để đạt nồng độ ethanol khi tiếp xúc với enzyme nhỏ hơn 5% (v/v) là nồng độ không ảnh hởng tới hoạt tính enzyme.
Phơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch (điều tra sơ bộ PIA) với cơ chất casein 0,1% giữ ở 37oC trong 4 giờ nhuộm bằng Amido Black 10B 0,1% trong acid acetic 7%, hoạt độ enzyme tỷ lệ thuận với đờng kính và độ sáng của vòng phân giải trên đĩa thạch [70].
Phơng pháp Anson cải tiến [69]
Nguyên tắc dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein) bởi enzyme. Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein cha bị thủy phân bằng acid tricloroaxetic (TCA). Định lợng sản phẩm tạo thành sau phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteau, khả năng ức chế proteinase của mẫu nghiên cứu tỉ lệ với hiệu số giữa sản phẩm tạo thành của ống thí nghiệm không có mẫu nghiên cứu và ống nghiệm có chất nghiên cứu. Một đơn vị ức chế (IU) là lợng chất ức chế làm giảm 50% hoạt độ của 2 mg enzyme.
• Hóa chất thí nghiệm
Thuốc thử Folin-Ciocalteau
Đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M
Cơ chất casein 1% trong đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Proteinase: trypsin, chymotrypsin, Pa tách từ Pseudomonas aeruginosa
TCA 5% Na2CO3 6%
• Tiến hành thí nghiệm
ống thí nghiệm: lấy hai ống nghiệm, một ống cho vào 400 àl đệm, ống còn lại cho vào 300 àl đệm cùng với 100 àl mẫu nghiên cứu có độ pha loãng thích hợp. Sau đó cho vào mỗi ống 100 àl enzyme, trộn đều, để ở 35,50C trong 10 phút, thêm 1 ml casein 1% và giữ ở 35,50C trong 20 phút. Tiếp theo cho vào mỗi ống 2,5 ml TCA 5%, lắc đều, lọc lấy dịch trong làm phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau.
ống kiểm tra: làm tơng tự với ống thí nghiệm, nhng sau khi ủ 10 phút ở 35,50C cho ngay TCA trớc rồi để 20 phút, sau đó mới cho cơ chất casein.
Phản ứng màu: cho 250 àl dịch lọc vào 1ml Na2CO3 6%, trộn đều rồi cho tiếp vào 250 àl thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần. Sau 30 phút so màu ở bớc sóng 750 nm. Hoạt độ ức chế đợc tính nh sau: ∆EI = E - EI E = Etn - Ekt EI = EItn - EIkt I (mIU/ml) = ∆EI/E.n.x Etn : Độ hấp thụ ống thí nghiệm không có chất ức chế. Ekt : Độ hấp thụ ống kiểm tra không có chất ức chế. EItn: Độ hấp thụ ống thí nghiệm có chất ức chế. EIkt: Độ hấp thụ ống kiểm tra có chất ức chế. n: độ pha loãng mẫu nghiên cứu
x: hàm lợng enzyme (àg/ml) tơng ứng với hoạt độ E I : hoạt độ ức chế
Thí nghiệm xác định PIA đợc tiến hành với nhiều độ pha loãng mẫu nghiên cứu khác nhau đến khi tìm đợc độ pha loãng thích hợp. Độ pha loãng thích hợp là độ pha loãng mẫu nghiên cứu mà ở đó hoạt độ enzyme khi có chất kìm hãm (dung dịch mẫu nghiên cứu) bằng khoảng một nửa so với hoạt độ enzyme khi có đối chứng là nớc.
Xác định hoạt độ phân giải protein theo phơng pháp Anson cải tiến
Đơn vị hoạt độ phân giải protein là lợng enzyme mà trong 1 phút ở 35,5
0C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tơng đơng với phản ứng màu của 1 àmol tyrosine với thuốc thử Folin-Ciocalteau.
Hình 2.3 Đờng chuẩn tyrosine
Hoạt độ phân giải protein (HP/ml) của 1 ml dung dịch enzyme đợc tính theo công thức:
HP/ml = (àmol tyrosine x a x b)/t
a: Toàn bộ thể tích hỗn hợp sau phản ứng (4 ml)
b: Tính trên 1 ml enzyme xác định (nhân với 10 nếu lợng enzyme xác định là 100 àl)
t: Thời gian ủ enzyme với cơ chất (20 phút) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 OD 750 μmol/ml
2.3.6 Điện di PA trên gel polyacryamide theo phơng pháp của Heussen và Dowdle [26]
Các bớc thực hiện kỹ thuật điện di phát hiện proteinase trên gel polyacrylamide có SDS nh sau:
* Chuẩn bị dung dịch
a. Dung dịch acryamide 30%:
Cân 29,2 g acrylamide, 0,8 g bisacrylamide hòa tan thành 100 ml bằng n- ớc cất 2 lần.
b. Dung dịch đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
Cân 18,15g Tris, pha trong 50 ml nớc cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 8,8 sau đó thêm nớc cất đến 100 ml.
c. Dung dịch đệm Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
Cân 3 g Tris, pha trong 40 ml nớc cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 6,8 sau đó thêm nớc cất đến 50ml
d. Đệm mẫu
Gồm 2,5ml Tris-HCl pH 6,8, 2 ml glycerol, 2 mg bromophenol xanh và 1,5 ml nớc cất. * Đổ gel a. Gel tách 12,5 % 2,31 ml acrylamide 30% 0,55 ml casein 1% 0,85 ML đệm Tris-HCl pH 8,8 55 àL SDS 10% 1,76 ml H20 27,5 àl pesunphate amon 2,5 àl TEMED b. Gel cô 5% 0,3 ml acryamide 30% 0,5 ml Tris-HCl pH 6,8 1,2 ml H2O 10 àl SDS 10%
10 àl Amonium persulfate 4 àl TEMED
* Tiến hành điện di
Lợng mẫu đạt ~40 àg protein trên mỗi giếng. Điện di theo chiều từ âm sang dơng với dòng điện 8mA/1 giếng
Sau khi điện di, loại bỏ SDS bằng Triton X-100 2,5% để. Rửa sạch bằng nớc cất. Sau đó ủ trong đệm Sorensen pH 7,6 có hoặc không có chất ức chế trong 4 giờ ở 37oC.
Nhuộm gel bằng dung dịch Amido Black 10B hoặc Coomassie Brilliant Blue. Các băng proteinase là các băng trắng không bắt màu thuốc nhuộm.
2.3.7 Sắc ký cột silicagel
Sắc ký cột đợc sử dụng để tách các hợp chất hữu cơ dựa trên nguyên tắc tơng tự nh sắc ký lớp mỏng, chất hấp phụ thờng đợc sử dụng là silicagel hoặc alumina. Dung dịch các chất hữu cơ đợc đa lên cột và rửa chiết (eluent) bằng một dung môi hữu hoặc hệ dung môi thích hợp. Các phân tử có tính phân cực khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau qua cột. Các phân đoạn khi đó đ- ợc thu lại và kiểm tra khả năng phân tách trên bản mỏng.
Chúng tôi sử dụng silicagel pha thờng có kích thớc hạt là 0,040-0,063 mm làm chất hấp phụ và rửa chiết bằng hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4) và chloroform : ethylacetate (5:3). Các phân đoạn đợc kiểm tra trên bản mỏng với hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4).
2.3.8 Quang phổ hấp thụ tử ngoại [8, trích theo tài liệu 10]
Các phân đoạn sắc ký đợc hoà tan trong cồn tuyệt đối và xác định phổ tử ngoại trên máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam. Các nhóm flavonoid khác nhau sẽ có phổ hấp thụ tử ngoại đặc trng khác nhau trong hai dải hấp thụ của các hợp chất flavonoid.
Chơng 3
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1 Hàm lợng polyphenol tổng số và hoạt tính ức chế proteinase ở một số cây thuốc
3.1.1 Điều tra sơ bộ PIA các mẫu nghiên cứu
Để thăm dò sơ bộ khả năng ức chế proteinase (PIA) của các mẫu nghiên cứu chúng tôi sử dụng phơng pháp khuếch tán là phơng pháp tơng đối nhanh và nhạy. Kết quả điều tra khả năng ức chế 3 loại proteinase serine là trypsin, chymotrypsin và proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa (PsA) đợc chỉ ra ở hình 3.1 và bảng 3.1. Các mẫu có PIA cao sẽ đợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.1a. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu
(a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA
1-3: E (Enzyme)+H2O; 4-6: E+cây Muối; 7-9: E+Sắn thuyền; 10-12: E+Trâm bầu; 13-15: E+Vỏ thân Tô mộc; 16-18: E+Gỗ Tô mộc (a) (b) (c) 1 3 4 11 12 18 16 15 7 8
Bảng 3.1. Điều tra sơ bộ PIA (bằng phơng pháp khuếch tán)
Hình 3.1b. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu
(a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA
1-3: E +H2O; 4-6: E+Vỏ hạt Tô mộc chín; 7-9: E+Đơn tớng quân; 10-12: E+Đại hoàng 1 3 4 6 7 10 9 12 (b) (a) (c)
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
36
1
Muỗng truổng
Zanthoxylum avicennae (Lamk.)
Họ Cam (Rutaceae) Rễ +++ +++ ++
2
Dầu giun
Chenopodium ambrosioides L.
Họ Rau muối (Chenopodiaceae) Lá - - -
3
Tế tân
Asarum sieboldii Miq.
Họ Mộc thông (Aristolochiaceae) Lá - - -
4 Trâm bCombretum quadrangulareầu Kurz.
Họ Trâm bầu (Combretaceae) Lá +++++ +++++ +++++
5
Khoai na
Amorphophallus rivieri Dur.
Họ Ráy (Araceae) Lá - - -
6
Cây hoa phấn
Mirabilis jalapa L.
Họ Hoa giấy (Nyctaginaceae) Lá - - -
7
Xoan
Melia azedarach
Họ Xoan (Meliaceae) Vỏ thân ++ +++ ++
8 SQuisqualis indicaử quân tử L.
Họ Bàng (Combretaceae) Vỏ thân
+++ ++ +
9
Cây muối
Bischofia Javanica)
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Vỏ thân ++ ++ -
10
Lộc mại
Mercuriadis indica Lour.
Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Lá + + +
11 Sắn thuyền
Syzygium resinosum Gagnep. Lá +++++ +++++ +++++
1. Cành +++ +++ +++
12 ĐơSyzygium formosumn tướng quân var.
Họ Sim (Myrtaceae) Lá ++++ +++ ++++
13
Đại hoàng (sapa)
Rheum sp.
Họ Rau răm (Polygonaceae) Củ ++++ ++++ ++++
14 Đậu cọc rào
Cajanus indicus Spreng. Vỏ quả - - -
Lá +++ +++ ++ 15 XoMangifera indicaài L.
Họ Đào lộn hột (Anacadiaceae) Vỏ thân
+++ +++ ++
16 Cây gCaesalpinia sappanỗ Vang (Tô mộc) L.
Họ Vang (Caesalpiniaceae) Gỗ ++++ +++++ +++ Vỏ thân ++++ +++++ +++++ Vỏ hạt xanh +++ +++ ++ Vỏ hạt chín +++++ +++++ +++++ 17 Cây me Tamarindus indica L.
Họ Vang (Caesalpiniaceae) Vỏ thân + + -
18 ĐạiPlumeria rubra
Ghi chú: + : ức chế < 25% ; + + : ức chế từ 25% đến 50%;
+ + + : ức chế từ 50% đến 75% ; + + + + : ức chế >75%; + + + + + : ức chế 100%
Kết quả điều tra 26 mẫu của 20 cây thuốc thờng đợc sử dụng chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa thuộc 17 họ thực vật khác nhau cho thấy có 21 mẫu của 16 cây có hoạt tính ức chế proteinase, chiếm 80% những cây điều tra. Tỉ lệ trên cho thấy có thể có mối quan hệ giữa khả năng ức chế proteinase của dịch chiết các cây thuốc với khả năng chữa bệnh của chúng.
Các mẫu có PIA cao tiếp tục đợc xác định PIA theo phơng pháp Anson cải tiến, kết quả đợc trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết nớc (xác định theo phơng pháp Anson cải tiến)
STT Mẫu %
chất TIA ChIA PsIA
mIU/g
tơi mIU/g khô mIU/g tơi mIU/g khô mIU/g tơi mIU/g khô 1 Trâm bầu 44,6 7.651 17.155 11.960 26.816 1.789 4.011 2 Cây xoan 43,1 1.375 3.190 2.763 6.411 260 603 3 Sử quân tử 42,5 263 619 1.154 2.715 184 433 4 Lộc mại 20,5 222 1.083 171 834 179 873 5 Sắn thuyền 31,7 11.631 36.691 33.332 105.148 8.195 25.852 6 Đơn tớng quân 33,3 2.465 7.402 3.694 11.093 1.518 4.559 7 Đại hoàng 29,7 759 2.556 2.021 6.805 274 923 8 Đậu cọc rào 27,6 632 2.290 805 2.917 372 1.348 9 Cây xoài 34,7 287 827 1.033 2.977 63 182 10 Thân gỗ tô mộc 57,2 14 24 29 51 22 38 11 Vỏ thân tô mộc 47,8 7 15 19 40 13 27 12 Vỏ hạt tô mộc chín 79,1 2.861 3.617 11.454 14.480 5.183 6.552 13 Vỏ hạt tô mộc xanh 33,6 255 759 3.463 10.307 1.271 3783
Từ bảng 3.2 có thể thấy các dịch chiết đều có khả năng ức chế chymotrypsin (ChIA) tốt hơn khả năng ức chế trypsin (TIA), khả năng ức chế proteinase tách từ P. aeruginosa (PsIA) là kém nhất. Khả năng ức chế PsA kém có thể do proteinase tách từ dịch nuôi cấy P. aeruginosa còn có một số loại proteinase khác, các dịch chiết nghiên cứu chỉ có thể ức chế một loại proteinase
nào đó (có thể là các proteinase serine) hoặc cũng có thể do trong dịch nuôi cấy còn có các chất khác ảnh hởng tới hoạt tính của các chất ức chế.
Bảng 3.2 cũng cho thấy có sự khác nhau rất lớn về hoạt độ ức chế proteinase của các mẫu. Chúng tôi tiến hành xác định hàm lợng polyphenol của 13 mẫu này và nhận thấy các mẫu có hàm lợng polyphenol cao thờng có PIA cao nh: các mẫu Trâm bầu, Sắn thuyền, tuy nhiên cũng có mẫu có hàm lợng polyphenol thấp nhng cũng có PIA cao nh vỏ hạt Tô mộc chín (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Hàm lợng polyphenol dịch chiết nớc và hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) ST T Mẫu Hàm lợng polyphenol (mg/g tơi) TIA (mIU/mg polyphenol) ChIA (mIU/mg polyphenol) PsIA (mIU/mg polyphenol) 1 Trâm bầu 20,1 380,6 5950.0 89,0 2 Cây Xoan 3,3 416,7 837,3 78,8 3 Sử quân tử 5,5 47,8 209,8 33,5 4 Lộc mại 5,7 38,9 30,0 31,4 5 Sắn thuyền 12,3 945,6 2709,9 666,3 6 Đơn tớng quân 8,2 300,6 450,5 185,1 7 Đại hoàng 8,7 87,2 23,2 11,8 8 Đậu cọc rào 3,9 162,0 206,4 95,4 9 Cây Xoài 1,9 151,1 543,7 33,2 10 Gỗ Tô mộc 5,5 2,6 5,3 4,0 11 Vỏ thân Tô mộc 7,5 0,9 2,5 1,7 12 Vỏ hạt Tô mộc chín 2,1 1362,4 5454,3 2468,1 13 Vỏ hạt Tô mộc xanh 1,4 182,1 2473,6 907,9
Bảng 3.3 cũng cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa các mẫu Tô mộc, các mẫu gỗ và vỏ thân có hàm lợng polyphenol cao hơn các mẫu vỏ hạt khoảng 2 đến 5 lần nhng hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) lại thấp hơn rất nhiều. Do đó có thể thấy có sự khác nhau về thành phần polyphenol của các mẫu Tô mộc.
3.1.2 Hàm lợng polyphenol tổng số và flavonoid trong dịch chiết ethanol
Ethanol đợc sử dụng để chiết rút polyphenol tổng số vì là một dung môi phân cực tốt, có khả năng chiết rút tốt các hợp chất tự nhiên, hơn nữa, ở nồng độ cao có thể loại bỏ một số tạp chất và các chất ức chế có bản chất là protein (có
thể có). Quá trình chiết rút đợc thực hiện theo quy trình đã mô tả trong chơng 2, dịch chiết này đợc gọi là dịch chiết polyphenol tổng số.
Từ các dịch chiết polyphenol tổng số, flavonoid toàn phần đợc tách ra theo sơ đồ hình 2.1, các dịch chiết sau đó đợc định lợng polyphenol và xác định PIA.
Bảng 3.4. Hàm lợng polyphenol tổng số và flavonoid toàn phần
STT Mẫu (mg/g bột khô)Hàm lợng Hàm lợng
(mg/g tơi)
Polyphenol Flavonoid Polyphenol Flavonoid
1 Sắn thuyền 46,13 6,52 15,91 2,25 2 Đơn tớng quân 62,41 16,11 21,51 5,55 3 Đại hoàng 53,57 20,21 5,58 5,58 4 Đậu cọc rào 13,43 1,78 3,71 0,49 5 Cây Xoài 14,35 5,18 4,98 1,8 6 Gỗ Tô mộc 59,00 44,49 33,75 25,45 7 Vỏ thân Tô mộc 96,84 25,27 46,25 12,07 8 Vỏ hạt Tô mộc chín 51,93 1,55 41,08 1,23 9 Vỏ hạt Tô mộc xanh 21,39 1,99 7,19 0,67
Bảng 3.4 cho thấy khi chiết bằng ethanol 96%, lợng polyphenol tổng số thu đợc cao hơn khi chiết bằng nớc, mẫu vỏ thân Tô mộc có hàm lợng polyphenol tổng số cao nhất (96,84 mg/g bột khô).
Hình 3.2. Hàm lợng polyphenol của dịch chiết nớc và dịch chiết EtOH của các mẫu
mg/g bột khô
Flavonoid
Từ hình 3.2 có thể thấy khả năng chiết rút của ethanol tốt hơn nớc nhiều lần, đặc biệt là các mẫu tô mộc, khả năng chiết rút tăng lên từ 5 đến 20 lần. Hàm lợng flavonoid toàn phần trong các mẫu chiếm tỉ lệ tơng đối thấp từ khoảng 3% (vỏ hạt Tô mộc chín) tới gần 40% (Đại hoàng). Riêng mẫu thân gỗ Tô mộc tỉ lệ này vào khoảng 75%, cao nhất trong các mẫu điều tra.
3.1.3 Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid flavonoid
Bảng 3.5. Hoạt độ ức chế proteinase dịch chiết polyphenol tổng số
STT Mẫu (mIU/g TIA
bột khô) ChIA (mIU/g bột khô) PsIA (mIU/g bột khô) 1 Sắn thuyền 25.553 73.544 28.923 2 Đơn tớng quân 12.528 37.707 10.053 3 Đại hoàng 416 1.388 454 4 Đậu cọc rào 4.056 11.957 4.615 5 Cây xoài 3.763 11.549 2.099 6 Gỗ Tô mộc 1.976 16.729 4.925 7 Vỏ thân Tô mộc 13.264 44.311 17.320 8 Vỏ hạt Tô mộc chín 74.016 530.681 99.025 9 Vỏ hạt Tô mộc xanh 18.733 126.556 25.416
Cũng giống nh dịch chiết nớc, khả năng ức chế các proteinase của polyphenol tổng số giảm dần theo thứ tự chymotrypsin, trypsin, PsA, trong đó dịch chiết polyphenol tổng số mẫu vỏ hạt Tô mộc chín ức chế mạnh nhất cả ba loại enzyme, cũng là mẫu có hàm lợng polyphenol thuộc nhóm cao trong các mẫu nghiên cứu. PIA tính trên 1 gam bột mẫu khô của dịch chiết polyphenol tổng số các mẫu cũng cao hơn nhiều so với dịch chiết nớc đặc biệt là các mẫu Tô mộc. Tuy nhiên các mẫu Sắn thuyền và Đại hoàng lại có PIA thấp hơn, phải chăng polyphenol hai mẫu này không phải là thành phần đóng góp chính vào hoạt độ ức chế proteinase.
Nghiên cứu ở Việt Nam đã tinh sạch đợc acid asiatic từ cây Sắn thuyền và cho thấy acid asiatic có thể ức chế nhiều enzyme khác nhau của vi khuẩn
Steptococcus mutans [7]. Acid asiatic là một triterpene đã đợc sử dụng trong nhiều loại thuốc điều trị các bệnh da và đợc cho là có vai trò trong việc hình