Hoạt động ức chế của polyphenol từ thân, hạt gỗ vang và một số cây thuốc khác đối với một số serine proteinase

Protease của Pseudomonas aeruginosa

Một khả năng nổi bật của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng sinh trởng mạnh trong các môi trờng khác nhau, vi khuẩn này dễ dàng xâm nhập vào cơ thể ngời có bị các bệnh suy nhợc và các bệnh thiếu hụt miễn dịch. Nghiên cứu các chủng vi khuẩn phân lập từ các bệnh nhân xơ nang (cystic fibrosis), bệnh di truyền khởi phát ở trẻ em và đợc biết dới tên gọi "sinh chất nhầy", cho thấy có những sự tái tổ hợp gene lớn bên cạnh những thành phần bảo thủ trong hệ gene Pseudomonas aeruginosa [37].

Các chất ức chế proteinase

Các PPI rất phổ biến trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng trong hạt thực vật, sự có mặt của chúng trong hạt là các tác nhân chống tiêu hoá đối với nhiều loại động vật đặc biệt là đối với côn trùng (ức chế các proteinase ở ruột giữa). Tơng tác flavonoid-protein rất quan trọng trong thực vật nh quá trình tổng hợp flavonoid, cơ chế bảo vệ qua trung gian hóa học là flavonoid, tuy nhiên phần này chủ yếu đề cập tới tơng tác flavonoid-protein ở động vật và ngời liên quan.

Tính đặc hiệu của tơng tác protein-flavonoid

Sơ lợc về các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa

Theo Đông y, điều trị các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa thờng sử dụng các vị thuốc thanh nhiệt, giải độc nh Đơn tớng quân, Cam thảo, Rau má. Trong dân gian, các loại cây thuốc có tác dụng kháng khuẩn mạnh cũng đợc sử dụng chữa các bệnh này nh Tô mộc, Sắn thuyền… [3, 9]. Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy rất nhiều các hợp chất polyphenol từ thực vật cũng khả.

Nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa khả năng ức chế proteinase và khả năng chữa trị các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa, chúng tôi đã thu thập và chọn lọc các mẫu nghiên cứu là những cây thuốc nam thờng dùng chữa các bệnh này đợc ghi trong nhiều tài liệu [3, 9].

Cây gỗ Vang (Tô mộc)

Các công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy hợp chất brazilin và brazilein có trong Tô mộc có tác dụng kháng histamin, tác dụng làm mạnh và kéo dài tác dụng của hormone tuyến thợng thận, ức chế histidine carboxyl- lyase, và nhiều tác dụng sinh lý khác [9]. Gần đây các nghiên cứu đã tập trung vào các hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa, khả năng ức chế tế bào ung th, chức năng bảo vệ…. Các nhà nghiên cứu Trung Quốc cho thấy dịch chiết ethanol từ gỗ Vang có thể có tác dụng ức chế miễn dịch, ức chế tế bào lympho T, brazilein cảm ức apoptosis các lympho lách chuột [63].

Năm 2008, nhóm các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã thực hiện các thí nghiệm về khả năng chống oxy hóa, quét dọn các gốc tự do của dịch chiết cồn và các chất chiết xuất từ gỗ Vang nh protosappanin A, protosappanin B và. Năm 2004, nghiên cứu tại Hàn Quốc cho thấy dịch chiết n-butanol, methanol, nớc, chloroform gỗ Vang có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều chủng Staphylococcus aureus kháng kháng sinh [33]. Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết nớc và dịch chiết cồn cây gỗ Vang cũng nh một số loài thực vật khác trong họ Caesalpiniaceae đều có khả năng ức chế HIV-1 protease.

Việt Nam cho thấy dịch chiết gỗ Vang có khả năng ức chế mạnh xanthine oxidase là một enzyme có liên quan đến hình thành bệnh gout trong đó sappanchalcone có khả năng ức chế mạnh nhất. Nhìn chung, những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các thành phần hóa học trong Tô mộc đã đợc tiến hành rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên những nghiên cứu về khả năng ức chế proteinase (PIA) vẫn còn rất sơ lợc. Polyphenol là các hợp chất có khối lợng phân tử thấp hơn protein và có nhiều hoạt tính sinh học, chúng có thể tơng tác với các protein nói chung và các proteinase nói riêng, vì vậy công trình này chủ yếu nhằm làm sáng tỏ khả năng ức chế một số proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa và Stalphylococcus aureus) của polyphenol và flavonoid trong các bộ phận cây gỗ Vang.

Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm .1 Dông cô

Mẫu khô: cây thuốc đợc thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, xử lý nhiệt 110oC trong 10 phút để bất hoạt enzyme, sấy đến khô trong tủ sấy ở 60oC, ngâm trong ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, thu phần dịch chiết, lại thêm ethanol, quá trình ngâm chiết lặp lại 3 lần, trộn dịch chiết của 3 lần, cô. Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đờng chuẩn) rồi làm thí nghiệm nh trên, hàm lợng polyphenol đợc tính toán dựa theo đờng chuẩn acid gallic trên. Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân chia của hai pha: một pha tĩnh (có thể là silicagel, aluminum oxide, cellulose, Kieselguhr ..), đợc trải trên bản kính, thủy tinh hay nhựa, một pha động là hệ dung môi khai triển đựng trong bình có nắp kín, bản mỏng có lớp hấp phụ đợc nhúng và lớp dung môi, dung môi di chuyển lên trên làm chuyển dịch hỗn hợp mẫu từ vị trí chấm lên trên bản mỏng.

Chúng tôi tiến hành xác định hàm lợng polyphenol của 13 mẫu này và nhận thấy các mẫu có hàm lợng polyphenol cao thờng có PIA cao nh: các mẫu Trâm bầu, Sắn thuyền, tuy nhiên cũng có mẫu có hàm lợng polyphenol thấp nhng cũng có PIA cao nh vỏ hạt Tô mộc chín (bảng 3.3). Cũng giống nh dịch chiết nớc, khả năng ức chế các proteinase của polyphenol tổng số giảm dần theo thứ tự chymotrypsin, trypsin, PsA, trong đó dịch chiết polyphenol tổng số mẫu vỏ hạt Tô mộc chín ức chế mạnh nhất cả ba loại enzyme, cũng là mẫu có hàm lợng polyphenol thuộc nhóm cao trong các mẫu nghiên cứu. Khi so sánh hoạt độ riêng tính theo polyphenol tổng số (mIU/mg polyphenol) và độ riêng tính theo protein (mIU/ mg protein) theo công trình nghiên cứu trên của các mẫu này chúng tôi nhận thấy hoạt độ riêng tính theo polyphenol tổng số lớn hơn nhiều, có thể thấy kết quả này đã chứng minh cho nhận định trên.

Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy các bộ phận mẫu Tô mộc có sự khác nhau rất lớn về PIA, hàm lợng polyphenol tổng số và flavonoid, hình 3.4 cũng cho thấy các thành phần polyphenol rất khác nhau, vì vậy đã tập trung nghiên cứu các mẫu này. (nhuộm hơi Amoniac bão hoà) 1. DC EtOH gỗ Vang 3. Cặn không tan gỗ Vang 5. Cặn không tan vỏ thân. DC EtOH vỏ hạt chín 9. Flavonoid vỏ hạt chín 10. Cặn không tan vỏ hạt chín 11. Flavonoid vỏ hạt xanh 13. Cặn không tan vỏ hạt xanh. trên sắc ký đồ), khoảng 11 băng; polyphenol hay flavonoid vỏ thân có ít nhất là 7 băng, các băng chính tơng ứng với các băng di động chậm của mẫu gỗ. Khi xác định PIA các dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid, chúng tôi nhận thấy PIA của flavonoid các mẫu đều thấp hơn dịch chiết polyphenol tổng số nhiều lần nên các chất có thể PIA nằm lại ở phần không tan của dịch chiết polyphenol tổng số nên đã tiến hành hòa tan phần cặn này trong ethanol, sắc ký bản mỏng và nhận thấy phần lớn các chất này không di chuyển trên bản sắc ký.

Sau khi sắc ký, cắt một dải bản mỏng, nhuộm để xác định vị trí các băng, từ các băng này dóng hàng để cắt riêng các băng/vùng băng, tách rửa polyphenol từ mỗi băng bằng dung dịch ethanol, ly tâm loại bỏ silicagel, thu dịch trong, cho bay hơi dung môi, hoà tan cặn trong dung dịch đệm, xác định PIA. Để tìm hiểu sơ bộ bản chất của các băng này, phần I có một băng di động trùng với quercetin là một flavonoid đợc cho là có khả năng tơng tác và ức chế trypsin [11], do vậy đã tiếp tục tái sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi chloroform : ethylacetate (5:3), kết quả chúng tôi đã tách riêng đợc băng này với độ tinh sạch khá cao kí hiệu là GV1 và GV2.