Bùi Đình Thạch, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh,
Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Nguyễn Đức Minh Hùng
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Như chúng ta đã biết, gen ipt (phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium) là gen tạo ra
enzyme isopentenyl transferase và cũng là enzyme quan trọng của con đường sinh
tổng hợp cytokinin trong thực vật [4,5,7,20,22]. Đối với sự lão hoá ở thực vật,
cytokinin có vai trò điều hoà theo hướng tích cực là làm chậm quá trình này [6,7,9,10,13,16,20].
Nghiên cứu chuyển gen ipt vào thực vật đã được thực hiện thành công trên một
số đối tượng cây trồng như Arabidopsis, thu ốc lá, Petunia, bông cải, cải xà lách, cúc,...[6,7,9,10,12,13,15] và kết quả cho thấy cây chuyển gen có lá xanh t ươi hơn, ở
các lá già do diệp lục tố chậm bị phân huỷ nên lá chậm chuyển sang m àu vàng. Điều
này mở ra triển vọng khai thác tiềm năng của gen này trong nghiên cứu chuyển gen
tạo giống cây trồng chậm lão hoá, tăng sinh trưởng và năng suất [10,17]. Ngoài ra, gen ipt còn có khả năng làm tăng hàm lư ợng hợp chất thứ cấp ở cây d ược liệu
chuyển gen [19] và có thể được sử dụng như gen có khả năng thay thế cho gen chọn
lọc [8].
Trước đây, gen chuyển ipt tạo tình trạng dư thừa cytokinin (overproduction) dẫn đến sự thay đổi kiểu hình của cây [9] nhưng gần đây tình trạng này đãđược khắc phục
do sử dụng các promoter nh ưcor15a, SAG12... chỉ tạo biểu hiện trong những điều kiện
nhất định [12,13,15].
Ở cây bắp cải, trên đồng ruộng, các lá già gần gốc thường chuyển vàng sớm (mất
diệp lục tố do lão hoá) tạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập; ngoài ra, việc giữ sản
phẩm sao cho được xanh tươi lâu trong quá trình thu hoạch, vận chuyển và bảo quản là yêu cầu rất quan trọng đối với các nhà trồng trọt và kinh doanh cây trồng này.
Nội dung bài này, chúng tôi trình bày kết quả bước đầu việc nghiên cứu chuyển gen
ipt vào cây bắp cải nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm khả năng làm giảm
cácảnh hưởng không tốt do hiện t ượng lão hoá gây ra như đã nóiở trên và đây là công
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Giống bắp cải:
Sử dụng giống F1 TN5 (củaCông ty hạt giống Trang Nông).
Phương pháp: Khử trùng hạt
Trước hết, hạt được rửa với nước cất vô trùng 2 lần, khử trùng bằng nước Javel
nồng độ 50% (v/v) trong 7 phút. Sau đó, hạt đ ược rửa sạch bằng nước vô trùng 3 lần và
được gieo trên môi trường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin
1. Môi trường gieo hạt và nuôi cây: khoáng MS (Murashige - Skoog, 1962), vitamin Morel (Morel, 1948), không có chất điều hoà sinh trưởng.
2. Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm: khoáng MS, vitamin B 5 (Gamborg và cs., 1968) có 0,1mg/l IBA , 3 mg/l BA.
3. Môi trường vươn chồi và tạo rễ: như môi trường số 1.
4. Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1
nhưng có hygromycin t ừ 5- 10mg/l.
5. Các loại môi trường trên có đường 30g/l, thạch 9g/l, pH 5,8. 6. Điều kiện nuôi cấy: 12 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 23- 25oC.
Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy
Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pVDH396 (kích thước 15,9 kb) (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) mang gen ipt (có nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ) tạo enzyme isopentenyl transferase
[có promoter SAG12 (senescence associated gene 12, từ Arabidopsis thaliana), gen gusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen kháng hygromycin hph (promoter CaMV35S).
Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin. Để nhân
giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đêm trong môi
trường khoáng AB (Chilton và cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin nh ư trên. Nhiệt độ nuôi cấy: 25 - 28oC.
