Cũng nh các nghiên cứu ngoài nớc, các nghiên cứu ở Việt nam cũng tập trung vào khả năng chống oxy hóa của gỗ Vang. Nghiên cứu của các tác giả Việt Nam cho thấy dịch chiết gỗ Vang có khả năng ức chế mạnh xanthine oxidase là một enzyme có liên quan đến hình thành bệnh gout trong đó sappanchalcone có khả năng ức chế mạnh nhất. Các tác giả cũng tìm đợc 3 hợp chất mới trong cây gỗ Vang và đặt tên là neoprotosappanin, neosappanone A và protosappanin A dimethyl acetal [45]. Các nghiên cứu khác cũng đã xác định đ- ợc nhiều hợp chất có mặt trong cây gỗ Vang tại Việt Nam [4].
Nhìn chung, những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các thành phần hóa học trong Tô mộc đã đợc tiến hành rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên những nghiên cứu về khả năng ức chế proteinase (PIA) vẫn còn rất sơ lợc. Công trình nghiên cứu gần đây đã phát hiện đợc dịch chiết từ gỗ, vỏ thân, vỏ hạt cây Tô mộc có tác dụng ức chế trypsin (TIA), chymotrypsin (ChIA), proteinase của
các chất không phải protein mà có thể là do các hợp chất có khối lợng phân tử nhỏ [6].
Polyphenol là các hợp chất có khối lợng phân tử thấp hơn protein và có nhiều hoạt tính sinh học, chúng có thể tơng tác với các protein nói chung và các proteinase nói riêng, vì vậy công trình này chủ yếu nhằm làm sáng tỏ khả năng ức chế một số proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa và Stalphylococcus aureus) của polyphenol và flavonoid trong các bộ phận cây gỗ Vang.
Mục tiêu của đề tài luận văn
1. Nghiên cứu điều tra hoạt tính ức chế proteinase, polyphenol của một số cây thuốc chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa.
2. Xác định hàm lợng polyphenol, flavonoid và hoạt độ ức chế của dịch chiết một số cây thuốc giàu các chất ức chế proteinase.
3. Định tính các thành phần flavonoid và PIA trên bản mỏng và đi sâu nghiên cứu PIA của flavonoid một số cây thuốc.
4. Nghiên cứu flavonoid các bộ phận cây Tô mộc và khả năng ức chế proteinase serine của chúng.
Chơng 2
NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Nguyên liệu
Các mẫu nghiên cứu là các bộ phận cây thuốc nam do Trung tâm Trồng và chế biến cây thuốc, Viện Dợc liệu cung cấp.
2.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 2.2.1 Dụng cụ
Máy cô quay chân không Kaki (Đức)
Bản mỏng Silicagel DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 của Merck.
Hệ thống điện di Hoefer SE 260
Máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam (Anh) Tủ ấm WTB Bunder (Đức)
Máy ổn nhiệt DT1 (Đan Mạch) Máy li tâm Sigma
Và các thiết bị thông dụng khác
2.2.2 Hóa chất
Thuốc thử Folin-Ciocalteau, trypsin, chymotrypsin, casein của hãng Sigma
Proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa và S. aureus
Các hóa chất điện di của Fluka, A.G (Thụy Sĩ) Các hóa chất khác đạt độ tinh sạch phân tích
2.3 Phơng pháp nghiên cứu
Mẫu tơi: cây thuốc đợc thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, nghiền nhỏ, chiết trong nớc, li tâm thu dịch trong.
Mẫu khô: cây thuốc đợc thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, xử lý nhiệt 110oC trong 10 phút để bất hoạt enzyme, sấy đến khô trong tủ sấy ở 60oC, ngâm trong ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, thu phần dịch chiết, lại thêm ethanol, quá trình ngâm chiết lặp lại 3 lần, trộn dịch chiết của 3 lần, cô đặc bằng máy cô quay chân không ở 50oC đến thể tích nhất định.
