi dùng đốt thân (nodal
section) và chồi đỉnh cây in vitro (có nguồn gốc từ hạt tươi trưởng thành) như nguyên liệu dùng cho nghiên cứu nuôi cấy mô và để tạo mô tế bào thích hợp dùng chuyển nạp.
Trước đây, chọn tạo giống ngô đ ược thực hiện thông qua ph ương pháp lai tạo, gây đột biến. Hiện nay, công nghệ sinh học đã có nhiều đóng góp quan trọng trong tạo giống
cụ thể là nhờ công nghệ gen nhiều giống ngô chuyển gen với đặc tính quý đãđược tạo ra và được thương mại hoá như giống ngô kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ… . Theo các
nhà nghiên cứu, công nghệ chuyển nạp gen ngày càng có vị trí quan trọng trong công
tác giống ngô đặc biệt trong tình trạng vốn gen tự nhiên cây ngô còn nhiều hạn chế.
Sự thiếu hụt dinh dưỡng sắt là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khoảng
30 % dân số thế giới. Sự thiếu máu do thiếu hụt sắt có ảnh hưởng xấu hoặc rất xấu đến
trẻ em,thai phụ và phụ nữ sau khi sinh. Ở nước ta, theo điều tra tại các vùng nghèo tỷ lệ
trẻ thiếu máu, thiếu sắt lên tới hơn 70%, chủ yếu do bữa ăn thiếu chất dinh d ưỡng và nghèo thành phần; sự thiếu sắt có tác động xấu đến sự phát triển về thể chất và trí tuệ
củatrẻ. Mặc dù việc bổ sung sắt vào thực phẩm hoặc khuyến cáo sử dụng thuốc đã tỏ ra
có hiệu quả nhằm kiểm soát nạn thiếu hụt sắt nh ưng các biện pháp nói trên khó có thể
áp dụng nhanh chóng tại các n ước còn nghèo nàn lạc hậu vì chi phí phát sinh cao và số lượng các chương trình chăm sóc sức khoẻ ban đầu còn hạn chế. Một số cây họ Đậu,
cây cải spinach… được biết chứa hàm lượng sắt cao nhưng cũng chứa nhiều acid oxalic
Ferritin - protein dự trữ sắt được phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và vi khuẩn. Ferritin của thực vật gồm 24 tiểu phần (subunit) có thể chứa từ 4.000 - 4.500 nguyên tử sắt ở khoang trung tâm phân tử (central cavity) [10,11]. Các đoạn cDNA
ferritin thực vật đãđược dòng hóađể nghiên cứu từ nhiều nguồn khác nhau nh ư trụ dưới
lá mầm đậu nành Glycine max [10], hạt non đậu Pisum sativum (pea), lá non đậuVigna unguiculata, hạt đậuPhaseolus vulgaris (French bean)… Ferritin có hai nhi ệm vụ chính
trong tế bào sống;một là, cung cấp sắt để tổng hợp các protein chứa sắt nh ư ferredoxin
và các cytochrome, hai là, chống các tác hại gây ra bởi các gốc tự do tạo ra bởi sự t ương
tác sắt / dioxygen. Các nghiên cứu gần đây cho thấy ferritin có thể đ ược sử dụng để xử
lý các trường hợp bệnh thiếu máu ở chuột. Các phát hiện trên cho phép các nhà khoa học đưa ra các nghiên cứu, bằng con đường công nghệ di truyền, tạo ra các cây ngũ cốc
chuyển gen giàu sắt nhằm góp phần nhất định vào việc giải quyết nạn thiếu hụt sắt ở
con người và cho đến nay, người ta đã tạo ra được một số dòng lúa indica và japonica với hàm lượng sắt cao hơn gấp nhiều lần [11].
Nhằm tiếp cận hướng tạo giống dùng phương pháp công ngh ệ sinh học, ở nghiên cứu này, chúng tôi nêu nội dung nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây từ mô đốt
thân và chồi đỉnh và bước đầu ứng dụng trong chuyển nạp gen tạo ferritin nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens với hy vọng cải thiện h àm lượng sắt ở cây ngô.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Giống ngô:
Sử dụng giống ngô Nếp địa ph ương ở tỉnh Tiền Giang.