Quy trình chuyển gen
Các lá mầm, từ cây mầm 7 - 10 ngày tuổi trên môi trường MS không chất điều hoà
sinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
Tóm tắt quy trình chuyển gen
1. Nuôi cấy lá mầm trên môi trường số 2 (0,1mg/l IBA, 3mg/l BA) trong thời gian
2. Gây nhiễm các lá mầm với dịch vi khuẩn (OD= 0,6-1) trong thời gian 15 phút. Vớt
mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.
3. Nuôi chung lá mầm với vi khuẩn trong 2 ngày. Sử dụng môi trường như trên nhưng
có acetosyringone 50M.
4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500mg/l (kết
hợp lắc nhẹ, 15 phút).
5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường số 2 bổ sung 5-10 mg/l hygromycin, 250mg/l cefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày/ chu kỳ chọn lọc và thực
hiện 3 chukỳ chọn lọc dùng tuần tự 5-10-5mg/l hygromycin.
6. Cấy truyền các chồi/ cụm chồi tái sinh (cao từ 1-1,5cm) sang môi trường MS không chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời gian nuôi
khoảng 1 tháng.
Kiểm tra cây chuyển gen
1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền sang môi trường MS không chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi sự vươn chồi và ra rễ trong thời (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gian khoảng 20 ngày.
2. Mảnh lá cây giả định chuyển gen đ ược nuôi cấy trên môi trường số 2 có 5mg/l hygromycin và theo dõi khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh sau khoảng 20-30 ngày (so với đối chứng).
3. Nhuộm GUS (Jefferson và cs., 1987) [11]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đêmở
37°C (tủ ấm).
4. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặp
mồi đặc hiệu.
Gen hph: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:
TACTTCTACACAGCCATC; chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 62C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương trình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C: 30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp.
Gen ipt: IPT1: TCAACCGGAAGCGGACGACC, IPT2: GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương trình nhiệt: 90C: 10 phút; 40 chu kỳ (94C: 15 giây, 45C: 45 giây, 72C: 50 giây); 72C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Do không có giống bắp cải thuần được bán trên thị trường nên chúng tôi sử dụng
giống lai F1 TN5 để nghiên cứu. Do vậy, việc nhân giống cây chuyển gen dùng cho các nghiên cứu tiếp theo sẽ được thực hiện bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro /
ex vitro. Sau 7-10 ngày nuôi cấy hạt trên môi trường gieo hạt, các lá mầm đ ược sử dụng
làm vậtliệu chuyển gen.
Qua tham khảo một số tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây bắp cải trong và ngoài
nước, chúng tôi đã bố trí một số công thức môi tr ường với nồng độ chất điều hoà sinh
trưởng (ĐHST) IBA, BA khác nhau. Kết quả cho thấy, đối với giống F1 TN5, tổ hợp ĐHST IBA (0,1mg/l + BA 3mg/l) được xem là tổ hợp cho tỷ lệ tái sinh chồi rất cao ( 60%). Theo một số nghiên cứu trong và ngoài nước [1,3,18,21], nồng độ BA cao (2-4mg/l) được
xem là thích hợp, tạo sự tái sinh với tần số cao; nồng độ 3mg/l BA trong nghiên cứu của
chúng tôi phù hợp với khoảng dao động nồng độ BA sử dụng của các tác giả nêu trên. Qua thử nghiệm tính chống chịu tự nhiên của mô đối với kháng sinh hygromycin,
kết quả cho thấy mô sẹo cũng nh ư chồi/ cây con rất mẫn cảm đối với kháng sinh này (nồng độ dùng chọn lọc chỉ từ 5-10mg/l) tương tự như trường hợp cây bông cải [2]; ngược lại, đối với giống bắp cải B. oleracea cv. Alboglabra [3] và đ ối giống cải Brassica rapa [13] thì nồng độ hygromycin sử d ụng cao hơn, theo thứ tự là 30mg/l và 25mg/l.
