Nguồn thu nhận và ứng dụng enzyme protease

Nguồn thu nhận và ứng dụng enzyme protease

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC  NGUỒN THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE GVHD : TS. Trần Bích Lam SV thực hiện : Lớp: HC07TP Thời gian thực hiện: tuần thứ 10, HKI, 2008-2009 MỤC LỤC Tài liệu tham khảo 2 A. Khái quát enzyme protease i. Khái quát enzyme 3 ii. Protease 3 iii. Nguồn cung cấp protease 4 iv. Ứng dụng protease 5 B. Proteae có nguồn gốc thực vật i. Papain 8 ii. Bromelin 11 C. Protease có nguồn gốc động vật i. Trypsin 13 ii. Chymotrypsin 15 iii. Chymosin (Rennin) 17 iv. Pepsin 19 D. Protease có nguồn gốc vi sinh vật i. Nguyên nhân phát triển 21 ii. Giới thiệu tổng quan 22 iii. Nguồn thu nhận protease vsv 24 iv. Đặc điểm và tính chất của protease vsv 25 v. Một số loài vsv tổng hợp enzyme protease 27 vi. Trung tâm hoạt động 37 vii. Các phương pháp thu nhận enzyme protease 38 viii. Kỹ thuật nuôi cấy vsv thu nhận enzyme 41 2 Sinh viên thực hiện : STT Họ tên MSSV Phân công 1 Nguyễn Đức Ánh Khái quát protease 2 Nguyễn Văn Duy ứng dụng protease 3 Đặng Minh Đạt Papain, bromelin 4 Trần Chí Hải Trypsin, chymotrypsin 5 Trần Trọng Hiếu Chymosin, pepsin 6 Phan Thành Huy Tính chất, đặc điểm prrotease VSV 7 Nguyễn Minh Long Kỹ thuật nuôi cấy VSV 8 Trương Vĩnh Lộc Nguồn thu nhận protease VSV, một vài VSV TÀI LIỆU THAM KHẢO - Giáo trình “Hóa Sinh Công Nghiệp” – Lê Ngọc Tú, NXB KHKT 1997 - Giáo trình “Sinh Hóa Hiện Đại” – Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Nguyên, NXB GD 1998 - Giáo trình “Công Nghệ Enzyme” – Nguyễn Đức Lượng, NXB ĐHQGTPHCM 2004 - Giáo trình “Công Nghệ Enzyme” – Đặng Thị Thu, NXB KHKT 2004 - Giáo trình “Vi Sinh Vật Học” – Nguyễn Lân Dũng, NXB GD, 2002 - Các website: www.google.com.vn www.yahoo.com www.vnexpress.net www.sinhhocvietnam.com http://en.wikipedia.org/wiki/Protease www.bachkhoatoanthu.gov.vn 3 ENZYME PROTEASE ENZYME PROTEASE I. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME 1. Enzym - Enzym có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các phản ứng hóa sinh học. 2. Đặc tính chung của enzym - Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môi trường. - Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống. - Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. - Enzym có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong ống nghiệm) - Phản ứng enzym tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao - Enzyme tính chọn lọc cao - Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. 3. Cấu tạo của enzym Nhóm enzym đơn cấu tử : Thành phần cấu tạo chỉ có protein. Nhóm enzym đa cấu tử : - Gồm 2 phần: + Phần I: protein thuần : apoprotein hay apoenzym + Phần II: thành phần không phải protein : cofactor – chúng có thể gắn chặt (prosthetic) hoặc lỏng lẻo với phần protein (coenzym) Ngoài ra còn có một số kim loại giữ vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa apoenzym và coenzym, tham gia vận chuyển điện tử. II. PROTEASE 1) Định nghĩa Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptit trong phân tử protein giải phóng các axit amin, peptone hoặc ditripepton. 2) Phân loại Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm 6 nhóm chính : - Serine proteases - Threonine proteases 4 - Cysteine proteases - Aspartic acid proteases - Metalloproteases - Glutamic acid proteases III. NGUỒN CUNG CẤP Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi về kinh tế, người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme với hiệu suất cao. Hiên chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật - Động vật : Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày, niêm mạc ruột non, tuyến tụy…). Vd: Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc cao. Chymosin “rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi Tuy nhiên, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme không lớn lắm - Thực vậ t : Từ các thực vật bậc cao người ta cũng thu được một số chế phẩm enzyme quan trọng Vd : + Papain thu từ mủ đu đủ xanh + Bromelin từ than cây dứa + Ficin tách từ dịch ép thân cây sung Lượng enzyme thu được từ các nguyên liệu thực vật không lớn lắm so với lượng