Phương pháp:
Khử trùng hạt tươi
Bóc bỏ lá bao bên ngoài quả ngô tươi để lộ hạt ngô bên trong. Tách lấy hạt bằng tay
và khử trùng hạt bằng hypochlorite Na 50% (v/v) trong 20 phút. Rửa sạch bằng n ước cất
nhiều lần và cấy hạt trên môi trường MS không chất sinh tr ưởng.
Kỹ thuật tách nuôI chồi đỉnh
Dùng dao mổ cắt bỏ phần trên và dưới đốt thân cây ngô in vitro phát triển từ hạt
(sau khoảng 1/2 tháng nuôi cấy). Tách bỏ phần mô bao phía tr ên đốt thân để lộ đỉnh sinh trưởng. Cũng bằng dao mổ cắt lấy chồi đỉnh 0,4 x 0,4mm v à đặt vào môi trường
nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy mô
Môi trường cấy hạt sau khử trùng: MS (Murashige -Skoog, 1962) không chất sinh trưởng.
Môi trường nuôi cấy đốt thân cây in vitro:
1. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA
Môi trường nuôi cấy chồi đỉnh (kích th ước 0,4 mm) thân cây in vitro:
3. MS + 0 - 0,05mg/l BA
4. MS + 0,05mg/l NAA + 1 -2mg/l BA 5. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA
Môi trường tạo vườncây từ cụm chồi (môi trường số 6): MS + 0,1mg/l NAA + 1mg/l BA
Môi trường nuôi cây: MS không chất sinh tr ưởng.
Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy:
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pITB- FERRITIN (do TS. Nguyễn Hữu Tâm thiết kế) mang gen tạo protein giàu chất sắt
(ferritin) và gen kháng hygromycin hph.
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin và 25mg/l
streptomycin. Để nhân giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đêm trong môi trư ờng khoáng AB (Chilton và cs., 1974) cũng chứa các kháng sinh như trên. Nhiệt độ nuôi cấy: 25- 28oC.
Quy trình chuyển gen:
Các cụm mô đang trong quá trình tái sinh (kích thước 0,5 x 0,5mm) hình thành từ đốt thân hoặc/và chồi đỉnh trên môi trường có 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (môi trường
số 1) được dùng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen:
1. Nuôi các cụm mô trên môi trường số 1 trong thời gian 2 ngày.
2. Tạo vết thương bằng cách châm đầu l ưỡi dao mổ nhọn vào mô, lây nhiễm mô với
vi khuẩn trong thời gian 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng
giấy lọc.
3. Nuôi chung mô với vi khuẩn trong 2 ngày (sử dụng môi trường số 1 có bổ sung
acetosyringone 100 M).
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500mg/l (kết
hợp lắc nhẹ).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo n ước và cấy mô trên môi trường chọn lọc: môi trường số 1 có
nồng độ hygromycin 20mg/l hygromycin, 500mg/l cefotaxime. Thời gian chọn lọc
15 ngày.
6. Tiếp tục chọn lọc tế bào thêm 3 chu kỳ (15 ngày / chu kỳ) trên môi trường chọn lọc như trên nhưng có 30mg/l hygromycin.
7. Cấy truyền các mô sang môi trường số 6 cũng bổ sung 30mg/l hygromycin, thời
Kiểm tra cây chuyển gen:
1. Tách cây và cấy cây sang môi trường MS không chất sinh trưởng có 30mg/l hygromycin, thời gian theo dõi sự sinh trưởng khoảng 15 ngày.
2. PCR: Sự hiện diện của gen hph đang được kiểm tra dùng cặp mồi đặc hiệu: H1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, H2: TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 62C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Về nuôi cấy mô:
- Nuôi cấy đốt thân:
Trong nghiên cứu này, nói chung có sự hình thành hai loại hệ thống mô khác nhau: một là, mô sẹo có khả năng sinh phôi, hình thành trên cả hai môi trường số 1 và 2, với
tỷ lệ cao hơn trên môi trường số 2 (60%); hai là, mô sẹo mang phác thể chồi (đang trong
quá trình tái sinh) chỉ hình thành trên môi trường số 1 với tỷ lệ khoảng 52 %; và như
vậy trên môi trường số 1 có sự hình thành cả hai loại mô nói trên. Theo chúng tôi, có sự
hình thành hai loại mô nói trên trên môi trường số 1 là do môi trường nuôi cấy có một lượng auxin 2,4-D nhất định thúc đẩy sự tạo mô sẹo và có cytokinin BA tạo sự phân hoá
chồi. Thành phần môi trường số 2 có acid amin L - proline và tác nhân ức chế hình thành ethylen là nitrate bạc, theo một số tác giả, cần thiết cho sự hình thành mô sẹo có
khả năng sinh phôi đối với cây ngô với tần số cao.
