(Manihot esculenta Crantz)
Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ
Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Trong 10 năm trở lại đây, việc trồng khoai mì ở Việt Nam phát triển mạnh. Năm
1995, trên cả nước, diện tích trồng khoai mì là 277,4 nghìn ha, sản lượng đạt 2211,5
nghìn tấn; đến năm 2004, diện tích trồng tăng đến 383,6 nghìn ha, sản lượng đạt 5572,8
nghìn tấn (Theo tài liệu Tổng cục Thống kê).
Ngoài vai trò là cây lương thực quan trọng, khoai mì ngày nay còn là nguyên liệu
trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Tinh bột khoai mìđược sử dụng để sản xuất
các sản phẩm công nghệ sinh học đang đ ược quan tâm. Do đó, đầu t ư và quản lý các
giống khoai mì có chất lượng tốt và ổn định cho từng mục ti êu đặt ra là rất cần thiết.
Khoai mì ra hoa không đều, sinh sản tự nhiên thấp, mức dị hợp tử cao, giao phối cùng giống cao nên việc ứng dụng các phương pháp cổ điển trong công tác giống khó khăn.
Công nghệ sinh học đã đưa ra những công cụ tiên tiến, bổ sung cho các ph ương pháp
chọn giống cổ điển, nhằm bảo tồn, phục tráng giống tốt trong tự nhiên, tạo ra các tính
trạng ưu việt mới như tính kháng bệnh, sâu, tăng hàm lượng protein trong củ, giảm hàm
lượng cyanogenic glucoside, tăng thời gian tồn trữ. Xây dựng đ ược hệ thống nuôi cấy
mô hiệu quả sẽ là nền tảng cho nhiều nghiên cứu ứng dụng thực tiễn quan trọng, trong
lĩnh vực công nghệ sinh học ở cây khoai mì.
Nghiên cứu sự tạo phôi vô tính, phát triển thành cây in vitro, và kiện toàn các bước đưa cây ra trồng trong vườn ươm đãđược thực hiện tại phòng Công nghệ gen Viện Sinh
học Nhiệt đới. Giống khoai mì KM 140, do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền
Nam cung cấp, đãđược sử dụng trong nghiên cứu này.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
- Đối tượng thực vật:
Giống khoai mì KM 140. Đây là giống nhập nội đã thích nghi với điều kiện môi trường Việt Nam, có hàm lượng tinh bột ở củ cao 27-28%, thời gian canh tác ngắn,
khoảng 6 tháng.
- Môi trường nuôi cấy:
+ Môi trường cơ bản (KM): Khoáng đa lượng, vi lượng MS; vitamin B5, có bổ sung
thành phần CuSO40,5mg/l, casein thủy phân 50mg/l: đường 30g/l, agar 9g/l, pH 5,8.
trưởng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), p - fluorophenoxyacetic acid (4 -FA), Gibberellic acid (GA3).
Phương pháp
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA lên sự tạo mô sẹo của lá
Cắt các thùy lá chân vịt non có chiều dài từ 2 - 6mm của cây mới vô mẫu hoặc từ
cây in vitro sau khi cấy truyền khoảng 10 ngày (hình 1a) và nuôi cấy tạo mô sẹo. Môi trường sử dụng là môi trường cơ bản có bổ sung 2,4-Dở các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10, 12 mg/l
hoặc 4-FA ở các nồng độ 2, 4, 6, 8.
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA đến khả năng sinh phôi c ủa mô sẹo
Các mẫu tạo mô sẹo được nuôi cấy tiếp trên cùng môi trường và tiếp tục theo dõi thời gian hình thành phôi, số lượng phôi so với mẫu ban đầu, các giai đoạn phát triển điển hình của phôi.
Giải phẫu và nhuộm mẫu Nhằm quan sát các giai đoạn phát triển của mẫu từ mô sẹo thành phôi theo phương pháp c ủa Nguyễn Tiến Bân và cs. (1979).
Khảo sát ảnh huởng của GA3 đến sự phát triển từ phôi thành cây
Phôi phát triển đến giai đoạn cuối cùng sẽ được tách ra và cấy trên môi trường cơ bản có
bổ sung thành phần GA3 ở các nồng độ khác nhau 0,1; 0,2; 0,3mg/l và đối chứng để theo
dõiảnh hưởng của GA3 đối với thời gian phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Chuyển câyin vitro ra trồng trong nhà lưới
Cây in vitro phát triển hoàn chỉnh từ phôi có chiều cao từ 5 - 7cm được đưa ra trồng trong nhà lưới. Trong tuần đầu cây được đặt trong khung có ny lông bao kín và đư ợc tưới phun sương 3 lần/ ngày để tránh sự thoát hơi nước của cây. Đến tuần thứ hai, cây được mang ra khỏi khung ny lông, t ưới phun sương 3 lần/ ngày.
KẾT QUẢ
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA lên sự tạo mô sẹo của mẫu lá
Các thùy lá được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có 2,4-D đến ngày thứ 5, 6 thì mô sẹo bắt đầu hình thành ở vùng cuống và mép thùy lá. Khoảng 28 ngày mô sẹo
phát triển đầy mặt lá,các khối mô sẹo mềm, dạng th ùy, trơn láng và có màu nâu nh ạt.
Bảng 1: Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 2 v à thứ 5
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Nghiệm thức Ký hiệu môi trường (MT) Nồng độ 2,4-D (mg/l) Tuần thứ 2 Tuần thứ 5 1 ĐC 0 0 G 0 G 2 D2 2 11,11 ± 1,92 F 55,56 ± 1,93 F 3 D4 4 38,89 ± 1,92 D 70,00 ± 3,33 D 4 D6 6 76,67 ± 3,34 A 95,56 ± 1,93 A 5 D8 8 58,89 ± 1,92 B 84,44 ± 1,93 B 6 D10 10 48,89 ± 1,92 C 78,89 ± 1,92 C 7 D12 12 27,78 ± 1,92 E 64,44 ± 1,93 E **CV (%) = 5,49 **CV (%) = 3,21
Ở nghiệm thức 4, bảng 1, tr ên môi trường có 2,4-D nồng độ 6mg/l, mẫu hình thành mô sẹo đạt tỷ lệ cao nhất 95,56%. Ở môi trường đối chứng (2,4-D nồng độ 0mg/l), mẫu lá gia tăng kích thước nhưng không có dấu hiệu tạo mô sẹo. Ở tuần thứ 2, có sự hình thành rễ từ cuống và bìa một số mẫu lá.
Trên môi trường bổ sung 4-FA, sự hình thành mô sẹo chậm hơn. Hình thái mô sẹo
phát triển cũng tương tự như trên môi trường 2,4-D, tuy nhiên có sự hình thành các cụm
mô nhỏ xốp trắng đục.
Bảng 2: Ảnh hưởng của 4-FA lên sự tạo mô sẹo sau tuần nuôi cấy thứ 3 v à thứ 6
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Nghiệm thức Ký hiệu MT Nồng độ 4FA (mg/l) Tuần thứ 3 Tuần thứ 6 1 ĐC 0 0 E 0 E 2 F2 2 21,11 ± 1,92 C 56,67 ± 3,34 C 3 F4 4 56,67 ± 3,34 A 85,56 ± 1,93 A 4 F6 6 42,22 ± 1,92 B 70,00 ± 3,33 B 5 F8 8 15,56 ± 1,93 D 47,78 ± 1,92 D **CV (%) = 7,78 **CV (%) = 4,68
Nghiệm thức 3, bảng 2, môi tr ường có 4-FA nồng độ 4mg/l cho kết quả tốt nhất với
56,67% mẫu tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3 và 85,56% ở tuần nuôi cấy thứ 6 (tỷ lệ
thấp hơn so với nghiệm thức tạo mô sẹo cao nhất tr ên môi trường có 2,4-D).
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA đến khả năng sinh phôi của mẫu mô sẹo Bảng 3: Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng sinh phôi
Nghiệm thức Ký hiệu MT
Nồng độ 2,4D (mg/l)
Tỷ lệ mẫu
sinh phôi (%) Tổng số phôi
1 ĐC 0 0 0 G 2 D2 2 16,67 25,00 ± 1,00 E 3 D4 4 26,67 39,33 ± 1,53 D 4 D6 6 58,89 76,00 ± 2,00 A 5 D8 8 36,67 60,33 ± 1,53 B 6 D10 10 20,00 47,00 ± 1,00 C 7 D12 12 7,78 11,67 ± 1,53 F **CV = 3,68% Trên môi trường có 2,4-D, sau 40 ngày nuôi cấy, phôi bắt đầu hình thành trên khối
mô sẹo. Phôi tạo thành từng cụm gồm trung bình 4,5 phôi nằm cạnh nhau. Theo dõiđến
ngày 70 thì số lượng phôi hình thành không tăng.
Kết quả ở bảng 3 cho thấy nghiệm thức 4, môi trường cơ bản có bổ sung 2,4-Dở
nồng độ 6 mg/l, cho cóảnh hưởng tốt nhất đến sự phát sinh phôi, đạt 58,89% mẫu cấy
sinh phôi và tổng số phôi thu nhận đ ược là 76 phôi.
khối mô sẹo, chậm hơn so với trên môi trường có 2,4-D. Đến ngày thứ 75, số phôi tạo thành không tăng thêm. K ết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của 4-FA đến khả năng sinh phôi
Nghiệm thức Ký hiệu MT Nồng độ 4FA (mg/l) Tỷ lệ mẫu sinh phôi (%) Tổng số phôi 1 ĐC 0 0 0 E 2 F2 2 34,44 46,00 ± 2,00 B 3 F4 4 57,78 101,67 ± 3,51 A 4 F6 6 20,00 29,67 ± 1,53 C 5 F8 8 8,89 16,67 ± 0,58 D **CV = 5,02%
Kết quả ở bảng 4 cho thấy nghiệm thức 3 (môi tr ường có bổ sung 4-FA ở nồng độ 4 mg/l) đạt được giá trị cao nhất ở các chỉ tiêu theo dõi là 57,78% mẫu cấy sinh phôi
và có tổng số phôi thu nhận đ ược là 101,67 phôi.
Số phôi cao nhất nhận được từ môi trường có bổ sung 2,4-D (6mg/l) thấp hơn ở môi trường có bổ sung 4-FA (4mg/l), nhưng thời gian hình thành phôi nhanh hơn. Quá trình hình thành phôi trên môi trường có 2,4-D và 4-FA được ghi nhận qua các giai đoạn là thuần
thục và điển hình từ dạng cầu, tim thủy lôi và dạng có cực chồi và rễ (hình 1b-f).
Giải phẫu và nhuộm mẫu
Phẫu thức các giai đoạn phát triển của phôi đ ược nhuộm và quan sát rõ ràng dưới
kính hiển vi vật kính (x10) (Hình 2).
Khảo sát ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của phôi
Phôi trưởng thành, thu nhận từ môi trường có bổ sung 2,4-D và 4-FA được cấy
truyền sang môi trường có bổ sung GA3. Sau 15 ngày, thân mầm vươn cao và rễ hình thành. Từ 22- 25 ngày, hai lá mầm của cây tách ra, chồi ngọn xuất hiện với các lá hoàn chỉnh và phát triển thành cây bình thường. Một số phôi dị dạng không phát triển thành cây hoàn chỉnh, hoặc chết đi trong quá trình nuôi cấy.
Bảng 5: Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của phôi thu nhận từ môi tr ường có bổ sung 2,4-D và 4-FA Tỷ lệ phôi có lá và rễ mầm (%) Tỷ lệ phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh (%) Tỷ lệ phôi có lá và rễ mầm (%) Tỷ lệ phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh (%) Nghiệm thức Ký hiệu MT Nồng độ GA3 (mg/l)
từ MT có bổ sung 2,4-D từ MT có bổ sung 4-FA
NT1 ĐC 0 54,44 3,33 ± 3,33 D 51,11 2,22 ± 1,92 D
NT2 G1 0,1 71,11 15,56 ± 1,93 C 70,00 17,78 ± 1,92 C
NT3 G2 0,2 85,56 36,67 ± 3,34 B 83,33 35,55 ± 3,85 B
NT4 G3 0,3 92,22 63,33 ± 3,34 A 91,11 62,22 ± 3,85 A
**CV = 10,24% **CV = 10,34%
chỉnh cao nhất ở cả hai tr ường hợp phôi thu nhận từ môi tr ường bổ sung 2,4-D và môi
trường bổ sung 4-FA. Ở nghiệm thức 1, đối chứng, tỷ lệ phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh rất thấp.
Chuyển câyin vitro ra trồng trong nhà lưới
Cây con in vitro cao khoảng 5-7cm được chuyển ra trồng trong bầu đất ngo ài vườn ươm. Sau một tuần cây bén rễ và ra lá non mới, tỉ lệ cây sống và phát triển bình thường
là 94 %. Chuyển cây sang chậu đất sau m ột tháng cây cao khoảng 50 - 60cm. (Các giá
trị trung bình trong các bảng không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p = 0,01 dựa theo trắc nghiệm LSD)
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Trên môi trường có bổ sung 2,4-D mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy. Môi tr ường
có nồng độ 2,4-D 6mg/l cho tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo cao nhất là 95,56% sau 5 tuần. Phôi bắt đầu hình thànhở tuần thứ 6. Cũng trên môi trường này tỉ lệ phôi hình thành cao nhất 58,89% với 76 phôi.
Đối với môi trường có bổ sung 4-FA, thời gian các mẫu cảm ứng tạo mô sẹo lâu hơn và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp h ơn so với 2,4-D. Mẫu bắt đầu hình thành mô sẹo
sau 3 tuần và đạt tỷ lệ tối đa sau 6 tuần nuôi cấy. Ở nồng độ 4mg/l 4-FA mẫu tạo
mô sẹo cao nhất là 85,56%. Môi trường này cũng cho tỷ lệ tạo phôi cao nhất là 57,78%, với 101,67 phôi.
GA3 cóảnh hưởng rõ rệt đến việc phát triển phôi thành cây hoàn chỉnh. Ở các nồng độ thí nghiệm, môi trường bổ sung GA3 0,3mg/l là môi trường thích hợp nhất để
kích thích phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Tỷ lệ đạt được khoảng 63%. Tỷ lệ sống của cây con khi chuyển từ trong bình ra vườn ươm cây là 94%.
Có thể ứng dụng quy trình tạo phôi khoai mì cho các nghiên cứu chuyển gen để tạo
giống mới.
Hình 1: Tạo phôi vô tính. a: cây khoai mìin vitro