Báo cáo môn hóa sinh thực phẩm: Nguồn thu nhận và ứng dụng protease

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC -HI BÀI BÁO CÁO MƠN HĨA SINH THỰC PHẨM NGUỒN THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE GVBM : Trần Bích Lam Nhóm thực : Ngơ Tú Anh An Thị Thùy Dung Đặng Thị Mỹ Duyên Trần Thị Thu Linh Lưu Hồng Mẫn Võ Nguyệt Minh Phan Trung Thành THÀNH VIÊN THỰC HIỆN : STT Thành viên Ngô Tú Anh MSSV 60600058 An Thị Thùy Dung Đặng Thị Mỹ Duyên Trần Thị Thu Linh Lưu Hồng Mẫn 60600316 60600368 60601272 60601454 Võ Nguyệt Minh 60601496 Phan Trung Thành 60602229 Thực -Tổng quát, ứng dụng - Biên tập -Bromelin - Ứng dụng - papain - chymosin - pepsin - Trypsin, - Chymotrypsin - Protease vi sinh vật MỤC LỤC Giới thiệu, mục lục 1 Tổng quát protease 2 Proteae nguồn gốc thực vật - Papain - Bromelin 11 Protease nguồn gốc động vật - Trypsin - Chymotrypsin - Chymosin - Pepsin Protease nguồn gốc vi sinh vật 22 Tài liệu tham khảo 13 13 15 18 20 39 TỔNG QUÁT VỀ PROTEASE I TÌM HIỂU SƠ BỘ VỀ ENZYM Enzym - Enzym loại protein sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào phản ứng sinh học Đặc tính chung enzym - Enzym tạo tế bào sinh vật - Enzym tham gia phản ứng tế bào sống tách khỏi tế bào sống - Enzym tham gia xúc tác phản ứng thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hồn tồn lượng dự trữ hợp chất hóa học Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm phản ứng trước chất cho phản ứng sau - Enzym thực phản ứng: xảy tế bào (như ống nghiệm) - Phản ứng enzym tiêu hao lượng ít, hiệu suất tốc độ cao - Enzyme tính chọn lọc cao - Enzym chịu điều khiển gen điều kiện phản ứng Bản chất hóa học enzym Nhóm enzym đơn cấu tử : Thành phần cấu tạo có protein Nhóm enzym đa cấu tử : - Gồm phần: + Phần I: protein : apoprotein hay apoenzym + Phần II: thành phần protein : cofactor – chúng gắn chặt (prosthetic) lỏng lẻo với phần protein (coenzym) Ngồi cịn có số kim loại giữ vai trị liên kết enzym chất, apoenzym coenzym, tham gia vận chuyển điện tử II PROTEASE 1) Định nghĩa Protease la enzyme thủy phân liên kết peptit phân tử protein giải phóng axit amin,peptone ditripepton 2) Phân loại Protease phân loại dựa đặc điểm riêng chúng cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, chia làm nhóm : - Serine proteases - Threonine proteases - Cysteine proteases - Aspartic acid proteases - Metalloproteases - Glutamic acid proteases III NGUỒN CUNG CẤP Vì enzyme chất chế biến phương pháp tổng hợp hóa học, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn sinh học Enzyme có tất quan, mô sinh vật; để thuận lợi kinh tế, người ta dùng vật liệu cho phép thu lượng lớn enzyme với hiệu suất cao Hiên sử dụng nguồn nguyên liệu sinh học để thu nhận protease : Các mô động vật, mô quan thực vật, tế bào vi sinh vật - Động vật : Thơng thường protease động vật có tuyến tiêu hóa (niêm mạc dày, niêm mạc ruột non, tuyến tụy…) Vd: Pepsin từ niêm mạc dày dịch vị động vật bậc cao Chymosin “rennin” có ngăn thứ tư cỏ bê non tháng tuổi Tuy nhiên, để sử dụng rộng rãi công nghiệp, protease động vật thuận lợi sản xuất chúng bị hạn chế nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme không lớn - Thực vật : Từ thực vật bậc cao người ta thu số chế phẩm enzyme quan trọng Vd : + Papain thu từ mủ đu đủ xanh + Bromelin từ than dứa + Ficin tách từ dịch ép thân sung Lượng enzyme thu từ nguyên liệu thực vật không lớn so với lượng nhiên liệu tiêu hao - Vi sinh vật :Hai nguồn nguyên liệu dùng dùng nguyên liệu sản xuất công nghiệp qui mô lớn hạn chế nguyên liệu cơng nghệ Vì vậy, dùng enzyme từ vi sinh vật khắc phục hạn chế + Nguồn nguyên liệu vô hạn + Hệ enzyme phong phú + Hoạt tính mạnh + Có khả tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống + Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh + Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ riền Các protease từ vi sinh vật ứng dụng nhiều : Thường sử dụng protease vi khuẩn nấm sợi – Protease kiềm (EC.3.4.21.14) : Cịn có tên thương mại SUBTILISIN Có khoảng pH hoạt động – 11 Trong trung tâm hoạt động có serine Chế phẩm dạng bột dạng hạt có hoạt tính – đơn vị Anson/gram Dạng kết tinh có hoạt tính khoảng 25-30 đơn vị Anson/ Gram Ứng dụng nhiều sản xuất chất tẩy rửa – Protease trung