nhiên liệu tiêu hao - Vi sinh vật :Hai nguồn nguyên liệu trên không thể dùng dùng nguyên liệu trong sản xuất công nghiệp qui mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì vậy, dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế trên. + Nguồn nguyên liệu vô hạn + Hệ enzyme phong phú + Hoạt tính mạnh + Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống + Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh + Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ riền Các protease từ vi sinh vật được ứng dụng nhiều : Thường sử dụng protease của vi khuẩn và nấm sợi. – Protease kiềm (EC.3.4.21.14) : Còn có tên thương mại là SUBTILISIN. Có khoảng pH hoạt động là 7 – 11. Trong trung tâm hoạt động có serine. Chế phẩm dạng bột và dạng hạt có hoạt tính 1 – 6 đơn vị Anson/gram. Dạng kết tinh có hoạt tính khoảng 25-30 đơn vị Anson/ Gram. Ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa. – Protease trung tính ( EC.3.4.24.4) : Protease trung tính là metalloenzym có pH hoạt động từ 6-9. Được sản xuất từ Bacillus subtilic, B. 5 thermoproteolycus và Streptomycesgriceus. Chế phẩm thương mại là dạng bột có hoạt tính 0.5-2 đơn vị anson/1gam. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bia, da và protein thuỷ ngân. - Protease từ nấm sợi : Protease từ nấm sợi thuộc protease acid, kiềm và cảtrung tính. Ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo và thuộc da IV. ỨNG DỤNG PROTEASE 1) Trong công nghiệp thực phẩm a. Trong công nghệ chế biến thịt - Trong công nghiệp thịt, có thể dùng các chế phẩm protease để làm mềm thịt - Chế phẩm enzyme để làm mềm thịt thường là papain hay hỗn hợp của papain với protease của vi sinh vật - Tùy theo tính chất thịt mà sử dung các chế phẩm thích hợp - Chất lượng các loại thịt được nâng cao - Thời gian chin của thịt rút xuống nhiều lần - Kỹ thuật làm mềm thịt không phức tạp lắm. Có thể : + ngâm thịt trong phức hệ enzyme cần thiết ở pH, nhiệt đô, nồng độ thích hợp + rải lên bề mặt thịt chất làm mềm dạng bột có chứa enzyme và chất phụ gia + Tiêm dung dịch enzyme vào mô + Đưa dung dịch enzyme vào máu động vật trước khi giết thịt b. Trong công nghệ chế biến sữa - Protease có khả năng làm đông tụ sữa - Tính chất này từ lâu được ứng dụng vào công nghiệp thực phẩm - Ứng dụng chính : sản xuất phomát - Rennin đóng vai trò quan trọng nhất trong công nghệ này - Người ta đang cố gắng tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự hay thay thế một phần rennin c. Trong công nghệ sản xuất nước chấm - Sử dụng enzym từ các nguồn tự nhiên: + Động vật: trong nội tạng của gia súc có hiện diện nhiều enzym thủy phân protease như: pepsin, tripsin, cathepsin. + Thực vật: có một vài loại thực vật cũng có enzym protease như trong đu đủ có enzym papain, khóm có enzym bromelin + Vi sinh vật: trong quá trình hoạt động sống nhiều hệ enzym sinh ra từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Asp. niger. - Phương pháp sử dụng + Sử dụng dưới dạng thô: cho các nguyên liệu có enzym đó vào chượp với tỉ lệ nhất định. 6 + Sử dụng dưới dạng chiết xuất: chiết enzym từ các nguyên liệu trên thành dạng tinh chế sau đó cho vào trong chượp d. Trong công nghiệp sản xuất bia rượu - Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế - Giảm thời gian lên men - Hiệu suất thu hồi tăng - Bia, rượu thành phẩm đạt các chỉ tiêu quy định tốt hơn khoảng 30% - Nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm chi phí sản xuấT 2) Trong công nghiệp thuộc da - Chất quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác dụng của protease, các chất nhờn tách ra, một số liên kết sơi collagen bị phá hủy. Kết quả là da thu được có độ mềm nhất định. - Trước đây, thường dùng các protease thu từ đường tiêu hóa động vật, ngày nay hiệu quả hơn cả là các enzyme thu từ vi khuẩn và nấm mốc - Rút ngắn thời gian làm mềm, tách long xuống nhiều lần, chất lượng tốt hơn, số lượng lông thu được nhiều hơn, không cần xử lý them - Người ta có thể ngâm nguyên liệu da trong dung dịch enzyme hoặc phết hồ enzyme lên bề mặt 3) Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa - Công dụng của proteaza là phân hủy vết bẩn dạng protein trên vải. - Tên thương mại: Savinase và Relase. - Proteaza có tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước xốt thức ăn, . và chỉ có hoạt tính trong dung dịch giặt. - Enzyme có những tác dụng như sau khi được sử dụng trong chất tẩy rửa: + Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy. + Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh + Giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp. + Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao. + Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzym là chất có thể phân hủy sinh học. + Tăng độ trắng và chống chất bẩn bám trở lại. 4) Trong sản xuất tơ tằm - Quá trình làm sạch tơ sợi tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn - Sợi sau khi kéo kén thường có khoảng 30% xerixin. Muốn tách xerixin phải nấu trong dung dịch xà phòng. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa. - Để tách lượng xerixin còn lại người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc, vi khuẩn 7 5) Trong sản xuất hương phẩm, mỹ phẩm - Hiện nay, một số nước sản xuất những loại kem chứa enzyme để xoa mặt, xoa tay, cạo râu … - Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì da đã chết tách ra, da non và mới sẽ xuất hiện trên bề mặt, sự phát triển của lông, tóc, chậm lại 6) Trong y học - Trong công nghiệp y học, protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác - Dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc, vì peotease sẽ tiêu hủy các protein đệm mà không gây ảnh hưởng đến chất kháng độc - Ứng dụng chữa một số bệnh về đường tiêu hóa 8 PROTEASE NGUỒN GỐC PROTEASE NGUỒN GỐC THỰC VẬT THỰC VẬT I. PAPAIN 1.Định nghĩa – Cấu tạo: - Papain là một enzym thuộc loại proteaza thực vật có nguồn gốc từ cây đu đủ, là chuỗi polipeptit gồm 187 gốc aminoaxit. - Papain gồm có nhiều amin acid, theo thứ tự nhiều ít (từ 11,35-12,43 xuống 2,14-3,57 g/100g) : tyrosin, glutamic acid, aspartic acid, glycin, valin, arginin, leucin, isoleucin, lysin, serin, alanin, prolin, tryptophan, threonin, phenylalanin, cystin, histidin - Papain là chất bột màu trắng hoặc xám nhạt; dễ hút nước; tan trong nước và glixerin; không tan trong các dung môi hữu cơ khác. 2. Tính chất - Papain có khả nǎng thủy phân protein thành các tiểu phân nhỏ như acid amin và các peptid ngắn. Khả nǎng thủy phân của chúng rất khác nhau tùy thuộc vào điều kiện phản ứng. - Khi chưa được hoạt hoá, Papain có hoạt lực rất yếu; dưới tác dụng của các chất có tính khử, nhất là kèm theo sự có mặt của các chất kết hợp với kim loại, Papain được hoạt hoá thành dạng hoạt động. - Điểm đẳng điện của Papain vào khoảng pH 9; khối lượng phân tử khoảng 20.700. - Papain có tính đặc hiệu rộng, 9 - Ở pH = 5 ÷ 7,5, Papain thuỷ phân thành các peptit, amit và este của aminoaxit. Vùng pH Protein LTTC bị thủy phân Casein bị thủy phân (%) Pepsin Papain Hh Pep+Pa Pepsin Papain Hh Pep+Pa 2 ± 0,5 38,00 - 39,50 40,83 - 39,28 4 ± 1,0 20,50 28,00 47,00 22,17 28,27 38,01 7 ± 0,5 - 43,50 38,50 - 38,04 43,80 - Dựa vào bản trên ta thấy Papain hoạt động thủy phân mạnh ở môi trường có tính trung tính hoặc kiềm yếu - Ngoài ra quá trình thủy phân này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ,khi nhiệt độ càng cao thì khả năng thủy phân của Papain càng tăng - Papain có độ bền đặc biệt cao đối với tác dụng của nhiệt độ và ít chịu ảnh hưởng của dung môi 3. Nguồn cung cấp papain: - Papain có nhiều trong quả đu đủ, do đó đu đủ là nguồn cung cấp Papain chủ yếu - Nhựa đu đủ có chứa Papain là một loại men tiêu huỷ protein (proteolytic enzymes) - Đu đủ xanh chứa 4% chất nhựa mủ latex màu trắng đục là hỗn hợp của nhiều proteaza (loại men tiêu hóa chất đạm) trong đó chất chủ yếu là papain. Một cây đu đủ trong 1 năm cho khoảng 100g nhựa mủ. Lấy nhựa khi quả còn non trên cây. Một số phương pháp lấy enzyme Papain từ cây đu đủ - Có thể sản xuất Papain thô bằng cách sấy khô nhựa trực tiếp lấy từ quả đu đủ. Sản phẩm thô này có hoạt lực thấp. Dạng sản phẩm sạch hơn thu được 10 [...]