2.3.2 Tách chiết flavonoid toàn phần các mẫu nghiên cứu theo phơng pháp B. C. Talli [trích theo tài liệu 10] (theo sơ đồ dới) B. C. Talli [trích theo tài liệu 10] (theo sơ đồ dới)
2.3.3 Định lợng polyphenol theo phơng pháp Folin-Ciocalteau [61]
Nguyên tắc dựa vào phản ứng oxy hoá của các polyphenol với thuốc thử Folin-Ciocalteau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở bớc sóng 765 nm. Hàm lợng polyphenol đợc tính toán theo đờng chuẩn acid gallic.
a. Hóa chất:
• Thuốc thử Folin-Ciocalteau
Mẫu nghiờn cứu
Dịch chiết EtOH
DC1
Xử lý mẫu,
Ngõm chiết trong EtOH 96oC
Chỉnh pH 3-4 bằng HCl 1%
Chiết với ethyl acetate (3 lần)
DN
DC2
Pha nước Pha ethyl acetate
Flavonoid toàn phần
Cụ cạn, hoà tan vào ethanol 96%
Hình 2.1 Sơđồ tách chiết flavonoid toàn phần
Đuổi dung mụi, hũa tan vào nước
• Dung dịch Na2CO3 20%: Hòa tan 200g Na2CO3 vào 800 ml nớc cất rồi đun sôi. Sau khi dung dịch nguội, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ, lọc thu dịch trong, dẫn nớc cất tới 1000 ml. b. Đờng chuẩn acid gallic:
• Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,25, 0,5 mg/ml.
• Cho 20 àl mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 1,58 ml nớc cất, sau đó cho 100 àl thuốc thử Folin-Ciocalteau vào, trộn đều. Sau khoảng 30 giây đến 8 phút cho vào 300 àl dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng đợc giữ ở 40oC trong vòng 30 phút. So màu ở bớc sóng 765 nm.
Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đờng chuẩn) rồi làm thí nghiệm nh trên, hàm lợng polyphenol đợc tính toán dựa theo đờng chuẩn acid gallic trên.
2.3.4 Sắc ký phân chia các thành phần polyphenol, trên bản mỏng silicagel [theo tài liệu 22]
0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD765 mg/mL
Sắc ký là phơng pháp phân tích khi một pha di động triển khai trên một pha tĩnh mà từ đó một hỗn hợp các chất khác nhau đợc phân tách thành từng thành phần. Sắc ký lớp mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography), là một ph- ơng pháp đợc biết đến từ lâu, đợc E. Stahl giới thiệu vào năm 1957. Tuy nhiên hiện nay vẫn đợc sử dụng do có nhiều u điểm nh thời gian khai triển ngắn (20 đến 30 phút), đờng khai triển ngắn, khả năng phân tách cao, có thể dùng các thuốc hiện màu mạnh nh acid, kiềm mạnh, nhiệt độ cao. Chủ yếu phơng pháp này dựa trên phơng pháp sắc ký hấp phụ nhng có tính chất riêng biệt để tách một lợng nhỏ các chất. Sắc ký lớp mỏng có thể vừa là sắc ký hấp thụ vừa là sắc ký phân tách.
Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân chia của hai pha: một pha tĩnh (có thể là silicagel, aluminum oxide, cellulose, Kieselguhr ...), đợc trải trên bản kính, thủy tinh hay nhựa, một pha động là hệ dung môi khai triển đựng trong bình có nắp kín, bản mỏng có lớp hấp phụ đợc nhúng và lớp dung môi, dung môi di chuyển lên trên làm chuyển dịch hỗn hợp mẫu từ vị trí chấm lên trên bản mỏng. ở đây có mối liên quan chặt chẽ giữa chất hấp phụ, hệ dung môi triển khai và chất để phân tích.
Để phát hiện các vết dịch chuyển có thể soi dới ánh sáng tử ngoại, hiện màu bằng các thuốc thử thích hợp. Có thể cạo các vết, rửa giải, tinh chế để tiếp tục nghiên cứu.
