MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HƯỚNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Giống thuốc lá, cà chua: Sử dụng giống thuốc lá sợi vàng K.326 và cà chua bi quả
dài (mua ngoài chợ). Hạt được khử trùng bằng nước Javel 50 % (v/v) trong 5 phút, rửa
sạch bằng nước cất và được cấy trên môi trường không chất sinh tr ưởng. Các mảnh lá
cây in vitro với kích thước khoảng 0,7 x 0,7cm (đối với thuốc lá) và lá mầm của cây
mầm 7-10 ngày tuổi (đối với cà chua) được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen.
Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy: Sử dụng môi tr ường cơ bản MS
(Murashige và Skoog, 1962) [13].
Gieo hạt sau khử trùng và nuôi cây giai đo ạn tạo rễ: MS không chất sinh tr ưởng.
1/ Tái sinh chồi, cây từ mảnh lá: MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA (đối với thuốc
lá), MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA (đối với cà chua).
Điều kiện nuôi: Nhiệt độ 26-28°C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux.
Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
2/ LBA 4404 chứa plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) (do TS. Nguyễn Hữu Tâm
thiết kế) mang gen HBsAg (promoter T7, terminator T7; 0,7 kb), gen gusA (promoter T7, terminator T7) và gen nptII kháng kanamycin (promoter CaMV35S). Gen HBsAg mã hoá protein nhỏ S và gen gusA được điều khiển bởi hệ thống [promoter PDS
(phytoene desaturase, 2 kb) + T7-polymerase (2,7 kb)] tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở
quả. Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có 50mg/l kanamycin trước khi gây
nhiễm mô.
Quy trình chuyển gen:
Cấy các mảnh lá (đối với thuốc lá) và lá mầm (đối với cà chua) trên môi trường 2;
Gây nhiễm mô với vi khuẩn trong 10 phút và nuôi chung mô và vi khuẩn trong 2 ngày trên môi trường 2; để ngoài sáng (trường hợp cà chua thì môi trường có bổ
sung acetosyringone 100 M).
Rửa vi khuẩn bám vào mô bằng nước cất+ 500mg/l cefotaxime, thấm khô nhẹmô.
Cấy mô lá / lá mầm trên cùng môi trường 2 có 500mg/l cefotaxime và tác nhân chọn lọc kanamycin 100 mg/l (đối với thuốc lá) hoặc tăng dần từ 20-50mg/l (đối với cà chua); để ngoài sáng.
Cấy truyền mô hình thành trên môi trường có kanamycin sang môi tr ường chọn lọc như trên (thực hiện 3-4 chu kỳ, 15 ngày / chu kỳ) đến khi hình thành chồi và cây con.
Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển:
Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá, chồi trong thuốc thử GUS ở
37°C (tủ ấm) trong 24 giờ.
Đối với cà chua, mảnh lá của cây giả định chuyển gen đ ược cấy trên môi trường số
2 có 50mg/l kanamycin để theo dõi khả năng tạo mô sẹo và tái sinh.
PCR: Sự hiện diện của gen nptII, gen gusA v à gen HBsAg được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu.
Gen nptII: K1: A CACGCTGAAATCACCAGTCTC, K2: CTCGTCCTGCAGTTCATTC; khuếch đại đoạn 600 bp; chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 55C: 1 phút, 72C: 2 phút); 72C: 7 phút.
Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:
CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương trình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C: 30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .
Gen HBsAg: Sử dụng cặp mồi: HBV1: CTACACTCGTGGTGGACTTCTC,
HBV2: AACGCCGCAGACACATCC; khuếch đại đoạn DNA 680 bp; ch ương trình nhiệt:94C:10 phút; 40 chu kỳ (94C: 50 giây, 45C: 45 giây, 72C: 50 giây); 72C: 7 phút; hoặc cặp mồi HBsAg1: ATGGAGAACACAACATC, HBsAg2:
GGATCCTTTTGCGGAAGCCCA; khuếch đại đoạn DNA 480 bp; ch ương trình nhiệt: như trên. Sản phẩm PCR gen HBsAg (680 bp) cònđược kiểm tra bằng máy phân tích tự động Agilent 2100 Bioanalyzer - Automated Analysis System (công ty Agilent Technologies, Mỹ) với bộ kit DNA 12000 LabChip (công ty Caliper Life Science, Mỹ). Sự hiện diện của protein HBsAg đ ược kiểm tra bằng máy phân tích Agilent 2100
Bioanalyzer với bộ kit Protein 200 Plus LabChip của các công ty nói trên.
Kiểm tra nhanh sự hiện diện của protein HBsAg trong cây chuyển gen bằng que thử đặc hiệu của công ty Clinotech Diagnostics (Mỹ).