TỔNG hợp CÔNG NGHỆ GEN THỰC vật

Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính, gây đột biến…, ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã và đang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có lợi vào thực vật để tạo ra những cây trồng có tính trạng mà chúng ta mong muốn.

Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn PHẦN V CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 345 CẤU TRÚC vector plasmid MANG GEN KHÁNG SÂU VÀ ỨNG DỤNG TRONG TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển Phòng Cơng nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống trồng truyền thống nh lai hữu tính, gây đột biến…, ngành cơng nghệ sinh học với phát triển công nghệ gen tạo bước đột phá cơng nghệ gen cho phép đưa gen có lợi vào thực vật để tạo trồng có tính trạng mà mong muốn Hàng năm giới tốn nhiều chi phí việc phòng trừ sâu hại Các nhà khoa học nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào trồng để trồng tự sản sinh protein gây chết sâu hại Cây trồng mang gen kháng sâu Bt thành tựu công nghệ sinh học việc cải tiến trồng Cây mang gen tạo độc tố có khả kháng với sâu hại thuộc Lepidoptera, Coleoptera Diptera Hiện việc cải tiến kỹ thuật chuyển gen Bt phải cải tiến gen thích hợp cho gen Bt, gen vi khuẩn biểu có hiệu thực vật Phương pháp có hiệu để tạo chuyển gen sử dụng súng bắn gen; nhiên, sở nghiên cứu chưa thể trang bị thiết bị việc chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phương pháp lựa chọn; phương pháp dùng vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens có ưu điểm riêng mà phương pháp khác khơng có đư ợc Theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp, nghiên cứu tái cấu trúc vector plasmid mang ba gen gen bar (gen chọn lọc), gen gusA (gen thị) gen Bt cryIA nhằm tạo số vector plasmid - đặt tên plasmid pITB (Institute of Tropical Biology) Nội dung báo này, chúng tơi trình bày k ết nghiên cứu tái cấu trúc sử dụng plasmid qua tái cấu trúc nghi ên cứu tạo cây hông cải chuyển gen VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Cấu trúc plasmid   Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 sử dụng để chuyển gen Chuẩn E coli DH5: dùng làm vi khuẩn có khả biến nạp Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 346  Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Plasmid pCAMBIA 3301, plasmid pUbi.cryIA(b) plasmid pUbi cryIA(c) Chuyển gen vào Vật liệu dòng vi khuẩn: Cây ống nghiệm dùng làm vật liệu chuyển gen Sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) EHA 105 chứa plasmid ITB mang gen cryIA(c), gen bar gen gusA Phương pháp chuyển gen vào hông (Paulownia fortunei): Sử dụng vi khuẩn At lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau mảnh ni cấy mơi trường tái sinh tạo chồi (mơi trường MS có 0,1mg/l NAA 10mg/l BA) có bổ sung chất acetosyringone nồng độ 100 µM hai ngày Sau rửa diệt vi khuẩn dung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime thời gian 30 phút, chuyển mảnh sang mơi trường tái sinh tạo chồi có chứa 4mg/l PPT v 500mg/l cefotaxime Cấy truyền tuần/ lần loại mơi trường Sau tuần, mẫu có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi trường cho rễ có chứa 4mg/l PPT Các rễ tốt đưa trồng vườn ươm Phương pháp chuyển gen vào cải (Brassica integrifolia L.): Lá mầm với cuống dài 1-2mm từ hạt nẩy mầm 5-6 ngày tuổi sử dụng làm mẫu chuyển gen Sử dụng vi khuẩn đ ã lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau mầm nuôi cấy môi trường tái sinh tạo chồi (mơi trường MS có 2mg/l NAA, 4mg/l BA 3,3mg/l AgNO 3) hai ngày (có bổ sung acetosyringone nồng độ 100 µM) Sau rửa diệt vi khuẩn dung dịch kháng sinh 500 mg/l cefotaxime thời gian 30 phút, chuyển mẫu sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa chất chọn lọc PPT 500mg/l cefotaxime Cấy truyền tuần/ lần loại mơi trường Sau 4-5 tuần, mẫu có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi trường rễ (mơi trường MS có 0,1mg/l NAA 6mg/l PPT) Phương pháp kiểm tra chuyển gen:  Kiểm tra gen thị gusA dung dịch X-Gluc: cách ngâm mảnh chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 37C, mẫu chuyển gen có màu xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng không chuyển m àu  PCR gen cryIA(c): DNA thực vật chạy PCR với cặp mồi chuy ên biệt, quy trình tách DNA thực vật thực theo phương pháp Dellaporta (1983)  Các chuyển gen kiểm tra biểu gen cryIA(c) qua khả kháng sâu cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên mẫu đĩa pétri KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cấu trúc plasmid Việc gắn gen cryIA(b) cryIA(c) vào plasmid pCAMBIA 3301 để tạo plasmid sau: Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 347  Vectơ plasmid CAMBIA 3301 có độ dài 12 Kb chứa gen gusA gen bar Có 14 enzyme giới hạn vị trí cloning site vùng T-DNA, cho phép tách ghép đoạn gen mong muốn Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng enzyme giới hạn Hind III (A/AGCTT) để cắt tạo hai đầu Hind III chuỗi plasmid pCAMBIA 3301  Plasmid pUbi.cryIA(b) plasmid pUbi.cryIA(c) ch ứa gen cryIA có độ dài kb, hai đầu tồn gen (promoter-gen-terminator) có vị trí cắt enzyme giới hạn Hind III Nên sử dụng enzyme giới hạn Hind III để cắt hai vị trí  Sau cắt enzyme giới hạn Hind III đoạn plasmid DNA chạy điện di cho kết quả: với plasmid pCAMBIA mở với hai đầu cắt Hind III xử lý AP (alkaline phosphat) để chúng khó tự nối lại với C òn plasmid pUbi.cryIA có hai vị trí cắt nên tạo hai đoạn: kb DNA tương ứng với thân lại plasmid đoạn kb tương ứng với đoạn gen cryIA Sau tiến hành nối kết đoạn DNA plasmid pCAMBIA 12 kb v đoạn gen cryIA kb với enzyme ligase nhiệt độ oC thời gian 16 Kết tạo plasmid dài khoảng 16 kb Để kiểm tra kết qủa chuyển plasmid vào vi khuẩn biến nạp E.coli, nhân E coli tách chiết ADN Sử dụng lại enzyme giới hạn Hind III để cắt cho kết plasmid cho hai băng DNA với đoạn 12 kb v đoạn kb (xem ảnh điện di) hồn tồn phù hợp với kích thước plasmid đặt tên plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) ch ứa gen chuyển vào dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 Chuyển gen vào hông: Sau chuyển gen vi