- Nuôi cấy chồi đỉnh:
Trên môi trường có 0,05mg/l NAA và 0,1mg/l BA, tất cả các chồi đỉnh đều phát triển thành cây đơn. Khi giữ nguyên lượng NAA và có lượng BA tăng cao hơn (1mg/l), có sự
hình thành cụm chồi với tỷ lệ khoảng 35% t ương tự như hệ thống cụm chồi ở kết quả
nghiên cứu trước đây [3]. Trên môi trường có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA, khoảng trên 50% số chồi đỉnh nuôi cấy hình thành cả hai loại mô như trong trường hợp nuôi cấy đốt thân.
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô cây ngô, trên thế giới cũng như trong nước, có một
số vật liệu phổ biến dùng để tạo mô sẹo là phôi non [4,6,18], mô thuẫn (scutellum) hoặc đốt thân phôi trưởng thành [14,20]… Phôi non đư ợc sử dụng nhiều do khả năng đáp ứng cao đối với sự hình thành mô sẹo phôi hoá cũng như tái sinh. Tuy nhiên, vi ệc thu
phôi non phụ thuộc vào thời vụ, gây trở ngại cho nghiên cứu. Do vậy, trong nghiên cứu này, theo hướng của các tác giả Sidorov và cs., 2006 [20], chúng tôi sử dụng đốt thân
cây in vitro làm nguyên liệu tạo mô cần thiết. Việc dùng nguyên liệu này mang tính chủ động cao và nhận thấy mô cũng có đáp ứng khá tốt với nuôi cấy.
Về chuyển gen:
Qua sử dụng mô sẹo đang trong quá trình tái sinh để chuyển nạp gen bằng ph ương
pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi bước đầu nhận được 2 dòng mô có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường có 30mg/l hygromycin. Thực tế nghiên
cứu của chúng tôi cho thấy có vấn đề khó khăn trong việc sử dụng mô sẹo phôi hoá để
nghiên cứu chuyển gen dùng vi khuẩn là mô sẹo sau khi xử lý vi khuẩn, nuôi chung, rửa
và cấy chọn lọc thường trở nên nhão và chết với tỷ lệ rất lớn. Chúng tôi đang tiếp cận hướng sử dụng phương pháp bắn gen nhằm loại bỏ một số yếu tố có thể gây ảnh h ưởng
xấu trên mô như thao tác cơ học xử lý vi khuẩn, rửa, thấm khô mô… và cũng có thể sự khó khăn trên đây là do y ếu tố giống. Khả năng tạo mô sẹo phôi hoá với tần số thấp
cũng như duy trì nó trong thời gian dài mà không giảm khả năng tái sinh đã khiến một
số tác giả trên thế giới tiếp cận phương pháp dùng chồi đỉnh (intact tisue) để nghiên cứu
chuyển gen [12,13]. Điểm thuận lợi của chúng tôi khi sử dụng hệ thống mô sẹo đang
trong quá trình tái sinh là loại mô này không giảm khả năng tái sinh trong thời gian dài cấy truyền. Được biết đến nay, đã có nhiều phương pháp chuyển gen được áp dụng trên
đối tượng cây ngô như bắn gen [16,18,21,22], dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [12,13,15, 20], dùng xung đi ện [5,7,9,17,19] nhưng hiện nay chỉ hai
phương pháp bắn gen và dùng vi khuẩn là còn được áp dụng nhiều.
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu nuôi cấy đốt thân, chồi đỉnh và chuyển nạp gen trên giống ngô Nếp
Tiền Giang, chúng tôi có một số kết luận sau:
Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp tạo loại mô vừa mang khả năng tái sinh cao vừa có thể được dùng cho nghiên cứu chuyển nạp gen là môi trường MS có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA. Khả năng tái sinh cây đối với loại mô
này có thể được duy trì trong thời gian dài.