tính ( EC.3.4.24.4) : Protease trung tính metalloenzym có pH hoạt động từ 6-9 Được sản xuất từ Bacillus subtilic, B thermoproteolycus Streptomycesgriceus Chế phẩm thương mại dạng bột có hoạt tính 0.5-2 đơn vị anson/1gam Ứng dụng cơng nghiệp sản xuất bia, da protein thuỷ ngân - Protease từ nấm sợi : Protease từ nấm sợi thuộc protease acid, kiềm cảtrung tính Ứng dụng để sản xuất bia công nghiệp bánh kẹo thuộc da IV PHƯƠNG PHÁP THU, TÁCH VÀ LÀM SẠCH CÁC CHẾ PHẨM ENZYME - Nuối cấy bề sâu - Nuôi cấy bề mắt - Điện di - Sắc ký - Trao đổi ion - Lọc gel - Biến tính chọn lọc - Kết tủa phân đoạn - Sắc ký hấp thụ - Thu từ canh trường bề mặt nấm mốc - Thu từ canh trường bề sâu vi sinh vật V ỨNG DỤNG PROTEASE 1) Trong công nghiệp thịt - Trong cơng nghiệp thịt, dùng chế phẩm protease để làm mềm thịt - Chế phẩm enzyme để làm mềm thịt thường papain hay hỗn hợp papain với protease vi sinh vật - Tùy theo tính chất thịt mà sử dung chế phẩm thích hợp - Chất lượng loại thịt nâng cao - Thời gian chin thịt rút xuống nhiều lần - Kỹ thuật làm mềm thịt khơng phức tạp Có thể : + ngâm thịt phức hệ enzyme cần thiết pH, nhiệt đơ, nồng độ thích hợp + rải lên bề mặt thịt chất làm mềm dạng bột có chứa enzyme chất phụ gia + Tiêm dung dịch enzyme vào mô + Đưa dung dịch enzyme vào máu động vật trước giết thịt 2) Trong cơng nghiệp sữa - Protease có khả làm đơng tụ sữa - Tính chất từ lâu ứng dụng vào cơng nghiệp thực phẩm - Ứng dụng : sản xuất phomát - Rennin đóng vai trị quan trọng công nghệ - Người ta cố gắng tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự hay thay phần rennin 3) Trong công nghiệp thuộc da - Chất quan trọng da collagen, tác dụng protease, chất nhờn tách ra, số liên kết sơi collagen bị phá hủy Kết da thu có độ mềm định - Trước đây, thường dùng protease thu từ đường tiêu hóa động vật, ngày hiệu enzyme thu từ vi khuẩn nấm mốc - Rút ngắn thời gian làm mềm, tách long xuống nhiều lần, chất lượng tốt hơn, số lượng lông thu nhiều hơn, không cần xử lý them - Người ta ngâm nguyên liệu da dung dịch enzyme phết hồ enzyme lên bề mặt 4) Trong sản xuất tơ tằm - Quá trình làm tơ sợi tự nhiên tương đối phức tạp khó khăn - Sợi sau kéo kén thường có khoảng 30% xerixin Muốn tách xerixin phải nấu dung dịch xà phòng Một lượng nhỏ xerixin nằm lại lụa làm giảm độ đàn hồi lụa - Để tách lượng xerixin lại người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc, vi khuẩn 5) Trong hương phẩm, mỹ phẩm - Hiện nay, số nước sản xuất loại kem chứa enzyme để xoa mặt, xoa tay, cạo râu,,, - Dưới tác dụng protease kem, biểu bì da chết tách ra, da non xuất bề mặt, phát triển lơng, tóc, chậm lại 6) Trong y học - Trong công nghiệp y học, protease sử dụng để sản xuất môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng ni cấy vi khuẩn vi sinh vật khác - Dùng chế phẩm protease để cô đặc tinh chế huyết kháng độc, peotease tiêu hủy protein đệm mà không gây ảnh hưởng đến chất kháng độc - Ứng dụng chữa số bệnh đường tiêu hóa 7) Trong cơng nghệ sản xuất nước chấm - Sử dụng enzym từ nguồn tự nhiên: + Động vật: nội tạng gia súc có diện nhiều enzym thủy phân protease như: pepsin, tripsin, cathepsin + Thực vật: có vài loại thực vật có enzym protease đu đủ có enzym papain, khóm có enzym bromelin + Vi sinh vật: trình hoạt động sống nhiều hệ enzym sinh từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Asp niger - Phương pháp sử dụng + Sử dụng dạng thô: cho nguyên liệu có enzym vào chượp với tỉ lệ định + Sử dụng dạng chiết xuất: chiết enzym từ nguyên liệu thành dạng tinh chế sau cho vào chượp 8) Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa - Công dụng proteaza phân hủy vết bẩn dạng protein vải - Tên thương mại: Savinase Relase - Proteaza có tác dụng tẩy rửa vết bẩn máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước xốt thức ăn, có hoạt tính dung dịch giặt - Enzyme có tác dụng sau sử dụng chất tẩy rửa: + Giúp tăng hiệu việc giặt tẩy + Giảm thời gian giặt nhờ khả phân hủy vết bẩn nhanh + Giảm lượng tiêu thụ giặt nhiệt độ thấp + Giảm lượng nước tiêu thụ hiệu giặt rửa cao + Giảm ảnh hưởng mơi trường enzym chất phân hủy sinh học + Tăng độ trắng chống chất bẩn bám trở lại 9) Trong công nghiệp sản xuất bia rượu - Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay - Giảm thời gian lên men - Hiệu suất thu hồi tăng - Bia, rượu thành phẩm đạt tiêu quy định tốt khoảng 30% - Nâng cao hiệu kinh tế, giảm chi phí sản xuấT PROTEASE NGUỒN GỐC THỰC VẬT I PAPAIN 1.