Trong công trình này, chúng tôi sử dụng bản mỏng Silicagel 25 DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 của Merck để phân chia, xác định các thành phần polyphenol trong các cây mẫu nghiên cứu.
Các hệ dung môi triển khai sắc ký đã dùng:
TEAF (Toluene: Ethyl acetate: Acetone : acid Formic): (5:2:2:1) TEAF: (5:3:1:1)
Chloroform:methanol: (9:1)
Chloroform:ethyacetate: acid formic: (5:3:0,4) Hiện màu:
H2SO4 10%, 800C Hơi Amoniac bão hòa
2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase: dịch chiết mẫu đợc pha loãng nhiều lần để đạt nồng độ ethanol khi tiếp xúc với enzyme nhỏ hơn 5% (v/v) là nồng độ để đạt nồng độ ethanol khi tiếp xúc với enzyme nhỏ hơn 5% (v/v) là nồng độ không ảnh hởng tới hoạt tính enzyme.
Phơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch (điều tra sơ bộ PIA) với cơ chất casein 0,1% giữ ở 37oC trong 4 giờ nhuộm bằng Amido Black 10B 0,1% trong acid acetic 7%, hoạt độ enzyme tỷ lệ thuận với đờng kính và độ sáng của vòng phân giải trên đĩa thạch [70].
Phơng pháp Anson cải tiến [69]
Nguyên tắc dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein) bởi enzyme. Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein cha bị thủy phân bằng acid tricloroaxetic (TCA). Định lợng sản phẩm tạo thành sau phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteau, khả năng ức chế proteinase của mẫu nghiên cứu tỉ lệ với hiệu số giữa sản phẩm tạo thành của ống thí nghiệm không có mẫu nghiên cứu và ống nghiệm có chất nghiên cứu. Một đơn vị ức chế (IU) là lợng chất ức chế làm giảm 50% hoạt độ của 2 mg enzyme.
• Hóa chất thí nghiệm
Thuốc thử Folin-Ciocalteau
Đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M
Cơ chất casein 1% trong đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Proteinase: trypsin, chymotrypsin, Pa tách từ Pseudomonas aeruginosa
TCA 5% Na2CO3 6%
• Tiến hành thí nghiệm
ống thí nghiệm: lấy hai ống nghiệm, một ống cho vào 400 àl đệm, ống còn lại cho vào 300 àl đệm cùng với 100 àl mẫu nghiên cứu có độ pha loãng thích hợp. Sau đó cho vào mỗi ống 100 àl enzyme, trộn đều, để ở 35,50C trong 10 phút, thêm 1 ml casein 1% và giữ ở 35,50C trong 20 phút. Tiếp theo cho vào mỗi ống 2,5 ml TCA 5%, lắc đều, lọc lấy dịch trong làm phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau.
ống kiểm tra: làm tơng tự với ống thí nghiệm, nhng sau khi ủ 10 phút ở 35,50C cho ngay TCA trớc rồi để 20 phút, sau đó mới cho cơ chất casein.
Phản ứng màu: cho 250 àl dịch lọc vào 1ml Na2CO3 6%, trộn đều rồi cho tiếp vào 250 àl thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần. Sau 30 phút so màu ở bớc sóng 750 nm. Hoạt độ ức chế đợc tính nh sau: ∆EI = E - EI E = Etn - Ekt EI = EItn - EIkt I (mIU/ml) = ∆EI/E.n.x Etn : Độ hấp thụ ống thí nghiệm không có chất ức chế. Ekt : Độ hấp thụ ống kiểm tra không có chất ức chế. EItn: Độ hấp thụ ống thí nghiệm có chất ức chế. EIkt: Độ hấp thụ ống kiểm tra có chất ức chế. n: độ pha loãng mẫu nghiên cứu
x: hàm lợng enzyme (àg/ml) tơng ứng với hoạt độ E I : hoạt độ ức chế
Thí nghiệm xác định PIA đợc tiến hành với nhiều độ pha loãng mẫu nghiên cứu khác nhau đến khi tìm đợc độ pha loãng thích hợp. Độ pha loãng thích hợp là độ pha loãng mẫu nghiên cứu mà ở đó hoạt độ enzyme khi có chất kìm hãm (dung dịch mẫu nghiên cứu) bằng khoảng một nửa so với hoạt độ enzyme khi có đối chứng là nớc.
