VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HƯỚNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống thuốc lá, cà chua: Sử dụng giống thuốc lá sợi vàng K.326 và cà chua bi quả

dài (mua ngoài chợ). Hạt được khử trùng bằng nước Javel 50 % (v/v) trong 5 phút, rửa

sạch bằng nước cất và được cấy trên môi trường không chất sinh tr ưởng. Các mảnh lá

cây in vitro với kích thước khoảng 0,7 x 0,7cm (đối với thuốc lá) và lá mầm của cây

mầm 7-10 ngày tuổi (đối với cà chua) được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen.

Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy: Sử dụng môi tr ường cơ bản MS

(Murashige và Skoog, 1962) [13].

 Gieo hạt sau khử trùng và nuôi cây giai đo ạn tạo rễ: MS không chất sinh tr ưởng.

1/ Tái sinh chồi, cây từ mảnh lá: MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA (đối với thuốc

lá), MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA (đối với cà chua).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ 26-28°C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux.

Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

2/ LBA 4404 chứa plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) (do TS. Nguyễn Hữu Tâm

thiết kế) mang gen HBsAg (promoter T7, terminator T7;  0,7 kb), gen gusA (promoter T7, terminator T7) và gen nptII kháng kanamycin (promoter CaMV35S). Gen HBsAg mã hoá protein nhỏ S và gen gusA được điều khiển bởi hệ thống [promoter PDS

(phytoene desaturase,  2 kb) + T7-polymerase (2,7 kb)] tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở

quả. Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có 50mg/l kanamycin trước khi gây

nhiễm mô.

Quy trình chuyển gen:

 Cấy các mảnh lá (đối với thuốc lá) và lá mầm (đối với cà chua) trên môi trường 2;

 Gây nhiễm mô với vi khuẩn trong 10 phút và nuôi chung mô và vi khuẩn trong 2 ngày trên môi trường 2; để ngoài sáng (trường hợp cà chua thì môi trường có bổ

sung acetosyringone 100 M).

 Rửa vi khuẩn bám vào mô bằng nước cất+ 500mg/l cefotaxime, thấm khô nhẹmô.

 Cấy mô lá / lá mầm trên cùng môi trường 2 có 500mg/l cefotaxime và tác nhân chọn lọc kanamycin 100 mg/l (đối với thuốc lá) hoặc tăng dần từ 20-50mg/l (đối với cà chua); để ngoài sáng.

 Cấy truyền mô hình thành trên môi trường có kanamycin sang môi tr ường chọn lọc như trên (thực hiện 3-4 chu kỳ, 15 ngày / chu kỳ) đến khi hình thành chồi và cây con.

Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển:

 Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá, chồi trong thuốc thử GUS ở

37°C (tủ ấm) trong 24 giờ.

 Đối với cà chua, mảnh lá của cây giả định chuyển gen đ ược cấy trên môi trường số

2 có 50mg/l kanamycin để theo dõi khả năng tạo mô sẹo và tái sinh.

 PCR: Sự hiện diện của gen nptII, gen gusA v à gen HBsAg được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu.

Gen nptII: K1: A CACGCTGAAATCACCAGTCTC, K2: CTCGTCCTGCAGTTCATTC; khuếch đại đoạn 600 bp; chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 55C: 1 phút, 72C: 2 phút); 72C: 7 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:

CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương trình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C: 30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .

Gen HBsAg: Sử dụng cặp mồi: HBV1: CTACACTCGTGGTGGACTTCTC,

HBV2: AACGCCGCAGACACATCC; khuếch đại đoạn DNA 680 bp; ch ương trình nhiệt:94C:10 phút; 40 chu kỳ (94C: 50 giây, 45C: 45 giây, 72C: 50 giây); 72C: 7 phút; hoặc cặp mồi HBsAg1: ATGGAGAACACAACATC, HBsAg2:

GGATCCTTTTGCGGAAGCCCA; khuếch đại đoạn DNA 480 bp; ch ương trình nhiệt: như trên. Sản phẩm PCR gen HBsAg (680 bp) cònđược kiểm tra bằng máy phân tích tự động Agilent 2100 Bioanalyzer - Automated Analysis System (công ty Agilent Technologies, Mỹ) với bộ kit DNA 12000 LabChip (công ty Caliper Life Science, Mỹ).  Sự hiện diện của protein HBsAg đ ược kiểm tra bằng máy phân tích Agilent 2100

Bioanalyzer với bộ kit Protein 200 Plus LabChip của các công ty nói trên.

 Kiểm tra nhanh sự hiện diện của protein HBsAg trong cây chuyển gen bằng que thử đặc hiệu của công ty Clinotech Diagnostics (Mỹ).