Định nghĩa – Cấu tạo: - Papain enzym thuộc loại proteaza thực vật có nguồn gốc từ đu đủ, chuỗi polipeptit gồm 187 gốc aminoaxit - Papain gồm có nhiều amin acid, theo thứ tự nhiều (từ 11,3512,43 xuống 2,14-3,57 g/100g) : tyrosin, glutamic acid, aspartic acid, glycin, valin, arginin, leucin, isoleucin, lysin, serin, alanin, prolin, tryptophan, threonin, phenylalanin, cystin, histidin - Papain chất bột màu trắng xám nhạt; dễ hút nước; tan nước glixerin; không tan dung môi hữu khác papain Tính chất - Papain có khả nǎng thủy phân protein thành tiểu phân nhỏ acid amin peptid ngắn Khả nǎng thủy phân chúng khác tùy thuộc vào điều kiện phản ứng - Khi chưa hoạt hố, Papain có hoạt lực yếu; tác dụng chất có tính khử, kèm theo có mặt chất kết hợp với kim loại, Papain hoạt hoá thành dạng hoạt động - Điểm đẳng điện Papain vào khoảng pH 9; khối lượng phân tử khoảng 20.700 - Papain có tính đặc hiệu rộng, - Ở pH = ÷ 7,5, Papain thuỷ phân thành peptit, amit este aminoaxit Vùng pH Protein LTTC bị thủy phân Casein bị thủy phân (%) Pepsin Papain Hh Pep+Pa Pepsin Papain Hh Pep+Pa ± 0,5 38,00 - 39,50 40,83 - 39,28 ± 1,0 20,50 28,00 47,00 22,17 28,27 38,01 ± 0,5 - 43,50 38,50 - 38,04 43,80 - Dựa vào ta thấy Papain hoạt động thủy phân mạnh mơi trường có tính trung tính kiềm yếu - Ngồi q trình thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ,khi nhiệt độ cao khả thủy phân Papain tăng - Papain có độ bền đặc biệt cao tác dụng nhiệt độ chịu ảnh hưởng dung môi Nguồn cung cấp papain: - Papain có nhiều đu đủ,do đu đủ nguồn cung cấp Papain chủ yếu - Nhựa đu đủ có chứa Papain loại men tiêu huỷ protein (proteolytic enzymes) - Đu đủ xanh chứa 4% chất nhựa mủ latex màu trắng đục hỗn hợp nhiều proteaza (loại men tiêu hóa chất đạm) chất chủ yếu papain Một đu đủ năm cho khoảng 100g nhựa mủ Lấy nhựa non Một số phương pháp lấy enzyme Papain từ đu đủ - Có thể sản xuất Papain thơ cách sấy khơ nhựa trực tiếp lấy từ đu đủ Sản phẩm thơ có hoạt lực thấp Dạng sản phẩm thu nhờ kết tủa phân đoạn dung mơi muối trung tính enzim hoạt hố, sau sấy khơ nhiệt độ thấp - Để lấy nhựa mủ (papain thô) dùng dao bén sắc rạch dọc đu đủ xanh, cho mủ chảy vào bát, sau phơi nắng sấy khơ 40-60ºC Tinh chế papain cách hịa tan papain thơ vào nước thành dung dịch, sau rót vào cồn 90º, papain kết tủa, lọc, sấy - Ngoài ta thu thập chế biến enzym phân giải papain từ trái đu đủ với số lượng lớn cách cắt đu đủ xanh nguyên vỏ phần vỏ xanh bên ngồi thành miếng nhỏ có kích thước thích hợp sấy khơ ánh nắng mặt trời nhiệt tạo thành nguyên liệu thô Công dụng papain: a) Tác dụng dược lý - Làm vi trùng gram dương, gram âm chậm phát triển, vi trùng tụ cầu, thương hàn nhạy cảm tác dụng papain - Papain có tác dụng đồng vận với muối Mg Al aspirin để chống viêm hạ sốt - Với nhựa papain thô papain tinh chế sử dụng thay pepsin pancreatin điều trị rối loạn tiêu hóa, thiếu men tiêu hóa giúp tiêu hóa tốt chất đạm thức ăn - Papain có nhựa hạt đu đủ thuốc tẩy giun tốt cho nhiều loại giun, trừ giun móc (ankylostome) - Papain cịn có tác dụng làm đơng sữa tác dụng làm giảm độc toxin toxanpunin: 18mg papain dung dịch 2% trung hòa 10mg gricin chất độc hạt thầu dầu (bằng 10 liều độc grinsin), 2mg papain trung hòa liều độc toxin uốn ván 10 liều độc toxin bạch hầu Papain trung hòa độ độc ancaloit 12,5mg papain trung hòa liều độc strychnin 2,5mg - Cùng với lysozym, papain tác dụng lên màng tế bào tạo điều kiện dễ dàng cho tác dụng chất kháng sinh bacitracin, steptomycin - Chiết xuất papain để dùng phẫu thuật (là loại “dao phẫu thuật tự nhiên” để mở đĩa đệm cột sống) cột sống Hiệu lâu dài papain cơng trị chứng vị đĩa đột sống thắt lưng xem tương đương với giải phẩu - Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain cịn có hoạt tính kháng sinh, có tác dụng chống vi khuẩn gram dương - Nó cịn dùng để điều trị lở loét; làm tiêu giả mạc bệnh Bạch hầu ; chống kết dính sau phẫu thuật; thuốc giúp tiêu hóa tính enzym tương tự Renin thay phần cho Renin(từ 2550%) - Từ tháng 7-2003, hướng dẫn thạc sĩ trưởng khoa Đỗ Thị Ứng Sao thầy Hoàng