Chồi đỉnh qua nuôi cấy có thể phát triển theo hướng tạo dạng mô sẹo mang phác
thể chồi hoặc theo hướng tạo cụm chồi tuỳ theo loại chất điều ho à sinh trưởng và nồng độ được sử dụng.
Qua chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen hph và gen tạo
protein giàu sắt (ferritin), bước đầu chúng tôi đã chọn được 2 dòng mô ngô có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường có30mg/l hygromycin.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình Nghiên cứu cơ bản đã tài trợ cho
nghiên cứu này.
Hình 1: Mô sẹo có khả năng sinh phôi d ùng chuyển gen. 2: Cụm mô kháng hygromycin. 3: Thử GUS dương tính đối với mô chồi. 4: Kết quả PCR d ương tính gen hph với băng
DNA 800 bp. 5: K ết quả PCR dương tính gen tạo ferritin với băng DNA 700 bp
1 2 3
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Thị Dung, Trần Trung Hiếu, 2000. Bước đầu chuyển gen vào cây bắp (Zea mays L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens . Tập san KHKT Nông Lâm
nghiệp 2: 59-61, Trường ĐH. Nông Lâm T/p HCM.
2. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Tâm, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Một số
nghiên cứu chuyển gen vào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây ngô (Zea
mays L.). Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003, tr. 1096-1101. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Z. Y. Tkaschuc, L. V. Tkaschuc, 1995. Tạo
cụm chồi cây ngô (Zea mays L.) từ đỉnh sinh trưởng và phôi hạt nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 4: 6-9.
4. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Phạm Minh Thợi, Đỗ Năng Vịnh, 2003. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen cây ngô. Tuyển tập Báo
cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003, tr. 820-825. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
5. D’Halluin, K., E. Bonne, M. Bossut, M. De Beuckeleer, J. Leemans, 1992.
Transgenic maize plants by tissue electroporation. The Plant Cell 4: 1495-1505. 6. Danson, J. W., M. Lagat, M. Mbogori, 2006. Screening tropical maize lines for the
production and regeneration of friable and embryogenic type II callus. African Journal of Biotechnology 5(230): 2367-2370.
7. Fennell, A., R. Hauptmann, 1992. Electroporation and PEG delivery of DNA into maize microspores. Plant Cell Reports 11: 567-570.
8. Frame, B. R. et al., 2002. Agrobacterum tumefaciens -mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol. 129: 13-22. 9. Fromm, M. E., L. P. Taylor, V. Walbot, 1986. Stable transformation of maize after
gene transfer by electroporation. Nature 319: 791-793.
10. Goto, F., T. Yoshihara, H. Saiki, 1998. Iron accumulation in tobacco plants expressing soybean ferritin gene. Transgenic Research 7: 173-180.
11. Goto, F., T. Yoshihara, N. Shigemoto, S. Toki, F. Takaiwa, 1999. Iron fortification of rice seed by the soybean ferritin gene. Nature Biotechnology 17: 282-286. 12. Gould, J., M. Devey, O. Hasegawa, E. C. Ulian, G. Peterson, R. H. Smith, 1991.
Transformation of Zea mays L. using Agrobacterum tumefaciens and the shoot apex. Plant Physiol. 95: 426-434.
13. Grave, A. C. F., S. L. Goldman, 1986. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens . Plant Molecular Biology 7: 43-50.
14. Huang, X. Q., Z. M. Wei, 2004. High -frequency plant regeneration through callus
15. Ishida, Y., H. Saito, S. Ohta, Y. Hiei, T. Komari, T. Kumashiro, 1996. High
efficiency transformation of maize ( Zea mays L.) mediated by Agrobacterium
tumefaciens. Nature Biotechnology 14: 745-750.
16. Klein, T.M., T. Gradziel, M. E. Fromm, J. C. Sanford, 1988. Factor influencing gene delivery into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles. Bio/Technology 6: 559-563.
17. Laursen, C. M., R. A. Krzyzek, C. E. Flick, P. C. Anderson, T. M. Spencer, 1994.