... loại protease serin,có 3 loại protease acid ,protease trung tính ,protease kiềm .Protease acid(aspergilopepti-dase A) Protease acid Hai protease acid Protease acid Hai protease: protease acid và protease kiềm Protease acid có tác dụng làm đông sữa Protease trung tính Protease kiềm Hai protease: protease kiềm và protease trung tính Protease acid Protease kiềm Protease acid có tác dụng lám đông sữa được dung... đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng đã dẫn đến sự thiếu hụt nguồn cung cấp enzyme rennin - Từ đó, các nghiên cứu khoa học đã được tiến hành nhằm tìm ra nguồn enzyme thay thế cho việc giết mổ bê con Và nhóm nấm mốc Aspergillus awamori đã được chú ý bởi có khả năng sinh ra enzyme protease acid gây đông tụ sữa cao Vì thế, việc nghiên cứu tinh sạch và ứng dụng các chế phẩm enzyme protease acid thu nhận. .. loại ;protease- acid - Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm,dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm :Protease- acid ,protease trung tính ,protease kiềm - Trong bốn nhóm protease kể trên, các protease- xerin và protease- tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase... phức tạp và tốn kém Do đó, những enzym sau khi được tinh sạch người ta thường ứng dụng trong y học, trong phân tích và trong kỹ thu t di truyền Trong công nghệ thực phẩm, người ta chỉ sử dụng các loại chế phẩm enzym tương đối sạch sẽ và thế phẩm enzym thô II TỔNG QUÁT: 1 Enzyme protease của vi sinh vật là một protease ngoại bào: Enzyme này khác với Protease của thực vật(fixin,Papain,Bromelin) và động... kiềm Protease trung tính Protease trung tính, Protease acid Protease acid và protease kiềm Colagenase Protease trung tính, Protease kiềm 26 Xạ Khuẩn Str griseus Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, M ỹ, gồm ít nhất là 11 enzym với cơ chất procolagen phân giải 70% đến amino acid có 5 protease, 2 peptidase (lơxinamino-peptidase, cacboxypeptidase), 2 protease: protease- serin Nấm mốc Asp oryzae Protease- kim loại protease. .. protit đến acid amin và đông tụ được sữa có thể ứng dụng để thay thế 1 phần rennin trong sản xuất phomat, một số chế phẩm từ vi khuẩn có elactase có khả năng làm mềm thịt - Protease cũng như amilase có ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp,đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm 3 Ứng dụng: 24 Những chế phẩm này đều được sản xuất từ các loại nấm mốc,vi khuẩn Protease được ứng dụng vào nhiều ngành công... môi trường CFB(cuttlefish power) và nhận thấy chúng sinh trưởng và sản xuất protease tốt trên môi trường này, điều này chứng tỏ vi khuẩn đã sử dụng nguồn C và N có trong môi trường để sinh trưởng và sản xuất protease. Ngoài ra, khi cho thêm vào môi trường FWW(fishery wastwaters) được pha loãng, các quá trình này lại được tăng trưởng, đặc biệt với môi trường FWW thêm vào được pha loãng 5- 10 lần, hiệu... 5038(52.000).Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease- xerin( vào khoảng 33.800-48.400 ) .Protease- tiol và nhiều loại protease- acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 - Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm protease này ở bảng sau: ĐẶC ĐIỂM pH tối NHÓM NGUỒN ENZYME CHẤT KÌM HÃM TRUNG TÂM thích HOẠT ĐỘNG Bac.subsilis Bac.pumilus Str.tradiae Protease Art.hrobacter B22... 467% và 75%( đối với B.cereus BGL và B.subtilis) - Hồ tinh bột và (NH 4)2SO4 là nguồn C và N tốt nhất cho vi sinh vật, ngoài ra CaCO3 cũng làm thúc đẩy sự sản xuất protease - Bacillus proteolyticus: + Sản xuất protease kiềm + Điều kiện tối thích để phát triển và sản xuất protease là: to=37oC pH=9 thời gian 96h +protease sinh ra có độ hoạt động ở 40 oC đến 50oC, mất 20% hoạt tính ở 60oC.Phân tử lượng vào... đảm nhận Chính vì thế, nếu sử dụng VSV như nguồn sinh học để sản xuất enzym rất có lợi Trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn (để thu enzym nội bào) mà còn thu được lượng enzym ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng rất cao 2 Enzym thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao: _Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh sản và phát . 2 A. Khái quát enzyme protease i. Khái quát enzyme 3 ii. Protease 3 iii. Nguồn cung cấp protease 4 iv. Ứng dụng protease 5 B. Proteae có nguồn gốc thực. protein thu ngân. - Protease từ nấm sợi : Protease từ nấm sợi thu c protease acid, kiềm và cảtrung tính. Ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo và