Công nghệ gen thực vật

Phân lập gen 4 kiểu: - kiểu hình đột biến - Đặc tính hóa sinh của sản phẩm gen  Elisa - Đo mức độ biểu hiện  PCR - Trình tự DNA  lai phân tử 4 cách nghiên cứu di truyền ngược - biểu

Chương 6 Công nghệ gen thực vật

Tạ Ngọc Ly

www.themegallery.com

Khái niệm về gen

 DNA mã hóa protein thông qua gen

 DNA là chuỗi các nucleotide

 DNA được cấu trúc thành các nhiễm

sắc thể

www.themegallery.com

www.themegallery.com

Quá trình sau phiên mã

www.themegallery.com

Poly adenylation

Transesterfications

Splicing

Quá trình dịch mã

www.themegallery.com

Amino acid

attachment site

Hydrogen bonds

3′

5′

Two-dimensional structure Anticodon

Amino acid attachment site

3′

5′

Hydrogen bonds

Anticodon Anticodon

Symbol used in this book Three-dimensional structure

3′ 5′

www.themegallery.com

Nghiên cứu chức năng bộ máy di truyền

www.themegallery.com

Systems Biology

Phân lập gen

 4 kiểu:

- kiểu hình đột biến

- Đặc tính hóa sinh của sản phẩm gen  Elisa

- Đo mức độ biểu hiện  PCR

- Trình tự DNA  lai phân tử

4 cách nghiên cứu di truyền ngược

- biểu hiện quá mức

- Tăng hoặc giảm chức năng gen

- Ức chế gen ( gen silence)

- Gen knockout

www.themegallery.com

Chọn lọc bằng các maker phân tử

www.themegallery.com

www.themegallery.com

www.themegallery.com

Các maker và promoter dùng trong

công nghệ gen thực vật

 Maker chọn lọc

 Maker chỉ thị (reporter)

www.themegallery.com

Reporter maker

 β -glucuronidase (GUS):

- substrate: 4-methylumbelliferyl glucuronide(MUG)

- histochemical localization :

- Co thể dùng confocal lasers canning microscopy để

đọc trực tiếp trên tế bào www.themegallery.com

Các vector chuyển gen thực vật

 Ti plasmid

www.themegallery.com

Vector nhị hợp

 pVS1: tái sinh trong Agrobacterium

 CoIE1: tái sinh trong Ecoli

www.themegallery.com

Gate way cloning

 bacteriophage lambda ( λ )

www.themegallery.com

Univector(EchoTM ) Cloning

www.themegallery.com

Vector cho RNA Interference(RNAi)

 Sủ dụng Gateway vector tạo cấu trúc kẹp tóc

www.themegallery.com

Dòng hóa gen

www.themegallery.com

 Bước 1: DNA tách chiết từ cá thể có chứa gen mục tiêu được cắt bởi

enzyme giới hạn thành nhiều mảnh có kích thước của một gen

 Bước 2: plasmid của vi khuẩn cũng được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn

 Bước 3: DNA có kích thước một gen và plasmid đã được xử lý được trộn chung với nhau trong một tube Một số các đoạn DNA đã được cắt bằng enzyme sẽ nối với plasmid và tạo thành plasmid tái tổ hợp

 Bước 4: plasmid tái tổ hợp sau đó được chuyển vào tế bào vi khuẩn bằng điện biến nạp hoặc hoá biến nạp

 Bước 5: vi khuẩn tăng trưởng trên đĩa môi trường và cho phép hình thành khuẩn lạc Tất cả khuẩn lạc trên đĩa môi trường được gọi là ngân hàng gen

 Bước 6: sàng lọc để tìm ra khuẩn lạc nào có chứa gen mục tiêu bằng cách phát hiện trình tự DNA của gen mục tiêu hay một protein mà gen đó mã hoá hay sử dụng mẫu dò

www.themegallery.com

Chiết xuất và tinh sạch DNA

 Chiết xuất

 Nghiền tế bào thực vật trong điều kiện lạnh

cho DNA hòa tan vào đệm chiết.

 Hóa chất: SDS, CTAB, EDTA

Tách chiết DNA từ lá lúa

 Các bước tiến hành

 Nghiền nhỏ mẫu thực vật

 - Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm đông lạnh trước khi

dùng) xay cho đến khi thành bột mịn.

 - Chuyển bột lá mía vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc 50

ml nitơ lỏng Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng.

 Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách ADN và loại bỏ protein

 - Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu lá lúa đã được xử

 lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ.

 - Ngâm trong bể nước nóng ở 56 độ trong vòng 20 phút.

 - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20phút)

 - Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung dịch CTAB

10 % đã được hâm nóng ở 70 độ.Sau đó trộn đều.

 - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng.Sau

đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút).

 Thu lớp nước trên vào ống nghiệm mới.



 Kết tủa CTAB và ADN

 - Cho 30 ml (1.5 thể tích dung dịch thu được ở thí nghiệm trên) đệm kết

tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng DNA màu trắng đục nổi lên

 - Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút) Loại bỏ phần dịch

lỏng

 thu phần kết tủa.

 - Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56oC NaCl 1M và

 cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA

 - Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa ADN.

 - Quay li tâm, lấy phần tủa.

 - Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa.

 - Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần tủa.

 - Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô ADN Lúc này

 ADN sẽ chuyến sang trong suốt không màu

 - Hòa tan ADN thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20oC cho thí

 nghiệm tiếp theo

Các bước cơ bản của pcr

Bước 1 : Biến tính (denatuaration) ở 94- 950C trong 30’- 1 phút

Bước 2 :Gắn mồi (hybridization) ở 40-70 0 C trong 1 phút

Bước 3 : Kéo dài (elongation) nhiệt độ tăng lên 720C kéo dài

từ 30’ đến vài phút

Bước 4: Lặp lại bước 1 với chu kì khoảng 30-

40 lần

Phản ứng RT-PCR

Điện di

Một số gen chỉ thị sàng lọc

Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để phát hiện

gus A β-glucuronidase X-Gluc

luc Luciferase đom đóm Lumis Phos

lux Luciferase vi khuẩn Lumi Phos

cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol đánh dấu

Xác nhận sự thay đổi về gen

 tỷ lệ biến nạp thấp

 đột biến tự nhiên với tần suất xuất hiện 10-6 đến 10-8

Southern blot hoặc PCR Kiểm tra sản phẩm chuyển gen

Sự biểu hiện của DNA được biến nạp

 Một gen lạ có thể biểu hiện trong tất cả tế bào (DNA lạ biến

nạp vào nhiều vị trí khác nhau trong hệ gen) hoặc chỉ trong một số loại tế bào hoặc mô nhất định

Đoạn của RTBV PLAT4912 Puroindolin-b TA29

Sự bền vững của cây chuyển gen

 Sự bất hoạt do sự methyl hóa

-Sự methyl hóa DNA lặp lại thường xảy ra ở nguyên tử thứ 5 của vòng cytosine và thườngở trình tự base CG hoặc CNG, ở đây C và G là nucleotide cytosin và

guanin, N là tượng trưng cho một base tuỳ ý nào đó.

- Những trình tự được methyl hóa hoặc là không được

sao chép hoặc hiếm khi được sao chép, do đó sự biểu hiện của gen bị giảm hoặc hoàn toàn bị ức chế.