khuẩn At, mẫu đăt môi trường có PPT nồng độ 4mg/l, đa số mảnh bắt đầu vàng sau tuần nuôi cấy, số mảnh tr ì màu xanh khơng hình thành mơ sẹo, số khoảng 10% h ình thành mơ sẹo số bắt đầu tái sinh sau tuần nuôi cấy S au giai đoạn chọn lọc chồi chuyển sang môi trường MS để rễ với 4mg/l PPT Và có vài dòng tiếp tục phát triển rễ, giả định chuyển gen Kết trình chuyển gen thể sau: Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi chuyển gen mảnh mơi trường có 4mg/l PPT sau nhiễm với Agrobacterium tumefaciens mẫu đối chứng Thí nghiệm Số mẫu Số mẫu tái sinh chồi 21 Số lượng dòng chuyển gen Tần số chuyển gen (%) 580 Số mẫu tạo mô sẹo 52 Chuyển gen Đối chứng 30 0 0 0,8 Để khẳng định hông chuyển gen, cấy hông giả định chuyển gen đối chứng vào môi trường rễ với chất chọn lọc PPT nồng độ 4mg/l để thử khả chống chịu, sau tuần toàn đối chứng chết hoàn toàn, chuyển gen tiếp phát triển rễ, giúp khẳng định hông chuyển gen Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 348 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Sự biểu gen gusA chuyển gen: Các chồi nhỏ, mảnh chuyển gen xử lý với dung dịch X-Gluc, kết cho thấy chồi mảnh có màu xanh chàm đặc trưng khẳng định biểu gen gusA chuyển gen Sự biểu gen bar chuyển gen: gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏ khẳng định in vitro, nhiên muốn tiếp tục khảo sát tồn ổn định khả biểu gen sau trồng môi trường tự nhiên ngồi vườn ươm Chúng tơi sử dụng nồng độ 300mg/l PPT để phun l ên đối chứng chuyển gen tháng tuổi vườn ươm Sau tuần nhận thấy hông chuyển gen tiếp tục sinh trưởng phát triển bình thường, có dòng bị vàng phía sống phát triển cho phép khẳng định lần n ữa hông nhận gen chuyển Sự diện gen cryIA(c) khả kháng sâu chuyển gen: Phân tích PCR với cặp mồi chuyên biệt cho gen cryIA(c) cho thấy mẫu DNA chuyển gen sau chạy điện di có xuất băng có kích thước 0,65 kb giống mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng kết khuếch đại gen cryIA(c) mẫu đối chứng hồn tồn khơng có băng Qua chúng tơi kh ẳng định diện gen cryIA(c) nhiễm sắc thể chuyển gen Sau hông chuyển gen đ ược chuyển trồng vườn ươm Để thử nghiệm tính kháng sâu nhỏ đ ược đặt đĩa pétri sâu xanh Heliothis armigera Sau ngày, với đối chứng diện tích bị hại lớn, kích th ước sâu tăng rõ rệt, chuyển gen diện tích bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng tr ưởng sau ngày sâu hoàn tồn khơng ăn chết nhiều vào ngày thứ Chuyển gen vào cải ngọt: Với phương pháp sử dụng mầm từ hạt nẩ y mầm 5-6 ngày tuổi, cấy mầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước nhúng cuống mầm v dịch vi khuẩn để lây nhiễm, thời gian ủ với vi khuẩn l hai ngày mơi trường có bổ sung 100 µM Acetosyringone sau r ửa cấy môi trường tái sinh có Cefotaxime 500mg/l 4mg/l PPT sau 3-4 tuần chồi tái sinh hình thành chúng cấy truyền mơi trường MS có 6mg/l PPT để kiểm tra khả kháng PPT Chúng tơi thực thí nghiệm chuyển gen nhiều lần với số mẫu trun g bình từ 80120 mẫu/lần Kết trình bày bảng Bảng Tỷ lệ tái sinh ch ồi cây, môi trường có 4mg/l PPT, mầm nhiễm với Agrobacterium tumefaciens v mẫu mầm đối chứng Thí nghiệm Số mầm Số mầm Số mầm thí nghiệm tạo mơ sẹo tái sinh chồi Chuyển gen 1380 Đối chứng 30 52 (3,7%) 21 ( 1,5%) Số lượng dòng giả định chuyển gen Tần số chuyển gen (%) 0,14 0 Qua thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy số lượng mầm chống chịu với chất chọn lọc 4mg/l PPT để hình thành mơ sẹo khoảng 3,7% số lượng tái sinh chồi mức 1,5% gần đa số chồi không phát triển v chết lần cấy truyền sau, theo tượng coi escape phổ biến trình chuyển Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 349 gen chồi thể khảm chồi tiếp tục phát triển môi trường MS với 6mg/l PPT - điều cho thấy tần số chuyển gen thấp (0,14%) Chúng cho chuyển gen đối tượng trồng khác thuốc hơng mẫu có khả tái sinh chồi cao từ xung quanh rìa nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens xâm nhập vào nhiều vị trí có khả tái sinh này, cải mầm tái sinh cuống nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có vị trí để xâm nhiễm tạo chuyển gen Các cải giả định chuyển gen đ ược phân tích PCR với cặp mồi chuyên biệt gen cryIA(c) - cho thấy mẫu DNA giả định chuyển gen sau chạy điện di có xuất băng có kíc h thước 0,65 kb giống mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng kết khuếch đại gen cryIA(c) mẫu đối chứng hồn tồn khơng có băng KẾT LUẬN Với việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB để chuyển gen, nhận số dòng hơng cải chuyển gen mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera B ằng kỹ thuật sinh học phân tử sinh học xác định gen diện hông cải chuyển gen gen chuyển có biểu tính trạng rõ rệt Plasmid ITB (lane mang gen cryIA(b) cryIA(c) Phân tích PCR gen cryIA(c) hông chuyển gen (băng DNA 0,65 kb) Cây cải giả định chuyển gen phát triển môi trường chọn lọc PPT Phân tích PCR gen cryIA(c) cải chuyển gen (băng DNA 0,65 kb) Cây hông giả định chuyển gen phát triển môi trường chọn lọc PPT Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 350 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn LỜI CÁM ƠN Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương trình KC-04-13, Chương trình nghiên cứu tài trợ thiết thực cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2003 Tạo hông (Paulownia fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 1617/12/2003 NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 1088-1090 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005 Ảnh hưởng tác nhân chọn lọc đến mô cải ( Brassica integrifolia) nghiên cứu tạo cải chuyển gen Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học t oàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống” , Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr 1194-1197 Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005 Khảo sát khả tái sinh in vitro cải (Brassica integrifolia) từ mầm trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống” , Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr 498-500 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu H ổ, 2003 Nghiên cứu hệ thống tái sinh hông (Paulownia