Xuân Thế, giảng viên khoa, bạn tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình tinh cho dịch enzyme protease acid thu nhận từ hai điều kiện nuôi cấy bề mặt bề sâu nấm mốc Aspergillus awamori để ứng dụng chúng sản xuất phô mai - Phô mai sản phẩm lên men từ sữa, giàu giá trị dinh dưỡng, sản xuất chủ yếu nhờ enzyme rennin cung cấp từ dày bê Thời gian gần đây, sản lượng phô mai tăng nhằm đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng dẫn đến thiếu hụt nguồn cung cấp enzyme rennin - Từ đó, nghiên cứu khoa học tiến hành nhằm tìm nguồn enzyme thay cho việc giết mổ bê Và nhóm nấm mốc Aspergillus awamori ý có khả sinh enzyme protease acid gây đơng tụ sữa cao Vì thế, việc nghiên cứu tinh ứng dụng chế phẩm enzyme protease acid thu nhận từ nấm mốc dùng cho sản xuất phô mai tiến hành rộng rãi nước châu Âu, Nhật Bản Hoa Kỳ - Đặc biệt công nghệ sản xuất nước chấm nước tương,tương hột, chao…đều sử dụng chế phẩm protease từ vi sinh vật - TS Trần Bích Lam (Bộ mơn vi sinh Đại học Bách khoa TPHCM) cho biết để sản xuất nước tương có tới phương pháp cơng nghệ: cơng nghệ vi sinh, cơng nghệ hóa học cơng nghệ enzym Phương pháp cơng nghệ vi sinh sử dụng nguồn enzym protease vi sinh vật sinh trình lên men Đặc điểm hiệu suất thủy phân thấp, thời gian thủy phân kéo dài, sản phẩm khó bảo quản, mùi vị thường bị đắng Cịn để sản xuất nước tương “sạch” hồn tồn phương pháp lên men tối ưu cần có thời gian đầu tư mặt bằng, dây chuyền thiết bị cho người tiêu dùng quen dần với mùi vị nước tương lên men - Trong công nghiệp hương liệu mỹ phẩm,dùng chế phẩm protease pha lẫn xà bơng, dầu gội đầu,kem chải tóc…làm cho tóc mềm mại,loại bỏ biểu bì chế t(sạch gầu) - Trong chế biến loại bột giặt: Ngày nay, enzym dùng nhiều việc chế biến loại bột giặt, nhiều chức tẩy vết bẩn protein, vết máu, vết hồ - Trong sản xuất tơ tằm,dịch enzym Protease từ nấm mốc vi khuẩn có tác dụng làm bóng sợi tơ,tách rời sợi tơ tằm thủy phân lớp xerixin(là protit) Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin làm dính bết sợi tơ tự nhiên(luợng xerixin sấp xỉ 30%), làm bong tách rời sợi tơ tằm, làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng 25 - Trong công nghiệp thuộc da: Dùng chế phẩm Protease thô từ VSV dùng thuộc da,tách lơng,làm mềm da(chủ yếu phá bỏ colagen,protit da) Các protease làm mềm lớp biểu bì, phân giải khơng sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy thủy phân số liên kết sợi colagen Khi xử lý enzym, tính đàn hồi da tăng lên, rút ngắn q trình tẩy lơng Lượng lơng thu tăng lên khoảng 25 ¸ 30% so với sử dụng phương pháp hóa học.Ở Mỹ chế phẩm enzyme protease sản xuất có tên M-Zim dùng sản xuất da - Trong y học: Chế phẩm Protease để điều chế dịch thủy phân Protein dùng làm môi trường nuôi vi sinh vật(ví dụ Pepton).Cơ đặc tinh chế huyết kháng độc(huyết miễn dịch) III NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE: - Nhiều VSV có khả tổng hợp mạnh protease.Các enzym tế bào tiết vào môi trường nuôi cấy.Một số protease nội bào sản xuất theo quy mô công nghiệp sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp ,trong nơng nghiệp y học.Các lọai VSV có khả tổng hợp mạnh protease trình bày : VSV Vi khuẩn Bac.subtilispha Bac.cireulans Bac.sphaericus Bac.thermophilus Bac.aerothermophilus Bac.thermoacidurans Bac.thermmoproteoly ticus Bac.brevis Bac.licheniformis Bac.mesenlericus Bac.megaterium Bac.cerus Bac.pumilus Cl.perfringens Cl.sporogens vv Ghi *Protease trung tính,Protease kiềm(subtilizin) *Colagenase *Colagenase *Protease trung tính,Protease kiềm 26 Xạ khuẩn Nấm mốc Str.griseus Str.rimosus Strfradiae Str.faeca is Str.reetus var.proteolyticus Asp.oryzae Asp.satoi Asp.awamori Asp.niegr Asp.shirousami Asp.fumigatus Asp.tericola Pen.chrysogenum ……vv *Dùng kỹ nghệ Nhật ,Mỹ,gồm 11 enzym với chất procolagen phân giải 70% Đến amino acid có protease,hai peptidase(lơxinamino_peptidase,cacboxypepti dase),hai protease:protease-serin *Protease-kim lọai protease serin,có ba lọai:Protease acid,protease tung tính,Protease kiềm.Protease acid(aspergilopepti-dase A) *Protease acid *Hai Protease acid *Protease acid *Hai Protease:Protease acid Protease kiềm *Protease acid có tác dụng làm đơng sữa *Protease acid có tác dụng làm đơng sữa dùng Nhật