Xác định hoạt độ phân giải protein theo phơng pháp Anson cải tiến
Đơn vị hoạt độ phân giải protein là lợng enzyme mà trong 1 phút ở 35,5
0C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tơng đơng với phản ứng màu của 1 àmol tyrosine với thuốc thử Folin-Ciocalteau.
Hình 2.3 Đờng chuẩn tyrosine
Hoạt độ phân giải protein (HP/ml) của 1 ml dung dịch enzyme đợc tính theo công thức:
HP/ml = (àmol tyrosine x a x b)/t
a: Toàn bộ thể tích hỗn hợp sau phản ứng (4 ml)
b: Tính trên 1 ml enzyme xác định (nhân với 10 nếu lợng enzyme xác định là 100 àl)
t: Thời gian ủ enzyme với cơ chất (20 phút) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 OD 750 μmol/ml
2.3.6 Điện di PA trên gel polyacryamide theo phơng pháp của Heussen và Dowdle [26]
Các bớc thực hiện kỹ thuật điện di phát hiện proteinase trên gel polyacrylamide có SDS nh sau:
* Chuẩn bị dung dịch
a. Dung dịch acryamide 30%:
Cân 29,2 g acrylamide, 0,8 g bisacrylamide hòa tan thành 100 ml bằng n- ớc cất 2 lần.
b. Dung dịch đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
Cân 18,15g Tris, pha trong 50 ml nớc cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 8,8 sau đó thêm nớc cất đến 100 ml.
c. Dung dịch đệm Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
Cân 3 g Tris, pha trong 40 ml nớc cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 6,8 sau đó thêm nớc cất đến 50ml
d. Đệm mẫu
Gồm 2,5ml Tris-HCl pH 6,8, 2 ml glycerol, 2 mg bromophenol xanh và 1,5 ml nớc cất. * Đổ gel a. Gel tách 12,5 % 2,31 ml acrylamide 30% 0,55 ml casein 1% 0,85 ML đệm Tris-HCl pH 8,8 55 àL SDS 10% 1,76 ml H20 27,5 àl pesunphate amon 2,5 àl TEMED b. Gel cô 5% 0,3 ml acryamide 30% 0,5 ml Tris-HCl pH 6,8 1,2 ml H2O 10 àl SDS 10%
10 àl Amonium persulfate 4 àl TEMED
* Tiến hành điện di
Lợng mẫu đạt ~40 àg protein trên mỗi giếng. Điện di theo chiều từ âm sang dơng với dòng điện 8mA/1 giếng
Sau khi điện di, loại bỏ SDS bằng Triton X-100 2,5% để. Rửa sạch bằng nớc cất. Sau đó ủ trong đệm Sorensen pH 7,6 có hoặc không có chất ức chế trong 4 giờ ở 37oC.
Nhuộm gel bằng dung dịch Amido Black 10B hoặc Coomassie Brilliant Blue. Các băng proteinase là các băng trắng không bắt màu thuốc nhuộm.
2.3.7 Sắc ký cột silicagel
Sắc ký cột đợc sử dụng để tách các hợp chất hữu cơ dựa trên nguyên tắc tơng tự nh sắc ký lớp mỏng, chất hấp phụ thờng đợc sử dụng là silicagel hoặc alumina. Dung dịch các chất hữu cơ đợc đa lên cột và rửa chiết (eluent) bằng một dung môi hữu hoặc hệ dung môi thích hợp. Các phân tử có tính phân cực khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau qua cột. Các phân đoạn khi đó đ- ợc thu lại và kiểm tra khả năng phân tách trên bản mỏng.