fortunei) ảnh hưởng tác nhân chọn lọc để tạo chuyển gen Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003 NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 866-869 Murashige, T., Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture Physiol Plant 15: 473-497 Pua, E C., Barfield D G., 1991 Gene transfer in plants of Brassica juncea using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation Plant Cell Reports 10: 308-314 SUMMARY Construction of plasmid vector and utilization for production of transgenic plants resistant to insect via Agrobacterium tumefaciens Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen Institute of Tropical Biology New plasmid vector pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) consisting bar, cryIA(c) and gusA genes was constructed and applied to transfer into Agrobacterium tumefaciens EHA 105 for Paulownia and Brassica plants genetic transformation Many transgenic lines of both plant cultivars were obtained PCR analyses and indigogenic GUS assay were performed to confirm the presence and the expression of bar, cryIA(c) and gusA genes Insect bioassays with larvae showed an improvement of resistance against Heliothis armigera Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 351 TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀ CÔN TRÙNG Phạm Thị Hạnh, Phan T ường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ Phòng Cơng nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới ĐẶT VẤN ĐỀ Một yếu tố làm giảm suất trồng đồng ruộng tác hại sâu bệnh gây việc phòng trừ dịch hại thường gây ô nhiễm môi trường ngày nghiêm trọng Vấn đề giải thông qua kết hợp khoa học đại v ý thức giữ gìn sinh thái mơi trường Một ứng dụng công nghệ sinh học để giải vấn đề tr ên tạo trồng tự thân có khả chống chịu với loại sâu bệnh Trong loại trùng gây hại rầy, rệp chiếm vai trò quan trọng, việc chích hút nhựa chúng làm không phát triển đồng thời chúng nguồn lây lan số bệnh virus quan trọng nh virus gây bệnh khảm thuốc Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào trồng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens xem phương pháp có hiệu quả, phương pháp qua k ết chuyển gen thường biểu kiểu tích hợp gen (DNA integration) t ương đối đơn giản, phù hợp với ý muốn nh công nghệ gen Nội dung báo cáo này, nghiên cứu tái cấu trúc plasmid mang gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ), gen gna (gen kháng trùng chích hút) gen gusA; chuyển plasmid cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng dòng vi khuẩn biến nạp nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ v côn trùng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu  Vi khuẩn E coli chứa plasmid pBluescript SK +-GNA mang cassette gen nguyên vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hố protein GNA (gen gna) + Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần kb  Chủng vi khuẩn E coli chứa pCAMBIA 3301 mang gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ) gusA (gen thị) Gen thị gusA: phân lập từ vi khuẩn E coli (Jefferson & ctv., 1987), mã hóa enzym -glucuronidase (khơng màu) Enzyme xúc tác phản ứng phân giải chất glucuronide (không m àu) để tạo thành Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 352 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết Glucuronide th ường dùng gọi X-gluc, cơng thức hóa học: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide Gen bar kháng chất phosphinothricin (PPT) đ ược phân lập từ vi khuẩn S hygroscopicus Gen mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase (PAT), giúp biến đổi PPT từ dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết trồng sang dạng bị acetyl hóa khơng c òn gây độc cho Vì vậy, ngồi tác dụng chọn lọc q trình chuyển gen thực vật, gen bar có vai trò kháng thuốc trừ cỏ Basta sản xuất nơng nghiệp     Chủng vi khuẩn E coli DH5 dùng biến nạp nhằm khuếch đại số l ượng plasmid Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB) chứa kháng sinh sử dụng nuôi cấy biến nạp Enzym giới hạn SacI, KpnI enzym nối DNA ligase T4 Phương pháp a Cấu trúc plasmid Phương pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình Sambrook ctv (1989) Các phản ứng nối kết thực nhiệt độ 14 0C thời gian 3-4g Biến nạp E coli Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp sốc nhiệt, 42 0C phút Mơi trường LB bổ sung kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biến nạp Trong thí nghiệm sử dụng kháng sinh nh kanamycin (50mg/l) streptomycin (25mg/l) Các hợp chất hóa sinh IPTG (Isopropyl-D-thiogalactoside) 50mg/l X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D galactopyranoside) 40mg/l đư ợc bổ sung vào môi trường nuôi cấy thể biến nạp để hoạt hoá enzym -galactosidase, cho phép chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng Ph ương pháp tách DNA plasmid khuẩn lạc để kiểm tra cloning theo phương pháp kit công ty Promega b Tạo thuốc kháng thuốc trừ cỏ v kháng côn trùng Sử dụng giống thuốc sợi v àng Kutsaga 326 Lá thu ốc ống nghiệm cắt kích thước khoảng 1x1cm dùng làm nguyên liệu chuyển gen Sử dụng vi khuẩn lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau mảnh đ ược nuôi cấy môi trường tái sinh tạo chồi (mơi tr ường MS có 0,1mg/l NAA v 1mg/l BA) hai ngày Sau r ửa diệt vi khuẩn dung dịch Cefotaxim e 500mg/l thời gian 30 phút, chuyển mảnh sang mơi tr ường tái sinh tạo chồi có 10mg/l PPT 500mg/l Cefotaxim e Cấy truyền tuần / lần loại môi trường Sau tuần, mẫu có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang mơi tr ường rễ có chứa 20 mg/l PPT Các rễ tốt đưa trồng vườn ươm Phương pháp kiểm tra chuyển gen  Khảo sát khả phát triển v rễ chuyển gen v đối chứng in vitro mơi trường MS có chứa chất chọn lọc nồng độ 20mg/l PPT Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 353  Kiểm tra gen thị gusA dung dịch X-Gluc: cách ngâm mảnh v chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 370C, mẫu chuyển gen có màu xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng không chuyển m àu  Sự diện gen gna kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt sau: Mồi 1: 5’CGG