để thay cho rennin IV ĐẶC ĐIỂM VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE VI SINH VẬT: - Các cơng trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày nhiều.Các kết nghiên cứu cho thấy protease nòi vi sinh vật khác nhiều tính chất.Căn vào chế phản ứng,pH hoạt đơng thích hợp,…các nhà khoa học phân loại proteinase vi sinh vật thành nhóm sau:Protease-xerin; proteasethiol; protease-kim loại;protease-acid - Một số tác giả khác chia protease nhóm,dựa vào pH hoạt động chúng bao gồm:Protease-acid,protease trung tính,protease kiềm - Trong bốn nhóm protease kể trên, protease-xerin proteasetiol có khả phân giải liên kết este liên kết amide dẫn xuất acid amino acid.Ngược lại protease kim loại, protease acid thường khơng có hoạt tính esterase amidase dẫn xuất amino acid.Nhiều protease ngoại bào vi sinh vật nghiên cứu tương đối kỹ cấu tạo phân tử, số tính chất hóa lý chế tác dụng.Kết nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử enzyme tương đối bé protease-xerin - Các protease-xerin có trọng lực vào khoảng20.000-27.000 dalton.Tuy nhiên, có số protease-xerin có trọng lượng phân tử lớn nhu enzyme Penicillium cyoneofulvum(44.000),Asp.oryae OUT 5038(52.000).Trọng lượng phân tử protease kim loại lớn so với protease-xerin( vào khoảng 33.80048.400 ).Protease-tiol nhiều loại protease-acid có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 - Có thể tóm tắt đặc tính nhóm protease bảng sau: 27 NHÓM NGUỒN ENZYME Bac.subsilis Bac.pumilus Str.tradiae Protease Art.hrobacter B22 Xerin Asp.oryzae Asp.sojae E.coli Streplococcus Proteinas Clostridium histolyetiol ticum Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac.subtilisamy Losaccarilicis Protease Bac.megaterium Pseudomonasaeruginosa Atreptomyces naraensis Asp.oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolyticum Asp.niger Asp.awamori Asp.sailoi,Peniccillum Proteinse Janthinellum Acid Rhizopus chinensis Mucor pusillus Endothia parasilica CHẤT KÌM HÃM ĐẶC ĐIỂM TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG pH tối thích Xerin Lodoaxeta-mit Ps.cloromer-curbenzoat -SH 7.5 7.0 COOH acid EDTA++ 1,10ota-fenantrolin Diazoaxetil DI norlox-inmetil este - Cách phân loại nhiều tác giả trí sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, thời gian sau này, số protease vi sinh vật nghiên cứu ngày nhiều, ngày nhận nhiều enzyme mang tính chất trung gian nhóm kể trên,nhất nhóm nhóm 3.Do người ta bắt đầu có ý kiến cách phân loại trên.Năm 1975,Morihara thừ phân loại protease vi sinh vật chia thành nhóm lớn,dựa vào tính đặc hiệu chất thích hợp chuỗi insulin bị oxy hóa: *Nhóm có tính đặc hiệu gốc amino acid phía nhóm – CO2 liên kết peptit,do dó cịn gọi carboxyendopeptidase 28 *Nhóm ba có tính đặc hiệu gốc amino acid phía nhóm –NH- cùa liên kết peptit(aminoendopeptidase) *Nhóm thứ tư có đặc hiệu gốc amino acid hai phía liên kết peptit - Mỗi nhóm phân thành nhóm nhỏ dựa vào tính đặc hiệu chung số tính chất khác - Nói chung,tính đặc hiệu protease khơng thể đơí với gốc amino acid chứa nhóm –CO-hoặc nhóm –NH- liên kết bị phân giải(đặc hiệu sơ cấp) mà gốc amino acid xa liên kết bị phân giải(đặc hiệu thứ cấp tương tác thứ cấp.Các enzyme nhóm, có tính đặc hiệu giống chịu ảnh giống tương tác thứ cấp.Nói chung,các enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt thường chịu ảnh hưởng tương tác thứ cấp ngược lại.Chẳng hạn protease-xerin giống trpysine Streptomyces, protease kim loại trung tính,…thường chịu ảnh hưởng tương tác thứ cấp chúng tác dụng với chất phân tử bé peptit phân tử lớn protein.Ngược lại,các protease-xerin kiềm protease acid chiụ ảnh hưởng lớn tương tác thứ cấp enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt chất phân tử bé.Khi tác dụng chất phân tử lớn tính đặc hiệu enzyme đựơc xác định tương tác thứ cấp - Các protease vi sinh vật nghiên cứu từ năm 1960.Những kết đạt lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật góp phần mở rơng quy mơ sản xuất chế phẩm enzyme ứng dụng protease thực tế V TRUNG TÂM HỌAT ĐỘNG: - Trong trung tâm họat động Protease VSV ngòai gốc amino acid đặc trưng cho nhóm cịn có số gốc amino acid khác.Ví dụ His thường tham gia trung tâm họat động protease-xerin,Protease-tiol,Tyrosine,trong trung tâm họat động