polyphenol và hoạt độ ức chế 1 số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang và 1 số cây thuốc khác

polyphenol và hoạt độ ức chế 1 số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang và 1 số cây thuốc khác

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Đại học quốc gia hà nội Trờng đại học khoa học tự nhiªn - Nguyễn Minh Thắng Polyphenol hoạt độ ức chế số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan L.) số thuốc khác Luận văn thạc sĩ khoa học Hà Nội Năm 2009 Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009 Đại học quốc gia hà nội Trờng đại häc khoa häc tù nhiªn - NguyÔn Minh Thắng Polyphenol hoạt độ ức chế số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan L.) số thuốc khác Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mà số: 60 42 30 Luận văn thạc sĩ khoa học Ngời hớng dẫn GS TSKH Phạm Thị Trân Châu Hà Nội - 2009 Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009 Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, trớc tiên, muốn bày tỏ lỏng biết ơn sâu sắc tới GS TSKH Phạm Thị Trân Châu, Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đà định hớng nghiên cứu, trực tiếp hớng dẫn bảo tận tình cho suốt thời gian nghiên cứu Tôi mong muốn đợc gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lÃnh đạo cán Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đà tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị sở vật chất giúp hoàn thành nghiên cứu Qua đây, muốn đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý thực vật Hoá sinh đà giúp đỡ trang bị kiến thức hữu ích cho suốt thời gian học tập trờng Tôi xin đợc cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Sinh học, Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Đề tài luận văn đợc thực với hỗ trợ kinh phí từ đề tài NCCB 621306 Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngời đà cổ vũ, động viên vợt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Học viên Nguyễn Minh Thắng Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ChIA DC E EDTA EtOH Hoạt độ ức chế chymotrypsin Dịch chiết Enzyme Ethylenediaminetetraacetate Ethanol Nguyễn Minh Thắng IU PA PIA PMSF PPI PsA PsIA SDS StA TCA TEAF TEMED TI TIA UV Vis Luận văn cao học khoá 2007-2009 Đơn vị ức chế Hoạt độ thuỷ phân protein Hoạt độ ức chế proteinase Phenylmethylsulphonyl fluoride Các chất kìm hÃm proteinase có chất protein Hoạt độ phân giải proteinase Pseudomonase aeruginosa Hoạt độ ức chế PsA Sodium dodecyl sulphate Hoạt độ phân giải protein Staphylococcus aureus Acid trichloroacetic Toluene: Ethyl acetate: Acetone: acid Formic Tetramethyl ethylene diamine Chất ức chế trypsin Hoạt độ ức chế trypsin ánh sáng tử ngoại ánh sáng nhìn thấy Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009 Mục lục Mở đầu .1 Ch¬ng Tỉng quan tµi liƯu 1.1 Các hợp chất thực vật thø sinh 1.1.1 Các hợp chất phenol 1.1.2 Flavonoid 1.1.3 Tannin 1.2 Proteinase chất ức chế proteinase .10 1.2.1 Sơ lợc proteinase 11 1.2.2 Proteinase serine 12 1.2.2.1 Proteinase serine .12 1.2.2.2 Protease cña Pseudomonas aeruginosa 13 1.4.2.3 C¸c chÊt øc chÕ proteinase 15 1.3 Tơng tác cđa flavonoid víi c¸c protein enzyme 16 1.3.1 Các lực tơng tác phân tử phức chất protein-flavonoid .17 1.3.2 Tính đặc hiệu tơng tác protein-flavonoid .18 1.5.3 ảnh hởng flavonoid với thuỷ phân protein 19 1.4 Cây thuốc việt nam khả chữa bệnh viêm nhiễm mụn nhọt, mẩn ngøa 20 1.4.1 Sơ lợc bệnh viêm nhiƠm mơn nhät, mÈn ngøa 20 1.4.2 Cây gỗ Vang (Tô mộc) 21 1.4.2.1 Đặc điểm phân loại, phân bố, thành phần hóa học công dụng .21 