Chúng tôi sử dụng silicagel pha thờng có kích thớc hạt là 0,040-0,063 mm làm chất hấp phụ và rửa chiết bằng hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4) và chloroform : ethylacetate (5:3). Các phân đoạn đợc kiểm tra trên bản mỏng với hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4).
2.3.8 Quang phổ hấp thụ tử ngoại [8, trích theo tài liệu 10]
Các phân đoạn sắc ký đợc hoà tan trong cồn tuyệt đối và xác định phổ tử ngoại trên máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam. Các nhóm flavonoid khác nhau sẽ có phổ hấp thụ tử ngoại đặc trng khác nhau trong hai dải hấp thụ của các hợp chất flavonoid.
Chơng 3
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1 Hàm lợng polyphenol tổng số và hoạt tính ức chế proteinase ở một số cây thuốc
3.1.1 Điều tra sơ bộ PIA các mẫu nghiên cứu
Để thăm dò sơ bộ khả năng ức chế proteinase (PIA) của các mẫu nghiên cứu chúng tôi sử dụng phơng pháp khuếch tán là phơng pháp tơng đối nhanh và nhạy. Kết quả điều tra khả năng ức chế 3 loại proteinase serine là trypsin, chymotrypsin và proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa (PsA) đợc chỉ ra ở hình 3.1 và bảng 3.1. Các mẫu có PIA cao sẽ đợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.1a. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu
(a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA
1-3: E (Enzyme)+H2O; 4-6: E+cây Muối; 7-9: E+Sắn thuyền; 10-12: E+Trâm bầu; 13-15: E+Vỏ thân Tô mộc; 16-18: E+Gỗ Tô mộc (a) (b) (c) 1 3 4 11 12 18 16 15 7 8
Bảng 3.1. Điều tra sơ bộ PIA (bằng phơng pháp khuếch tán)
Hình 3.1b. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu
(a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA
1-3: E +H2O; 4-6: E+Vỏ hạt Tô mộc chín; 7-9: E+Đơn tớng quân; 10-12: E+Đại hoàng 1 3 4 6 7 10 9 12 (b) (a) (c)
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
36
1
Muỗng truổng
Zanthoxylum avicennae (Lamk.)
Họ Cam (Rutaceae) Rễ +++ +++ ++
2
Dầu giun
Chenopodium ambrosioides L.
Họ Rau muối (Chenopodiaceae) Lá - - -
3
Tế tân
Asarum sieboldii Miq.
Họ Mộc thông (Aristolochiaceae) Lá - - -
4 Trâm bCombretum quadrangulareầu Kurz.
Họ Trâm bầu (Combretaceae) Lá +++++ +++++ +++++
5
Khoai na
Amorphophallus rivieri Dur.
Họ Ráy (Araceae) Lá - - -
6
Cây hoa phấn
Mirabilis jalapa L.
Họ Hoa giấy (Nyctaginaceae) Lá - - -
7
Xoan
Melia azedarach
Họ Xoan (Meliaceae) Vỏ thân ++ +++ ++
8 SQuisqualis indicaử quân tử L.
Họ Bàng (Combretaceae) Vỏ thân
+++ ++ +
9
Cây muối
Bischofia Javanica)
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Vỏ thân ++ ++ -
10
Lộc mại
Mercuriadis indica Lour.
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Lá + + +
11 Sắn thuyền
Syzygium resinosum Gagnep. Lá +++++ +++++ +++++
1. Cành +++ +++ +++
12 ĐơSyzygium formosumn tướng quân var.
Họ Sim (Myrtaceae) Lá ++++ +++ ++++
13
Đại hoàng (sapa)
Rheum sp.
Họ Rau răm (Polygonaceae) Củ ++++ ++++ ++++
14 Đậu cọc rào
Cajanus indicus Spreng. Vỏ quả - - -
Lá +++ +++ ++ 15 XoMangifera indicaài L.
Họ Đào lộn hột (Anacadiaceae) Vỏ thân