Protease kim lọai - Trung tâm họat động Prôtease VSV đủ lớn bao gồm số gố amino acid số trường hợp có cofactơ kim lọai.Marihara tập thể (1969-1970) xác định trung tâm họat động subtilisin có kích thước giống nhau,vào khỏang 18 A0,tương ứng với 5-6 gốc amino acid - Các Protease kim lọai có trung tâm họat động lớn váo khỏang 21 ○A Đối với Protease acid,theo nhiều tác giả nghiên cứu cấu trúc trung tâm họat động tinh thể protease acid Rhizopus chinenis Endothia parasilica cho thấy phân tử protease gồm có hai hạt,giữa chúng có khe hở vào khỏang 20 ○A.Khe hở phần xúc tác 29 enzym,các gốc Asp-35 Asp-215 xếp đối diện khe ấy.Dây có lẽ kiểu cấu túc trung tâm họat động đặc trưng chung cho Protease acid.Ngịai nhóm –COOH theo Ichishida Yoshiđa1986),gốc Tryptophan đóng vai trị quan trọng Aspergilopeptidase A - Đối với Protease không chứa cysteine,trung tâm họat động chúng có tính mềm dẻo cấu trúc khơng gian chúng khơng giữ vững cầu disulphide - Mặc dù trung tâm họat động Protease VSV có khác ezym xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo chế chung sau: E + S E - S E - S + P1 E + P2 E enzim S chất E-S phức chất enzym-cơ chất P1 sản phẩm phản ứng(với nhóm amine tự tạo thành P2 sản phẩm thứ hai phản ứng(với nhóm carboxyl tự tạo thành) - Theo số tác giả,cơ chế tác dụng protease VSV giống với Protease xezin động vật,đều tiến hành theo kiểu xúc tác acidbazơ theo sơ đồ Polgar Bender (1969).Proteinase acid VSV có lẽ xúc tác cho phản ứng theo chế giống với pepsin VI CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM PROTEASE: Những kết đạt lĩnh vực nghiên cứu Protease VSV góp phần mở rộng qui mô sản xuất chế phẩm enzim ứng dụng enzym thực tế.Kết mở triển vọng to lớn nghiên cứu ứng dụng Protease - Để thu nhận chế phẩm Protease thừ VSV enzym khác dùng hai phương pháp ni cấy: phương pháp bề mặt(phương pháp nổi) phương pháp bề sâu(phương pháp chìm).Phương pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm sợi,phương pháp bế sâu thường dùng vi khuẩn nấm sợi - Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng,sử dụng phương pháp bề mặt kinh tế hơn.Vì sở sản xuất enzim xây dựng thường dùng phương pháp này.Hiện phương pháp bề mặt đượ sử dụng rộng rãi ở Nhật.Khi sử dụng phương pháp bề sâuthường dễ bị nhiễ hơn phương pháp bề mặt - Ở phương pháp bề mặt,người ta thường sử dụng mơi trường có độ ẩm giữ nhiệt độ khơng đổi.Trong suốt q trình ni,độ ẩm môi trường vào khỏang 50-55%w.Nhiệt độ nuôi cấy tùy thusộc vào VSV,đối với nấm sợi thời gain đầu từ 10-18 giữ 29-30 ○C,sau có 30 mixen giảm nhiệt xuống cịn 24-25 0C.Đối với vi khuẩn,nhiệt độ thích hợp 37-38 0C Một số mơi trường thích hợp cho VSV tổng hợp protease ngoại bào Thành phần môi trường(%) 1- Tinh bột khoai tây 2.00 Nước chiết ngô 1.00 (NH4)2HPO4 0.90 CaCl2 0.10 KCl 0.50 MgSO4 0.15 2- Bột ngô 3.00 Nước chiết ngô 0.50 CaCl2 0.10 (NH4)2HPO4 0.90 Nước chiết ngô 0.32 Cám lúa mì 3.31 Bột khoai tây 2.18 CaCO3 0.20 Dịch thủy phân enzyme 0.30 Glucose 1.00 MgSO4.7H2O 0.05 KH2PO4 (tính theo phospho) Vi sinh vật Tác giả Bac.meentericus Inlis, 1969 Bac.mesentericu Gatrep Luisk, 1970 Ortrosoko, 1977 Bac.subtilis Chứa 50mmg phospho 31 FeCl3.6H2O vệt Bột ngô 2.00 Bột đậu tương 1.00 Nấm men ăn 0.50 Nước chiết ngô 0.30 CaCO3 0.20 Bột mì 2.00 KH2PO4 0.500 MgSO4 ZnSO4 0.600 FeSO4 Casein 0.100 Bột đậu tương 1.120 Nước chiết ngô 0.670 CaCO3 0.100 Bột đậu tương 1.000 Tinh bột 4.000 KH2PO4 (NH4)2HPO4 0.065 ZnSO4.7H2O 0.002 FeSO4.7H2O 0.001 MnCl2.4H2O 0.001 Asp.oryzae 8FK Konovalov, 1972 pH ban đầu 6.25 pH cuối 8.25 Asp.awamori 78.2 Asp.oryzae 8F Konovalov Sakhov, 1972 Asp.oryzae 8F - Gatrep, Vojno, 1970 Acl.Fradiae Konovalov, 1972 32 Glucose 7.001 C6H5O7Na3 0.425 KH2PO4 (NH4)2HPO4 0.125 ZnSO4.7H2O 0.001 FeSO4.7H2O 0.002 MgSO4.7H2O 0.575 Pepton 0.500 Nước chiết nấm men 0.500 Casein thủy phân 0.100 NaCl 0.500 Fructose maltose 1.000 Act.Sphereides Egorov tập thể, 1976 Str.olivaceus Wojskowiez J 1977 pH = 7.2 Nuôi cấy nô bắng phương pháp bề mặt: - Mơi trường thường dùng cám,có PH từ 5.6-6.2(đối với nấm sợi) từ 6.2-7.29đối với vi khuẩn).Đối với đa số nấm sợi mesofil ni từ 32-42 giờ.Sau dùng nước hay dung dịch ni để chiết rút enzym khỏi môi trường,lọai bỏ phần không hịa tan,kết tủa enzym muối vơ hay dung môi hữu Nuôi cấy phương pháp bề sâu: - Chuẩn bị mơi trường thích hợp thùng lên men khử trùng.Sau làm lạnh,cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%.Sau thời gain nuôi cấy tiến hành kiểm tra họat độ enzym dịch môi trường nuôi cấy.Khi họat độ đạt đến cực đại cần nhanh chóng tách enzim khỏi tế bào VSV cách ly tâm hay lọc - Để có kết tốt cần xác định cho lượng oxi cần thiết thời gian sinh trưởng lọai VSV.Thể tích thùng lên men lớn khó khống chế yếu tố này.Ở Nhật thường dùng thùng lên men 20-30 m3.Theo tác giả Nhật,nên cấy trực tiếp vi khuẩn vào thùng lên men (chứ không qua giai đọan nuôi cấy trung gian) đảm bảo môi trường khỏi bị nhiễm 33 VII THU NHẬN ENZYM PROTEASE: Tách enzym: Như nói, để tách enzym từ mơi trường ni cấy VSV theo phương pháp bề mặt, dùng dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối pha loãng nước để chiết rút enzym Cho canh trường sau ni cấy vào dung dịch nói theo tỷ lệ thích hợp, khuấy lắc máy lắc thời gian xác định, lọc ly tâm, thu lấy dịch Trong sản xuất thường dùng nước máy để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích mơi trường, tiến hành chiết rút enzym Tiến hành theo phương pháp cho kết tốt Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào VSV hặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dich enzym Quá trình giai đoạn quan trọng khó khăn kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym Ở Nhật Bản tìm phương hướng thích hợp để làm nước chiết dịch môi trường nuôi cấy Theo tác giả Nhật nên lọc khơng nên ly tâm ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt độ enzym VIII MỘT SỐ KỸ THUẬT CHUNG TRONG NUÔI CẤY VI SINH VẬT THU NHẬN ENZYM : *Quy trình lên men cổ điển tiến hành theo giai đoạn sau : Chế tạo môi trường Khử trùng môi trường Lên men Nhân giống VSV Nhân giống cấp 1, 2, Kiểm tra tạo thành sản phẩm Thu hồi sản phẩm 34 Trong nuôi cấy VSV thu nhận enzym có số kỹ thuật chung số kỹ thuật riêng Những kỹ thuật chung bao gồm: - Kỹ thuật tạo giống - Lựa chọn phương pháp nuôi cấy - Thiết kế thiết bị nuôi cấy - Kỹ thuật lên men - Tách, tinh chế thu nhận enzym - Như vậy, có hai phương pháp ni cấy VSV thu nhận enzym: Phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp ni cấy chìm Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: Phương pháp nuôi cấy bề mặt: _Phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp tạo môi trường cho VSV phát triển bề mặt môi trường Trong nuôi cấy bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng sử dụng môi trường đặc (một số sách cịn gọi mơi trường bán rắn) 1.1 Môi trường lỏng - Ở môi trường lỏng, VSV phát triển bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) pha khí (khơng khí) Ở đây, VSV sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ khơng khí, tiến hành q trình tổng hợp enzym Enzym ngoại bào tách từ sinh khối hịa tan vào dung dịch mơi trường Enzym nội bào nằm sinh khối VSV Khơng khí Sinh khối VSV Khơng khí Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Enzym ngoại bào Dung dịch mơi trường Nuôi cấy bề mặt môi trường lỏng khay - Nuôi cấy VSV thu nhận enzym môi trường lỏng theo phương pháp nuôi cấy bề mặt thường tiến hành khay có chiều cao khoảng 12 – 15 cm, chiều rộng chiều dài thiết kế tùy theo kích thước phịng ni cho thuận tiện thao tác _Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng Nếu chiều cao môi trường lỏng lớn, VSV khả đồng hóa hết chất dinh dưỡng phía đáy khay ni cấy Nếu chiều cao mơi 35 trường nhỏ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzym không cao - Trong nhiều nhà máy, người ta tạo môi trường khay ni cấy có chiều cao moi trường từ – cm hợp lý 1.2 Môi trường đặc: - Phần lớn nhà máy sản xuất enzym, nuôi cấy VSV thu nhận enzym, người ta thường sử dụng môi trường đặc Để tăng khả xâm nhập khơng khí vào lịng mơi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường - Trong trường hợp này, VSV phát triển bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường sinh tổng hợp enzym nội bào ngoại bào Các enzym ngoại bào thẩm thấu vào hạt mơi trường, cịn enzym noi bào nằm sinh khối VSV - VSV không phát triển bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (mơi trường) pha khí (khơng khí) mà cịn phát triển bề mặt hạt môi trường, nằm hẳn lịng mơi trường Mơi trường ni cấy vừa có độ xốp cao vừa phải có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm cao làm bết mơi trường lại, khơng khí khơng thể thâm nhập vào lịng mơi trường, độ ẩm thấp q không thuận lợi cho VSV phát triển Thông thường người ta tạo độ ẩm khoảng 55 – 65%W hợp lý Khơng khí Sinh khối vi sinh vật Hạt môi trường Môi trường đặc Vi sinh vật phát triển bề mặt hạt môi trường Hạt Hạt môi truờng Nuôi cấy vi sinh vật môi trường đặc - Nếu sử dụng cám ngun liệu để ni cấy VSV thu nhận enzym, người ta phải cho thêm 20 – 25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho khơng khí dễ dàng xâm nhập vào lịng mơi trường 36 - Ưu điểm phương pháp nuôi cấy bề mặt dễ thực bị nhiễm VSV lạ, thường xảy tượng nhiễm cục bộ, ta dễ dàng xử lý - Nhược điểm: phương pháp ni cấy bề mặt có nhược điểm lớn tốn nhiều diện tích khó giới hóa, tự động hóa Phương pháp thích hợp cho ni cấy nấm sợi (nấm mốc), xạ khuẩn Phương pháp ni cấy chìm: - Phương pháp nuôi cấy bề mặt thay phương pháp ni cấy chìm để ni cấy vi khuẩn nấm men - Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng mơi trường lỏng thực thùng lên men (fermento) Trong thiết bị lên men, người ta thường lắp đặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh PH nồng độ chất dinh dưỡng Trong hệ thống điều hịa khơng khí hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa lớn 2.1 Tác động hệ thống thổi khí: - Người ta thường cung cấp khơng khí vào bể lên men máy nén khí (compressor) Khơng khí sau khỏi máy nén khí làm nguội, làm khử trùng Khơng khí phân phối vào thiết bị lên men ống dẫn khí có nhiều lỗ nhỏ Khi khơng khí vào bể lên men, chúng có tác động trực tiếp sau: * Làm xáo trộn mơi trường Nhờ dịng khí vận chuyển môi trường lỏng, chất dinh dưỡng, tế bào VSV phận phối khắp môi trường chúng luôn trạng thái động Nhờ trạng thái động vậy, khả tiếp xúc chất tế bào VSV cao Khả tiếp xúc cao bao nhiêu, khả sinh tổng hợp enzym cao nhiêu * Nhờ có máy nén hoạt động, khơng khí cung cấp thường xuyên, oxy tan môi trường VSV phát triển mạnh (đối với VSV hiếu khí) Như trình thúc đẩy VSV sinh sản phát triển * Dịng khí cung cấp liên tục thải liên tục kéo theo chất khí tạo q trình phát triển VSV Những chất khí tạo trình trao đổi chất thường gây ức chế trình trao đổi chất, sinh sản phát triển VSV Nhờ có dịng khí thổi vào mơi trường hạn chế ảnh hưởng xấu chất khí tạo từ trình trao đổi chất 2.2 Tác động hệ thống khuấy trộn: - Hệ thống khuấy trộn thiết kế lắp đặt thiết bị lên men không lên men hiếu khí mà lên men yếm khí Khuấy trộn q trình học có ý nghĩa lớn thiết bị thu nhận chế phẩm enzym Các tác động tóm tắt sau: 37 - Cánh khuấy làm xáo trộn môi trường nuôi cấy, làm thành phẩm môi trường tế bào VSV không lắng xuống, tăng khả tiếp xúc thành phần mơi trường VSV, từ làm tăng khả trao đổi chất VSV, lượng enzym tổng hợp tăng lên - Trong lên men hiếu khí có thổi khơng khí, cánh khuấy hoạt động làm tăng khả hịa tan oxy có khơng khí thổi vào mơi trường Khi đó, bọt khí, mặt bị vỡ nhỏ ra, tăng thiết diện tiếp xúc với dung dịch, mặt dịng khí khỏi dung dịch tồn lâu môi trường nước Thời gian tồn bọt khí lâu làm tăng khả tan oxy VSV đồng hóa oxy hịa tan khơng có khả đồng hóa oxy dạng tự Cánh khuấy làm tăng nhanh trình sinh sản vơ tính tác động học TÀI LIỆU THAM KHẢO - Website sinhhocvietnam.com - Website Từ điển bách khoa trực tuyến Wikimedia.org - Giáo trình Hóa Sinh Cơng Nghiệp – Lê Ngọc Tú - Công Nghệ Enzymes – Trần Đức Lượng - Website từ điển bách khoa toàn thư Việt Nam www.bachkhoatoanthu.gov.vn - Website hỗ trợ tìm kiếm www.google.com.vn, www.yahoo.com 38 - Báo điện tử www.vnexpress.net 39 ... cao Hiên sử dụng nguồn nguyên liệu sinh học để thu nhận protease : Các mô động vật, mô quan thực vật, tế bào vi sinh vật - Động vật : Thông thường protease động vật có tuyến tiêu hóa (niêm mạc... anson/1gam Ứng dụng công nghiệp sản xuất bia, da protein thu? ?? ngân - Protease từ nấm sợi : Protease từ nấm sợi thu? ??c protease acid, kiềm cảtrung tính Ứng dụng để sản xuất bia công nghiệp bánh kẹo thu? ??c... chế sau Có lợi ta sử dụng loạt phản ứng sinh hóa cần có chuyển hóa liên tục theo chuỗi phản ứng, ta không cần phải sử dụng nhiều nguồn enzym khác Nhưng ta cần thực phản ứng, đòi hỏi phải làm