1.4.2.2 Các nghiên cứu giới 22 1.4.2.3 C¸c nghiên cứu Việt Nam 23 Chơng NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 25 2.1 Nguyên liệu 25 2.2 Dơng vµ hãa chÊt thÝ nghiÖm 25 2.3 Phơng pháp nghiên cứu .25 2.3.1 Sö lý mÉu 25 2.3.2 Tách chiết flavonoid toàn phần 26 2.3.3 Định lợng polyphenol theo phơng pháp Folin-Ciocalteau 26 2.3.4 Sắc ký phân chia thành phần polyphenol .27 2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase 29 2.3.6 Điện di proteinase gel polyacrylamide 32 2.3.7 S¾c ký cét silicagel 33 2.3.8 Quang phỉ hÊp thơ tư ngo¹i 33 Ch¬ng Kết nghiên cứu thảo luận 34 3.1 Hàm lợng polyphenol tổng số hoạt tính ức chế proteinase số thuèc 34 3.1.1 Điều tra sơ PIA mẫu nghiên cứu 34 3.1.2 Hµm lợng polyphenol tổng số flavonoid dịch chiết ethanol 38 3.1.3 Hoạt độ ức chế proteinase dịch chiết polyphenol tổng số flavonoid 40 3.2 Định tính thành phần polyphenol flavonoid số thuèc 43 3.2.1 Sắc ký dịch chiết flavonoid mẫu nghiên cứu 43 3.2.2 Sắc ký thành phần polyphenol mẫu Tô mộc mỏng 44 3.3 Thăm dò PIA băng polyphenol sau sắc ký mỏng 45 Ngun Minh Th¾ng Luận văn cao học khoá 2007-2009 3.3.1 PIA băng flavonoid mẫu Đại hoàng 46 3.3.2 PIA băng flavonoid mẫu Tô méc 47 3.4 Hµm lợng tannin mẫu Tô mộc .49 3.5 Thăm dò PIA phơng pháp ®iƯn di Proteinase trªn gel polyacrylamide 49 3.5.1 Hoạt độ phân giải proteinase P aeruginosa S aureus .49 3.5.2 Nghiên cứu PIA phơng pháp điện di 51 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn mẫu Tô mộc 52 3.7 Phân chia thành phần flavonoid mẫu gỗ tô mộc cột silicagel 53 KÕt luËn .57 Tài Liệu Tham Khảo .60 NguyÔn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009 Mở đầu Các enzyme thủy phân protein có vai trò vô quan trọng toàn sinh giới, số chuỗi polypeptide có hoạt tính thuỷ phân protein đà biết lên 140.000 [50] Tuy nhiên enzyme có liên quan đến nhiều bệnh ngời nh bệnh viêm nhiễm, ung th, tim mạch Theo thống kê, có tới 80 bệnh di truyền khác ngời có nguyên nhân đột biến gene mà hóa protease [72], di ung th cịng cã sù tham gia cđa c¸c protease [51] Các enzyme thuỷ phân tham gia tích cực trình viêm hình thành mụn nhọt ngời Khả phân giải protein proteinase lớn nên cần có chế điều hòa chặt chẽ, trải qua trình tiến hóa lâu dài đà xuất nhiều chế kiểm soát proteinase bao gồm điều hòa biểu hiện, trình tiết tế bào, hoạt hóa, phân hủy proteinase kìm hÃm hoạt độ thủy phân protein chúng Nói đến chất kìm hÃm proteinase, nhà khoa học thờng đề cập đến PPI chất ức chế proteinase có chất protein, có cấu trúc đặc trng Các PPI cã mỈt réng r·i sinh giíi tõ virus, vi khuẩn động vật [49] Thực vật tạo PPI bị côn trùng công, bị tổn thơng hay dới điều kiện stress [19, 49] Tuy nhiên thực vật có chế khác chống lại tác nhân gây hại hệ thống chất trao đổi thứ sinh, có hợp chất phenol Các phenol có hoạt tính kháng sinh mạnh mà có khả ức chế nhiều loại enzyme Các chất thực vật thứ sinh có hoạt tính sinh học thành phần có mặt vị thuốc cổ truyền Nhằm tìm hiểu mối liên hệ hợp chất phenol từ thực vật khả ức chế proteinase số thuốc chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, tiến hành nghiên cứu đề tài: Polyphenol hoạt độ ức chế serine-proteinase từ thân, hạt gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) số thuốc khác Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009 Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh Các đờng biến đổi tổng hợp c¸c chÊt dinh dìng chđ u: carbohydrate, protein, chÊt bÐo vµ acid nucleic lµ thiÕt yÕu vµ gièng ë sinh vật ngoại trừ số thay đổi nhỏ Quá trình thống nhất, tảng sinh vật sống đợc gọi trình trao đổi sơ cấp Trên thực tế thực vật tổng hợp lợng lớn hợp chất hữu vai trò trực tiếp sinh trởng phát triển chúng, hợp chất đợc gọi hợp chất thứ sinh Các hợp chất thứ sinh đợc phát riêng lẻ nhóm, loài định, chí khác cá thể, hàm lợng thay đổi loài, quan, phận điều kiện sinh thái Chức lợi ích hợp chất thực vật phần lớn đà đợc nh: tham gia bảo vệ cây, điều hòa sinh trởng, hấp dẫn côn trùng, thụ phấn, phát tán hạt nhiên có nhiều chức khác cha đợc biết đến [60] Quá trình trao đổi thứ cấp cung cấp phần lớn sản phẩm có giá trị y dợc hợp chất thứ sinh thờng có hoạt tính sinh học nh: kích thích ức chế sinh trởng, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kìm h·m sù ph¸t triĨn cđa c¸c khèi u Tríc hợp chất thứ sinh đà bị xem chất thải đơn giản trao đổi chất thực vật, ngày với nghiên cứu ngời ta đà xác định đợc khoảng 140.000 hợp chất này, tìm đờng trao đổi chất có liên quan nh enzyme sản xuất điều hòa đờng Tuy nhiên khoảng 20 - 30% tổng số loài thực vật đợc đợc nghiên cứu hợp chất hóa sinh thùc vËt, ®ã thùc tÕ cã thĨ cã tới 200.000 hợp chất nh [62] Hợp chất thø sinh cã cã ®êng trao ®ỉi chÝnh [18]:  Acid shikimic: phenol, lignin, alkaloid  Acid mevalonic: terpen, steroid, alkaloid  Deoxyxylulose: terpen, steroid, alkaloid 1.1.1 C¸c hợp chất phenol [11, 47] Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009 Đây nhóm hợp chất lớn hợp chất thứ sinh thực vật Các nhà khoa học đà phát 8.000 hợp chất phenol tự nhiên [24] Đặc điểm cấu trúc chung nhóm phân tử có vòng thơm (vòng benzene) gắn trực tiếp với hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) Vì chúng rợu bậc bốn đợc đặc trng tính acid yếu 1.1.1.1 Phân loại Dựa vào thành phần cấu trúc phenol, ngêi ta chia chóng thµnh nhãm lµ phenol đơn giản, phenol phức tạp nhóm polyphenol Phân loại dựa khung carbon hợp chất C nhóm phenyl, C1 nhóm methyl, C2 lµ nhãm acetyl, C3 lµ nhãm thÕ cã carbon, C4 lµ nhãm thÕ cã carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6C2-C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thñy ph©n), (C6-C3)2 (lignan, neolignan), (C6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngng tơ) [23, 25, 30] Nhãm hỵp chất polyphenol nhóm đa dạng hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp liên kết trùng hợp đơn phân Ngoài gốc phenol có nhóm phụ dị vòng mạch nhánh đa vòng Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009 Hình 1.1 Một số hợp chất phenol 1.1.1.2 Tính chất hoá học Các hợp chất phenol có cấu tạo tính chất đa dạng nhng có thành phần cấu trúc chung nên chúng có sè tÝnh chÊt chung:  Ph¶n øng cđa nhãm hydroxyl Phản ứng phá vòng benzene Phản ứng tạo phức với kim loại Phản ứng este hoá 1.1.1.3 Vai trò hợp chất phenol thực vật Thực vật tổng hợp nhiều chất thứ sinh so với động vật chúng lẩn trốn đợc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học Nhìn chung vai trò bảo vệ hợp chất phenol dựa đặc tính kháng khn, kh¸ng dinh dìng cđa chóng ... 1. 1 .1 C¸c hỵp chÊt phenol 1. 1.2 Flavonoid 1. 1.3 Tannin 1. 2 Proteinase chất ức chế proteinase .10 1. 2 .1 Sơ lợc proteinase 11 1. 2.2 Proteinase. .. vật khả ức chế proteinase số thuốc chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, tiến hành nghiên cứu đề tài: Polyphenol hoạt độ ức chế serine- proteinase từ thân, hạt gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) số thuốc khác Nguyễn... - Ngun Minh Th¾ng Polyphenol hoạt độ ức chế số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan L.) số thuốc khác Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mà số: 60 42 30 Luận văn thạc