ATC CAT GGC TAA GGC AAG TCT CCT C-3’ mồi 2: 5’CGG TAC CTC ATT ACT TTG AAG TCA CAA G -3’ Kích thước đoạn DNA gen gna khuếch đại phản ứng PCR đ ược mong đợi 0,47 kb  Sự diện gen bar kiểm tra qua phân tíc h PCR với cặp mồi sau: Mồi 1: 5’ ATG AGC CCA GAA CGA CG 3’ v mồi 2: 5’ TCA GAT CTC GGT GAC GG 3’ Gen bar chuyển gen qua phân tích PCR có đoạn DNA khuếch đại 0,5 kb  Các chuyển gen đối chứng phun dung dịch Basta (PPT nồng độ 4g/l) có bổ sung chất bám dính Tween 80 để kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cấu trúc plasmid Trong thí nghiệm chúng tơi xử lý cassette gen nguyên vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình t ự mã hoá protein GNA (gen gna) + Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần kb nằm tr ên plasmid Bluescript SK+ cắt hai enzym giới hạn Kpn I v Sac I Cassette chèn vào vị trí Lac Z alpha (trong vùng T -DNA, cắt Kpn I Sac I) plasmid pCAMBIA 3301 Tiếp theo chạy điện di gel agarose 0,8% kết điện di sau cắt enzym cho thấy plasmid pBluescript SK+ -GNA cắt làm hai đoạn, đoạn khoảng gần kb nguyên cassette chứa gen gna plasmid pCAMBIA có đoạn khoảng 12 kb Tách làm đoạn cassette plasmid backbone trước đưa vào nối kết (ligation) Phản ứng nối kết gen gna v vector pCAMBIA enzym ligase T4 14 oC Sau sản phẩm tr ên biến nạp vào E coli DH5 khả biến mơi trường LB có 50 mg/l kháng sinh kanamycin, nuôi 37 oC qua đêm Kết cho thấy đĩa đối chứng (biếp nạp khơng có plasmid), tế b E coli DH5 không bổ sung plasmid thực biến nạp n ên khả kháng Kanamycin, chúng khơng sinh trưởng mơi trường LB có bổ sung kanamycin Ngược lại, thể biến nạp mang plasmid phát triển đ ược môi trường chọn lọc chứng tỏ chúng thể mong muốn Bên cạnh đó, mơi trường chọn lọc có bổ sung X-gal, dựa nguyên tắc sàng lọc, khuẩn lạc trắng tr ên đĩa biến nạp sơ chọn để nhân plasmid Để xác định kết quả, lấy Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 398 Ở nghiệm thức 4, bảng 1, tr ên mơi trường có 2,4-D nồng độ 6mg/l, mẫu hình thành mô sẹo đạt tỷ lệ cao 95,56% Ở môi trường đối chứng (2,4-D nồng độ 0mg/l), mẫu gia tăng kích thước khơng có dấu hiệu tạo mơ sẹo Ở tuần thứ 2, có hình thành rễ từ cuống bìa số mẫu Trên mơi trường bổ sung 4-FA, hình thành mơ sẹo chậm Hình thái mơ sẹo phát triển tương tự mơi trường 2,4-D, nhiên có hình thành cụm mơ nhỏ xốp trắng đục Bảng 2: Ảnh hưởng 4-FA lên tạo mô sẹo sau tuần nuôi cấy thứ v thứ Nghiệm thức Ký hiệu MT Nồng độ 4FA (mg/l) ĐC Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tuần thứ Tuần thứ 0E 0E F2 21,11 ± 1,92 C 56,67 ± 3,34 C F4 56,67 ± 3,34 A 85,56 ± 1,93 A F6 42,22 ± 1,92 B 70,00 ± 3,33 B F8 15,56 ± 1,93 D 47,78 ± 1,92 D **CV (%) = 7,78 **CV (%) = 4,68 Nghiệm thức 3, bảng 2, mơi tr ường có 4-FA nồng độ 4mg/l cho kết tốt với 56,67% mẫu tạo mô sẹo tuần nuôi cấy thứ v 85,56% tuần nuôi cấy thứ (tỷ lệ thấp so với nghiệm thức tạo mô sẹo cao tr ên mơi trường có 2,4-D) Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D 4-FA đến khả sinh phôi mẫu mô sẹo Bảng 3: Ảnh hưởng 2,4-D đến khả sinh phôi Nghiệm thức Ký hiệu MT Nồng độ 2,4D (mg/l) Tỷ lệ mẫu sinh phôi (%) ĐC 0 0G D2 16,67 25,00 ± 1,00 E D4 26,67 39,33 ± 1,53 D D6 58,89 76,00 ± 2,00 A D8 36,67 60,33 ± 1,53 B D10 10 20,00 47,00 ± 1,00 C D12 12 7,78 11,67 ± 1,53 F Tổng số phôi **CV = 3,68% Trên mơi trường có 2,4-D, sau 40 ngày ni cấy, phơi bắt đầu hình thành khối mơ sẹo Phơi tạo thành cụm gồm trung bình 4,5 phơi nằm cạnh Theo dõi đến ngày 70 số lượng phơi hình thành khơng tăng Kết bảng cho thấy nghiệ m thức 4, mơi trường có bổ sung 2,4-D nồng độ mg/l, cho có ảnh hưởng tốt đến phát sinh phôi, đạt 58,89% mẫu cấy sinh phôi tổng số phôi thu nhận 76 phơi Trên mơi trường có 4-FA, sau 45 - 50 ngày phơi bắt đầu hình thành Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 399 khối mô sẹo, chậm so với mơi trường có 2,4-D Đến ngày thứ 75, số phôi tạo thành không tăng thêm K ết thu nhận trình bày bảng Bảng 4: Ảnh hưởng 4-FA đến khả sinh phôi Nghiệm thức Ký hiệu MT Nồng độ 4FA (mg/l) Tỷ lệ mẫu sinh phôi (%) Tổng số phôi ĐC 0 0E F2 34,44 46,00 ± 2,00 B F4 57,78 101,67 ± 3,51 A F6 20,00 29,67 ± 1,53 C F8 8,89 16,67 ± 0,58 D **CV = 5,02% Kết bảng cho thấy nghiệm thức (mơi tr ường có bổ sung -FA nồng độ mg/l) đạt giá trị cao ti theo dõi 57,78% mẫu cấy sinh phơi có tổng số phôi thu nhận 101,67 phôi Số phơi cao nhận từ mơi trường có bổ sung 2,4-D (6mg/l) thấp mơi trường có bổ sung 4-FA (4mg/l), thời gian hình thành phơi nhanh Q trình hình thành phơi mơi trường có 2,4-D 4-FA ghi nhận qua giai đoạn thục điển hình từ dạng cầu, tim thủy lơi dạng có cực chồi rễ (hình 1b-f) Giải phẫu nhuộm mẫu Phẫu thức giai đoạn phát triển phôi đ ược nhuộm quan sát rõ ràng kính hiển vi vật kính (x10) (Hình 2) Khảo sát ảnh hưởng GA đến phát triển phôi Phôi trưởng thành, thu nhận từ mơi trường có bổ sung 2,4-D 4-FA cấy truyền sang mơi trường có bổ sung GA3 Sau 15 ng ày, thân mầm vươn cao rễ hình thành Từ 22 - 25 ngày, hai mầm tách ra, chồi xuất với ho àn chỉnh phát triển thành bình thường Một số phôi dị dạng không phát triển th ành hồn chỉnh, chết q trình ni cấy Bảng 5: Ảnh hưởng GA3 đến phát triển phơi thu nhận từ mơi tr ường có bổ sung 2,4-D 4-FA Nghiệm thức Ký hiệu MT Nồng độ GA3 (mg/l) Tỷ lệ phơi có rễ mầm (%) Tỷ lệ phôi phát triển thành hồn chỉnh (%) Tỷ lệ phơi có rễ mầm (%) từ MT có bổ sung 2,4-D Tỷ lệ phơi phát triển thành hồn chỉnh (%) từ MT có bổ sung 4-FA NT1 ĐC 54,44 3,33 ± 3,33 D 51,11 2,22 ± 1,92 D NT2 G1 0,1 71,11 15,56 ± 1,93 C 70,00 17,78 ± 1,92 C NT3 G2 0,2 85,56 36,67 ± 3,34 B 83,33 35,55 ± 3,85 B NT4 G3 0,3 92,22 63,33 ± 3,34 A 91,11 62,22 ± 3,85 A **CV = 10,24% **CV = 10,34% Trên mơi trường có bổ sung GA3 0,3mg/l, tỷ lệ phơi phát triển thành hồn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 400 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn chỉnh cao hai trường hợp phôi thu nhận từ môi tr ường bổ sung 2,4-D môi trường bổ sung 4-FA Ở nghiệm thức 1, đối chứng, tỷ lệ phơi phát triển th ành hồn chỉnh thấp Chuyển in vitro trồng nhà lưới Cây in vitro cao khoảng 5-7cm chuyển trồng bầu đất ngo ài vườn ươm Sau tuần bén rễ non mới, tỉ lệ sống phát triển bình thường 94 % Chuyển sang chậu đất sau m ột tháng cao khoảng 50 - 60cm (Các giá trị trung bình bảng khơng mẫu tự cột có khác biệt rấ t có ý nghĩa mức p = 0,01 dựa theo trắc nghiệm LSD) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  Trên môi trường có bổ sung 2,4-D mẫu tạo mơ sẹo sau tuần ni cấy Mơi tr ường có nồng độ 2,4-D 6mg/l cho tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo cao 95,56% sau tuần Phơi bắt đầu hình thành tuần thứ Cũng môi trường tỉ lệ phơi hình thành cao 58,89% với 76 phơi  Đối với mơi trường có bổ sung 4-FA, thời gian mẫu cảm ứng tạo mô sẹo lâu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp h ơn so với 2,4-D Mẫu bắt đầu hình thành mơ sẹo sau tuần đạt tỷ lệ tối đa sau tuần nuôi cấy Ở nồng độ mg/l 4-FA mẫu tạo mô sẹo cao 85,56% Môi trường cho tỷ lệ tạo phôi cao l 57,78%, với 101,67 phơi  GA3 có ảnh hưởng rõ rệt đến việc phát triển phôi th ành hồn chỉnh Ở nồng độ thí nghiệm, mơi trường bổ sung GA 0,3mg/l mơi trường thích hợp để kích thích phơi phát triển thành hoàn chỉnh Tỷ lệ đạt khoảng 63%  Tỷ lệ sống chuyển từ b ình vườn ươm 94%  Có thể ứng dụng quy trình tạo phơi khoai mì cho nghiên cứu chuyển gen để tạo giống Hình 1: Tạo phơi vơ tính a: khoai mì in vitro b, c, d: phôi phát tri ển qua dạng hình cầu, hình tim, hình thủy lơi e, f: phơi trưởng thành dạng có cực Hình 2: Phẫu thức mơ a: phơi hình cầu; b: phơi hình tim c, d: phôi dạng thủy lôi cắt dọc d: phôi trưởng thành có hai sơ khởi Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 401 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý thực vật đại c ương, phần II: Phát triển NXB Đại học Quốc gia TP HCM, 187 - 223 Brenda J B., Micheal K S., Kenneth J S (1986) The use of embryo culture for the recovery of plants from cassava (Manihot esculenta Crantz) seeds Plant Cell Tiss Org Cul 6: 229-234 Gonzalez A E., Schopke C., Taylor N J (1998) Regeneration of transgenic cassava plants (Manihot esculenta Crantz) through Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic suspension cultures Plant Cell Reports 17: 827 – 831 Hoàng Kim, Phạm Văn Biên (1995) Cây sắn (Khoai mì) Nhà xuất Nơng nghiệp, TP HCM 66 tr Hoàng Thị Sản (chủ biên), Hoàng Thị Bé Phân loại học thực vật Nh xuất Giáo dục, 77 - 126 Kartha K K., Gamborrg O L (1975) Elimination of cassava mosaic disease by meristem culture Phytopathology 65: 862 - 868 Li H Q., Gui J I., Huang Y W (1998) Regeneration of cassav a plants via shoot organogenesis Plant Cell Rep 17: 410-414 Nguyễn My Uyên (2003) Phát sinh hình thái t mơ sẹo Paulownia fortunei v thăm dò khả biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Luận văn thạc sĩ sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM Sofiary E., Reamakers C J J M., Kanju E (1997) Comparison of NAA and 2.4 -D induced somatic embryogenesis in cassava Plant Cell Tissue and Organ Culture 50: 45 - 46 10 Stamp J A., Henshaw G G (1987) Somatic embryogenesis from clonal leaf tissues of cassava 11 Annuals of Botany 59: 445 - 450 12 Trung tâm Tư liệu - Tổng Cục Thống kê Việt Nam http://www.gso.gov.vn SUMMARY Somatic Embryogenesis in Cassava Phan Tuong Loc, Nguyen Huu Ho Institute of Tropical Biology Somatic embryos were obtained from immature leaf lobe explants of cassava cultured in vitro on the KM medium containing 6mg/l 2,4-D or 4mg/l 4-FA Mature somatic embryos were transferred to the medium supplemented with 0.3mg/l GA3 for elongating and rooting In vitro plants were transplanted into soil They were apparently normal, similar to the stock plants Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 402 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH in vitro CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum L) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN NẠP GEN TẠO protein lect in KHÁNG CÔN TRÙNG Nguyễn Thị Thanh, Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ Phòng Cơng nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) công nghiệp quan trọng có giá trị kinh tế cao gia vị sử dụng rộng rãi giới (8), hạt tiêu có vị nóng cay mùi thơm hấp dẫn, nên thích hợp cho việc chế biến thức ăn (3) Ngo ài ra, hạt tiêu dùng ngành công nghi ệp chế biến hương liệu, nước hoa y dược Trong năm gần đây, sản xuất xuất hạt tiêu Việt Nam có bước phát triển mạnh mẽ Từ sản l ượng 10.000 xuất 7.000 năm 1996 đến năm 2006 ước tính sản lượng xuất đạt 100.000 Việt Nam nay, chiếm vị trí số giới số l ượng lẫn giá trị xuất hạt ti Tuy nhiên để giữ vững vị trí số nay, sản lượng hồ tiêu khó tăng nhanh nh ững năm tới, suất thấp, chi phí cho hóa chất ph òng trừ bệnh hại hồ tiêu cao, làm hạn chế khả tăng suất diện tích gieo trồng Muốn tăng suất hồ ti số lượng chất lượng, vấn đề đặt tạo giống hồ tiêu bệnh có khả kháng virus, nấm… (2,7,10,11) Để tạo giống (dòng) mới, bệnh, số ph ương pháp tiếp cận khác tái sinh nuôi cấy phôi soma (4,8,9), đỉnh sinh tr ưởng, mô sẹo từ rễ, cuống lá, đốt mẫu mô (1,5,12) bước đầu chuyển nạp gen v hồ tiêu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (14) nghiên cứu Do đó, mục đích nghiên cứu nhằm tìm giống hồ tiêu cao sản có khả tái sinh cao, hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro hồ tiêu phục vụ cho nghiên cứu chuyển nạp gen vào hồ tiêu tương lai VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Giống Các giống hồ tiêu dùng nghiên cứu : Phú Quốc, Vĩnh Linh: Hạt hồ ti khử trùng dùng làm nguyên li ệu in vitro để tạo mô sẹo, chồi, lấy mẫu lá, thân, cuống cho nghiên cứu Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CƠNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 403 Mơi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy in vitro MS (6) Môi trường tạo mô sẹo từ hạt, rễ SH: (0,1-2 mg/l) 2,4-D + 0,1mg/l Kinetin Môi trường tái sinh chồi từ mẫu mô lá: MS + 1,5mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 0,1mg/l IBA + 10% nước dừa Môi trường tái sinh chồi từ đốt thân, cuống lá: MS + 2mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA + 10% nước dừa Môi trường giữ giống in vitro hồ tiêu: ½ MS + 0,1mg/l IBA + 10% nước dừa + 0,1 % than hoạt tính Điều kiện ni cấy Nhiệt độ từ 25-26oC Giai đoạn cho nẩy mầm từ hạt, giai đoạn tạo mô sẹo, nuôi cấy tối nhiệt độ 25 oC Cây tái sinh trực tiếp từ mẫu mô thân thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày Phương pháp Hạt hồ tiêu thu hoạch v ườn trồng hồ tiêu Phú Quốc, Đắk Lắk Rửa khử trùng cồn 70 o cho phút, sau ngâm dung d ịch HgCl (0,1%), rửa với nước vơ trùng lần, ngâm hạt v dung dịch cefotaxime 0,1% nước javels 40%, thời gian khử tr ùng khác từ 30-60 phút Hạt vô trùng đặt môi trường MS cho hạt nẩy mầm, môi tr ường SH có bổ sung 2,4-D với nồng độ khác để tạo mô sẹo, Hạt nẩy mầm chuyển sang môi tr ường ½ MS để tạo Mơ sẹo h ình thành, chuyển sang mơi trường để nhân sinh khối mô sẹo Lá sinh trưởng tốt hình 2, cắt rừng mảnh khoảng cm đặt môi trường tái sinh (môi trường số 3), để tạo chồi Cắt đốt vô trùng, sau chẻ dọc làm đơi, cuống lá, đặt lên môi trường 4, để tạo mô sẹo chồi Các chồi sau cấy mơi trường số để tạo rễ giữ giống in vitro Ảnh hưởng hygromycin lên tái sinh chồi hồ tiêu từ mô KẾT QUẢ, THẢO LUẬN Tạo giống vô trùng in vitro Hồ tiêu loại mang nhiều mầm bệnh nội sinh (7,11), điều quan trọng loại bỏ mầm bệnh nội sinh hồ ti nấm, virus, vi khuẩn nằm bên mô cây, h ạt Các phương pháp thông thư ờng khử trùng dùng cồn nước javel, không loại trừ mầm bệnh Các mẫu qua xử lý tr ên Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 404 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn cho thấy: sử dụng chất có khả diệt khuẩn cao nh HgCl 0,1 % 10 phút, mẫu khử trùng hạt nhiễm cao từ 80-90% sau tháng mơi trường ni cấy Do ph ương pháp khử trùng hạt nêu thu mẫu vô trùng thấp hạt không nẩy mầm, sau thời gian d ài (30 ngày) gieo mơi trư ờng MS khơng chất kích thích sinh tr ưởng Để nhận mẫu vô trùng, sử dụng phương pháp: Lột vỏ hạt tiêu, rửa sạch, ngâm vào dung dịch HgCl 0,1 % từ -10 phút, sau ngâm hạt dung dịch cefotaxin 1% Bằng cách thu nhận mẫu vô trùng từ 8090% Tỉ lệ nẩy mầm cao khoảng 57% so với hạt tiêu không lột vỏ Xây dựng hệ thống tái sinh qua nuôi cấy mô sẹo từ hạt Tạo mô sẹo từ hạt: Các hạt ti vô trùng đặt môi trường SH, có bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D có nồng độ từ 0,1 đến 2mg/l kinetin 0,1mg/l Sau thời gian nuôi cấy, quan sát thấy mơ sẹo h ình thành vị trí mơ nỗn (seed-bud), sau khoảng tuần khoảng 49% tạo mô sẹo, theo l tác động 2,4-D lên hình thành mơ sẹo (4) Qua ni cấy mơ sẹo từ hạt, chúng tơi nhận mô sẹo từ rễ Rễ hồ ti cắt đặt mơi trường SH có bổ sung 0,5mg/l 2,4-D tạo mô sẹo đạt 95% Mô sẹo cấy truyền nhân lên sang môi trường Do hiệu suất hình thành mơ sẹo sinh phơi tốc độ nhân mô phôi môi trường agar không cao Chúng quan tâm đ ến vấn đề sử dụng loại mô n ày để nghiên cứu chuyển gen, nên tiếp tục nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô phôi cách nuôi tr ên mơi trường lỏng, lắc nhẹ khoảng 80 v òng/phút để tăng hiệu sinh phôi mô nuôi cấy Xây dựng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ đốt, lóng hồ ti Chồi in vitro hồ ti cao khoảng 6-7cm cắt thành đốt lóng khoảng 1,5cm Mỗi đốt mang chồi ngủ, đ ược cất mơi trường MS có bổ sung 2mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA + 10 % nước dừa Trên môi trường này, sau 3-5 tuần nuôi cấy, quan sát thấy xuất chồi mới, số chồi h ình thành từ 4- chồi cho đốt già 3-4 chồi tạo từ lóng (hình 4) Nghiên cứu tạo chồi từ đốt cây, cho th khác biệt số lượng chồi tạo Đốt gốc đốt có khả tạo chồi nhiều h ơn đốt Nhằm làm tăng khả tạo chồi từ đốt, chẻ dọc đốt l àm đôi, hy vọng tạo thêm số chồi từ vết cắt Xây dựng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu mô Các mảnh (từ phát triển đầy đủ), sinh tr ưởng tốt môi trường ½ MS, có bổ sung thêm 0,1mg/l IBA 10% nư ớc dừa Mẫu đặt môi trường MS có BAP 1,5mg/l + 0,1mg/l IBA + 0,1 mg/l Kinetin 10% nư ớc dừa Sau tuần ni cấy, mơ sẹo hình thành từ vết cắt, cấy truyền mô sẹo n ày sang môi trường có thành phần Chồi thu nhận sau tháng nuôi cấy Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 405 Ở nước ta giới, nghiên cứu tái sinh trực tiếp từ mẫu mô đ ã thực hiện, chưa nhiều qua nghiên cứu tạo chồi trực tiếp từ mẫu mô để d ùng cho phương pháp bắn gen gna với gen chọn lọc hygromycin, b ước đầu chúng tơi nhận số dòng mơ chống chịu hygromycin nồng độ 10mg/l Nghi ên cứu chuyển gen gna vào hồ tiêu phương pháp bắn gen thực A B C D Hình Tạo cây hồ tiêu in vitro: A: Hạt nẩy mầm; B: Cây in vitro; C: Mô sẹo tạo từ hạt; D: Chồi tái sinh từ cuống Hình Ảnh hưởng hygromycin lên sinh trưởng hồ tiêu: A: Đối chứng, B: hygromycin 15mg/l Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 406 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Bhat SH, Chandel KPS, and Malik SK, 1995 Pl ant regeneration from various explants of cultivated species Plant Cell Reports 14: 398 -402 De Silva DPP, Jones P, and Shaw MW, 2002 Identification and transmission of Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper ( Piper nigrum) in Sri Lanka Plant Pathology 51: 537 -545 Jagella T, and Grosch W, 1999 Flavour and off -f;avour compounds of black and white pepper (Piper nigrum L.) II Odour activity values of desirable and undesirable odorants of black pepper Eur Food Res Tec hnol 209:22-26 Joseph B, Joseph D, and Philip VJ, 1996 Plant regeneration from somatic embryos in black pepper Plant Cell, Tissue and Orgen Culture 47: 87 -90 Kelkar SM, Krishnamurthy KV, 1998 Adventitious shoot regeneration from root, internode, petiole and leaf explants of Piper colubrinum Link Plant Cell Reports 17: 721-725 Murashige T, Skoog F, 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 473 -497 Lockhart BEL, Kiratiya - Angul K, Jones P, Eng L, De Silva P, Olszewski NE, et al., 1997 Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug -transmitted badnavirus infecting Piper ssp In Southeast Asia European Juornal of Plant Pathology 103:303-311 Nair RR, Gupta SD, 2006 High -frequency plant regeneration through cyclic secondary somatic embryogenesis in black pepper ( Piper nigrum L.) Plant Cell Reports 24: 699-707 Nair RR, Dutta Gupta S, 2003 Somatic embryogenesis and plant regeneration in black pepper (Piper nigrum L.): I direct somatic embryogenesis from tissue of germinating seeds and ontogeny of somatic embryos J Hort Sci Biotechnol.: 416-421 10 Nguyễn Tiến Thắng, Boico AL, 2001 Virus v bệnh virus hồ tiêu Việt Nam Hội nghị Quốc tế lần 3, Kiev, Ucraina 11 Qaher A, Mandeel, 2005 Fungal contamination of some imported spices Mycopathologia 159:291-298 12 Sarma YR, Kalloo G, 2004 Status of current research towards increased production and productivity in black pepper in India Focus on Pepper 1:69 -86 13 Schenk RU, Hildebrandt AC, 1972 Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures Can J Bot 50: 199-204 14 Sim SL, Jafar R, Power JB, Davey MR, 2004 Development of an Agrobacterium mediated transformation system for black pepper (Piper nigrum L.) ISHS Acta Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 407 Horticulturae 461 International Symposium on Biotechnology of Tropical and subtropical Species part SUMMARY Establishment of in vitro plant regeneration system of black pepper (Piper nigrum L.) for gene transfer Nguyen Thi Thanh, Vo Phan Mi Sa, Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho Institute of Tropical Biology The economic importance of black pepper ( Piper nigrum L.) has lead to its selection and breeding over thousands of year in the world For successful gene t ransfer in black pepper, efficient shoot regeneration systems are required Regeneration frequencies in black pepper are often low and genotype dependent Black pepper leaf is ideal explant source for biolistic transformation, but is not optimal for plant regeneration For this reason, A high -frequency shoot regeneration protocol was developed for two commercial cultivars of black pepper (Phu Quoc and Vinh Linh) and a range of culture media were tested for development of a highly -efficient regeneration system from leaf, petiole, root explants and callus which was derived from micropylar tissues of germinating seeds on SH media in the absence of light at 25 oC Both cultivars Phu Quoc and Vinh Linh were response for shoot regeneration using either one -step (for petiole, internode and leaf explants) or two -step regeneration protocols (for callus) These genotypes were chosen for further studies Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 408 CHUYỂN NẠP GEN Ở CÂY DÂU TÂY ( Fragaria vesca L.) NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens KẾT HỢP XỬ LÝ SÓNG SIÊU ÂM Mai Trường, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ Phòng Cơng nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Cây dâu tây người Pháp du nhập vào Việt Nam đầu năm 1930, c ó tên khoa học Fragaria vesca L., kết lai giống ( Fragaria chiloensis Duch Fragaria virginiana Duch) thuộc nhóm hai mầm, họ Rosacea Trong phần thịt dâu tây có chứa nhiều sinh tố thiết yếu cho ng ười A, B1, B2 đặc biệt sinh tố C Do đó, dòng dâu tây mang tính thương mại cao chọn triển khai canh tác đại trà Lâm Đồng dòng Mỹ Đá, Mỹ Hương (nhập Công ty nghiên cứu giống), dòng HO Nhật Bản (Phân Viện Sinh học Đà Lạt)…[1] Hiện nay, với phát triển vượt bậc ngành Công nghệ gen thực vật, cho phép đưa số gen mã hóa cho tính trạng có ích theo nhóm sau: kháng bệnh hại (sâu, rầy, trùng chích hút), chống chịu ngoại cảnh bất lợi (hạn, mặn, kháng thuốc trừ cỏ), y d ược (tăng cường vitamin A, vắc-xin ăn được)… thông qua số kỹ thuật biến nạp gen bắn gen (biolistic), vi khuẩn Agrobacterium, xung điện (electroporation) Riêng đối tượng ăn quả, nhiều cơng trình cơng bố quốc tế cho thấy dâu tây tỏ có ưu việc ứng dụng công nghệ gen để tạo giống mang đặc tính di truyền Đồng thời dâu tây có khả nhân giống nhanh trồng đại trà tạo điều kiện cho việc thử nghiệm đánh giá số tính trạng [4][5][6][9][10][11][12][13] Trong phạm vi báo này, chúng tơi trình bày số kết việc x ây dựng phương pháp chuyển nạp gen dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm, thơng qua hệ thống ni cấy tái sinh từ đĩa dâu tây [2][3][7][8] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu  Giống dâu Mỹ Đá Phân viện Sinh học Đ Lạt cung cấp Mảnh dâu tây từ nhân giống in vitro cắt theo dạng đĩa với kích th ước (1x1) cm, dùng làm nguyên liệu để chuyển nạp gen  Mơi trường ni cấy: khống đa lượng, vi lượng (Murashige Skoog, 1962), vitamin B5 (Gamborg, 196 8), đường 30g/l, pH 5,8  Chất điều hòa sinh trưởng: TDZ (Thidiazuron), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT  409 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid pCAMBIA 2301, mang gen nptII mã hóa enzyme neomycine phosphotransferase, gen ch ỉ thị gusA Nuôi lắc vi khuẩn qua đêm môi trường AB (Chilton, 1974), chứa kh sinh chọn lọc kanamycin nồng độ 50mg/l Phương pháp nghiên cứu a Phương pháp chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm         Thí nghiệm 1: đĩa (1x1) cm ngâm chung với vi khuẩn 20 phút Thí nghiệm 2: đĩa (1x1) cm xử lý sóng siêu âm giây thiết bị siêu âm Transsonic 660 từ hãng Elma, sau ngâm chung với vi khuẩn 20 phút Mẫu từ thí nghiệm nuôi cấy chung với vi khuẩn ng ày mơi trường tái sinh chồi có bổ sung tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ 1,5mg/l, 2,4-D 0,2 mg/l (viết tắt MSDT) Đĩa rửa nhiều lần n ước cất vô trùng, chuyển sang mơi trường tái sinh chồi trên, có bổ sung kháng sinh diệt khuẩ n Cefotaxime 500mg/l kh sinh chọn lọc mô chuyển gen kanamycin 20mg/l Cấy truyền sang môi trường tuần/lần Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 oC + Thời gian chiếu sáng 12g/ngày Cường độ chiếu sáng 3.000 lux Mỗi công thức thí nghiệm gồm 50 mẫu lá, lặp lại thí nghiệm lần b Phương pháp phân tích diện gen chuyển nạp  Hóa mơ: kiểm tra gen thị gusA cách ngâm chồi dung dịch X Gluc Ủ qua đêm 370C  PCR (Polymerase Chain Reaction): t ách chiết DNA nhiễm sắc thể từ mô theo phương pháp Dellaporta (1983) v sử dụng cặp mồi (primer) đặc hiệu cho gen kháng kháng sinh kanamycin (nptII): * Primer (f): ’ ACA CGC TGA AAT CAC CAG TCT C ’ * Primer (r): ’ CTC GTC CTG CAG TTC ATT C ’ * Chương trình nhiệt độ cho PCR: * Khởi đầu: 940C / phút - Tách sợi DNA : - Gắn mồi: - Tổng hợp DNA: * Kết thúc: 35 chu kỳ 940C / phút 550C / phút 720C / phút 720C / phút Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 410 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN     Các đĩa đối chứng (không xử lý với sóng si âm vi khuẩn) mơi trường bị ức chế mạnh kháng sinh kanamycin nồng độ 20mg/l, nên phát sinh hình thái chồi khơng diễn Đa phần mơ sẹo h ình thành vết cắt, hóa nâu chết sau 45 ngày nuôi cấy Tác động kháng sinh kanamycin nồng độ 20mg/l lên khả tái sinh chồi mẫu xử lý chuyển gen mẫu xử lý sóng siêu âm trước chuyển gen mơi trường bổ sung tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ, 2,4-D sau 45 ngày: Mẫu xử lý chuyển gen môi trường MSDT cho thấy tăng sinh mơ sẹo r õ rệt cuống lá, rìa xung quanh vết cắt đĩa lá, dần hóa nâu chết Chỉ thu nhận mẫu tái sinh chồi phát triển môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Mẫu xử lý sóng siêu âm trước chuyển gen sau mơi trường MSDT, phát sinh hình thái chồi xuất vị trí cuống lá, rìa Sơ khởi thu nhận mẫu tái sinh chồi môi trường chọn lọc sau 45 ngày Bảng 1: Tần số tái sinh chồi thí nghiệm v mơi trường chọn lọc chứa kanamycin nồng độ 20 mg/l sau 45 ng ày Mơi trường ni cấy MSDT (có kanamycin 20 mg/l) Số mẫu thí nghiệm Số mẫu Tỉ lệ tái sinh chồi (%) tái sinh chồi Thí nghiệm 150 0,66 Thí nghiệm 150 1,33 Hình 1: Mẫu ni cấy mơi trường MSDT+ kanamycin 20 mg/l sau 45 ng ày A B C D Mẫu đối chứng Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi vị trí cuống Mẫu xử lý sóng siêu âm+chuyển gen tái sinh chồi vị trí r ìa Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi vị trí cuống Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 411 - Kết phân tích mẫu chuyển gen có xử lý trước sóng siêu âm: Hình Sự biểu tạm thời gen gusA thơng qua phương pháp hóa mơ Hình Kết PCR gen kháng kanamycin (nptII) TC: Thang chuẩn DNA (1kb) 0: Plasmid pCAMBIA 2301 1: M ẫu không chuyển gen 2,3: Mẫu chuyển gen KẾT LUẬN  Đã thu nhận số chồi in vitro kháng kanamycin độ 20mg/l môi trường tái sinh bổ sung TDZ ,5mg/l, 2-4D 0,2mg/l, thông qua phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium kết hợp xử lý sóng siêu âm  Kết hóa mơ cho thấy diện gen gusA  Gen npt II mã hóa cho enzyme neomycine phosphotransfer ase, tạo tính kháng kanamycin kiểm tra kỹ thuật PCR TÀI LIỆU THAM KHẢO Thông tin Khoa học Công nghệ Lâm Đồng, số (2002) Nguyễn Văn Uyển (1995) Những ph ương pháp công nghệ sinh học thực vật, tập & NXB Nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Murashige T., Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures Plant Physiol 15: 473-497 Jame, D J et al (1990) Agrobacterium-mediated transformation of the cultivated strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) using disarmed binary vector Plant Science 69: 79-94 Nehra, M S et al (1990a) Agrobacterium-mediated transformation of strawberry calli and recovery of tran sgenic plants Plant Cell Reports 9:10-13 Nehra, M S et al (1990b) Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using leaf disk regeneration system Plant Cell Reports 9: 293-298 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn 412 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn Graham, J et al (1995) Agrobacterium-mediated transformation of soft fruit Rubus, Ribes and Fragaria Methods in Molecular Biology , Humana Press, Totowa, N J 44: 129-133 Trick, H N and Finer, J J (1997) SAAT: Sonication Assisted Agrobacteriummediated Transformation Transgenic Research 6:329-336 Liu, Z R and Sanford, J C (1998) Plant regeneration by organogenesis from strawberry leaf and runner tissue HortScience 23:1057-1059 10 Haymes, K M and Davis, T M (1998) Agrobacterium-mediated transformation Fragaria vesca, and transmission of transgenes to R progeny Plant Cell Reports 17: 279-283 11 Barcelo, M et al (1998) Regeneration and transformation via Agrobacterium tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler Plant Cell, Tissue and Organ Culture 54: 29-36, 1998 12 Yan Zhao, Qingzhong and Davis, R E (2004) Transgene expression in strawberries driven by a heterologous phloem -specific promoter Plant Cell Reports 23:224-230 13 Nhut, D T et al (2005) Callus formation, shoot proliferati on and rooting by liquid culture: A novel efficient method for rapid propagation of strawberry (Fragaria vesca L.) Proceedings of Vietnam -Korea International symposium 2005 on Biotechnology and Biosystem Engineering , 96-100, HCMC Uni of Agriculture and Forestry SUMMARY Leaf disk transformation system of strawberry ( Fragaria vesca L.) using the sonication assisted Agrobacterium method Mai Truong, Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho Institute of Tropical Biology Leaf disk regeneration system of strawberry ( Fragaria vesca L.) was carried out using modified Murashige and Skoog medium ( 1962) with TDZ 1,5 mg.l -1 and 2,4-D 0,2 mg.l-1 Transformation works were performed via Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pCAMBIA 2301 with gusA and npt II genes Leaf explants were pretreated with sonication in seconds by Transsonic 660 unit and a days of Agrobacterium co-cultivation After a 45-day culture under the pressure of kanamycin 20 mg.l -1 as a selective agent, shoot regeneration was recovered on the med ium with TDZ 1,5 mg.l-1, 2,4-D 0,2 mg.l-1 The transformation frequency is low with percentage of 1.33 Histochemical GUS assay and PCR analysis showed the presense of gusA and npt II genes in putative transformants Tai lieu chia se tai: wWw.Sinhhoc.edu.vn ... việc cải tiến kỹ thuật chuyển gen Bt phải cải tiến gen thích hợp cho gen Bt, gen vi khuẩn biểu có hiệu thực vật Phương pháp có hiệu để tạo chuyển gen sử dụng súng bắn gen; nhiên, sở nghiên cứu chưa... wWw.Sinhhoc.edu.vn Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 351 TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀ CÔN TRÙNG Phạm Thị Hạnh, Phan T ường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ Phòng Cơng nghệ gen thực vật, Viện Sinh học... Đức, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Hữu Tâm Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Thời gian gần đây, công nghệ sinh học đặc biệt l cơng nghệ gen có bước tiến vượt bậc, qua nhà khoa