Lá mầm, sau khi xử lý và nuôi chung với vi khuẩn, được cấy trên môi trường tái
sinh có bổ sung 5mg/l hygromycin. Nhận thấy sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy, một số lá
mầm có phần gốc cuống phình to và khoảng một tháng sau có sự tái sinh chồi (hình 1);
ngược lại, toàn bộ lá mầm đối chứng đều chết.
Các chồi/ cụm chồi tái sinh trên môi trư ờng có 5mg/l hygromycin được cấy truyền
tiếp sang môi trường có nồng độ hygromycin cao h ơn (10mg/l) để sự chọn lọc được triệt để hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy có một số chồi chết ở giai đoạn chọn lọc tiếp theo
này. Các chồi/ cụm chồi tuy tái sinh tr ên môi trường có hygromycin nh ưng khả năng
phát triển của chúng không nhanh tr ên môi trường có 10mg/l hygromycin. Do vậy, ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chu kỳ chọn lọc thứ ba, chúng tôi chỉ dùng nồng độ hygromycin 5mg/l (như đối với chu
kỳ 1) để tiếp tục kiểm tra tính kháng của chồi/cây. Đến nay, chúng tôi đã nhận được một
số dòng chồi/ cây có khả năng sinh tr ưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l hygromycin (dòng cây giả định chuyển gen).
Như đã nóiở trên, do tính mẫn cảm cao đối với hygromycin nên sau khi qua 3 chu kỳ chọn lọc, chúng tôi cấy truyền chồi/cây sang môi tr ường nuôi cây không có hygromycin để chồi/cây phát triển nhanh.
Các dòng giả định chuyển gen được kiểm tra một lần nữa qua sử dụng các mảnh lá để cấy trên môi trường tái sinh có 5mg/l hygromycin nhằm theo dõi khả năng tạo mô
sẹo và tái sinh. Kết quả cho thấy, các mảnh lá cây giả định chuyển gen có khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh chồi; ngược lại, mảnh lá cây đối chứng hoàn toàn không có khả năng tạo mô mới và chết sau đó.
Mô lá của các chồi có khả năng phát triển liên tục trên môi trường có hygromycin được nhuộm với thuốc thử X-Gluc để kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA. Kết quả cho
thấy chúng có màu xanh đặc trưng với thuốc thử (hình 2); ngược lại, các mẫu lá cây đối
chứng đều âm tính ở kết quả thử GUS này. Cũng ghi nhận một số mô lá âm tính với
tôi có thể đây là do hiện tượng im lặng của gen gusA thường gặp trong nghiên cứu
chuyển nạp gen này.
Chúng tôi đang tiến hành phân tích PCR nhằm kiểm tra sự hiện diện của các gen
hph, gusA, ipt với các mồi đặc hiệu nh ư đã ghi trong phần nguyên liệu và phương pháp.
LỜI CÁM ƠN
Các tác giả xin chân thành cám ơn Trung tâm Phát tri ển Khoa học - Công nghệ Trẻ Thành Đoàn Thành ph ố Hồ Chí Minh (Chương trình Vườn ươm sáng tạo) đã tài trợ cho
nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Liên Chi, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh, Lao Thị Nga, Nguyễn
Quốc Bình, Nguyễn Văn Uyển, 1994. Chọn lọc các môi tr ường nuôi cấy để nâng
cao hiệu suất tái sinh cây bắp cải Brassica oleracea var. capitata dùng cho hệ thống
chuyển gen của Bacillus thuringiensis kháng sâu tơ. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 22(1): 1-7.
2. Kim Hong, N. T., E. J. Kane, P. J. Dix, 1998. Hormonal regulation of senescence in
cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) (Abstract). In: Altman A., Ziv M.,
Izhar S. (eds), Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century, IX International Congress on Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, p. 164.
3. Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển, Maria Dolores Sacristan, 1997. Tạo hai
dòng cải Brassica oleracea L. cv. Alboglabra mang gen kháng hygromycin bởi
Agrobacterium tumefaciens. Tạp chíSinh học 19(4): 13-16.
Hình 1: Chồi chuyển gen tái sinh tr ên môi trường chọn lọc có 5 mg/l
hygromycin
Hình 2: Mẫu lá/ chồi cây chuyển gen dương tính với thuốc thử GUS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. Akiyoshi, D. E., H. Klee, R. M. Amasino, E. W. Nester, M. P. Gordon, 1984. T -DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5994-5998.
5. Barry, G. F., S. G. Rogers, R. T. Fraley RT, L. Brand, 1984. Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4776-4780.
6. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. Overproduction of cytokinins in Petunia flowers transformed with PSAG12-IPT delays corolla senescence and decreases sensitivity to ethylene. Plant Physiology 132: 2174-2183. 7. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. The Arabidopsis
AtIPT8/PGA22 gene encodes an isopentenyl transferase that is involved in de novo cytokinin biosynthesis. Plant Physiol. 131(1): 167-176.
8. Ebinuma H., K. Sugita, E. Matsunaga, M. Yamakado, 1997. Selection of marker - free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2117-2121.
9. Eklof, S., C. Astot, F. Sitbon, T. Moritz, O. Olsson, G. Sandberg, 2000. Transgenic tobacco plants co-expressing Agrobacterium iaa and ipt genes have wild-type hormone levels but display both auxin -and cytokinin-overproducing phenotypes. The Plant Journal 23(2): 279-284.
10. He, S. S., A. Hoelscher, J. Liu, D. O’Neill, J. Layton, R. McCarroll, S. Dotson,
2005. Cell cycle specific isopentenyl transferase expression led to coordinated enhancement of cell division, cell growth and development in transgenic Arabidopsis. Plant Biotechnology 22: 261-270.
11. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907. 12. Khodakovskaya, M. V., R. McAvoy, H. Liu, Y. Li, 1998. Ethylene -regulated
expression of the ipt gene increases flower number in transgenic Dendranthema grandiflorum. Abstracts, Society for In Vitro Biology.
13. Khodakovskaya, M. V., Y. Li, J. Li, R. Vankova, J. Malbeck, R. McAvo y, 2005. Effects of cor15a-ipt gene expression on leaf senescence in transgenic Petunia
hybrida and Dendranthema grandiflorum. J. of Experimental Botany 56(414):
1165-1175.
14. Kuvshinov, V., K. Koivu, K. E. Pehu, 1999. Agrobacterium tumefaciens -mediated transfrmation of greenhouse-grown Brassica rapa ssp. Olifera. Plant Cell Reports 18(9): 773-777.
15. McCabe, M. S. et al., 2001. Effects of PSAG12-ipt gene expression on development and senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol. 127: 505-516.
16. McCabe, M. S., U. Mohapatra, F. Schepers, K. Van Dun, J. B. Power, M. Davey, 1998. Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene. J. Exp. Bot. Suppl. 49: 49.
17. Medford, J. I., R. Horgan, Z. El -Sa-wi, H. J. Klee, 1989. Alterations of endogenous cytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl transferase gene. The Plant Cell 1: 403-413.
18. Metz, T. D., R. Dixit, E. D. Earle, 1995. Agrobacterium tumefaciens -mediated
transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (B. oleracea
var. capitata). Plant Cell Reports 15: 287-292.
19. Sa, G., M. Mi, Y. He-chun, L. Guo-feng, C. Kang, 2001. Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L.. Plant Science 160: 691-698.
20. Smart, C. M., Scofield S. R., M. W. Bevan, T. A. Dyer, 1991. Delayed leaf senescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene for cytokinin production in Agrobacterium. Plant Cell 3: 647-656.
21. Tsukazaki, H., Y. Kuginuki, R. Aida, T. Suzuki, 2002 . Agrobacterium -mediated
transformation of a double haploid line of cabbage. Plant Cell Reports 21: 257-262.
22. Werner, T., V. Motyka, M. Strnad, T. Schmulling, 2001. Regulation of plant growth by cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10487-10492.
SUMMARY