THU NHẬN ENZYM :
Quy trình lên men cổ điển được tiến hành theo các giai đoạn sau :
Trong nuôi cấy VSV thu nhận enzym có một số kỹ thuật chung và một số kỹ thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm:
Chế tạo môi trường
Khử trùng môi trường Lên men Nhân giống VSV Nhân giống
- Kỹ thuật tạo giống
- Lựa chọn phương pháp nuôi cấy - Thiết kế thiết bị nuôi cấy
- Kỹ thuật lên men
- Tách, tinh chế thu nhận enzym
- Như vậy, cho đến nay có hai phương pháp nuôi cấy VSV thu nhận enzym: Phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm.
Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: 1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt:
_Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (một số sách còn gọi là môi trường bán rắn).
1.1. Môi trường lỏng
- Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzym. Enzym ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzym nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV.
Không khí Sinh khối VSV Không khí
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Enzym ngoại bào Dung dịch môi trường
Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay
- Nuôi cấy VSV thu nhận enzym trong môi trường lỏng theo phương pháp nuôi cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12 – 15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác.
_Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzym sẽ không cao.
- Trong nhiều nhà máy, người ta tạo môi trường trong khay nuôi cấy có chiều cao moi trường từ 5 – 7 cm là hợp lý.
1.2 Môi trường đặc:
- Phần lớn các nhà máy sản xuất enzym, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzym, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường.
- Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzym nội bào và ngoại bào. Các enzym ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzym noi bào nằm trong sinh khối VSV.
- VSV không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường, nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm cao quá sẽ làm bết môi trường lại, không khí không thể thâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta tạo độ ẩm khoảng 55 – 65%W là hợp lý.
Không khí
Sinh khối vi sinh vật Hạt môi
trường Môi trường đặc
Vi sinh vật
phát triển bề Hạt môi truờng mặt hạt môi trường
- Nếu sử dụng cám là nguyên liệu chính để nuôi cấy VSV thu nhận enzym, người ta phải cho thêm 20 – 25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho không khí dễ dàng xâm nhập vào lòng môi trường.
- Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi VSV lạ, thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ, ta rất dễ dàng xử lý. - Nhược điểm: phương pháp nuôi cấy bề mặt có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích và rất khó cơ giới hóa, tự động hóa. Phương pháp này chỉ thích hợp cho nuôi cấy nấm sợi (nấm mốc), xạ khuẩn.
2. Phương pháp nuôi cấy chìm:
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt dần dần được thay thế bằng phương pháp nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.
- Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men (fermento). Trong các thiết bị lên men, người ta thường lắp đặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh PH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí và hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn.
2.1 Tác động của hệ thống thổi khí:
- Người ta thường cung cấp không khí vào bể lên men bằng máy nén khí (compressor). Không khí sau khi ra khỏi máy nén khí được làm nguội, làm sạch và khử trùng. Không khí được phân phối vào thiết bị lên men bằng những ống dẫn khí có nhiều lỗ nhỏ. Khi không khí vào trong bể lên men, chúng có những tác động trực tiếp sau:
* Làm xáo trộn môi trường. Nhờ dòng khí vận chuyển trong môi trường lỏng, các chất dinh dưỡng, tế bào VSV sẽ phận phối đều khắp môi trường và chúng luôn luôn ở trạng thái động. Nhờ ở trạng thái động như vậy, khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào VSV sẽ rất cao. Khả năng tiếp xúc này càng cao bao nhiêu, khả năng sinh tổng hợp enzym sẽ cao bấy nhiêu.
* Nhờ có máy nén khi hoạt động, không khí được cung cấp thường xuyên, oxy sẽ tan trong môi trường và VSV sẽ phát triển mạnh hơn (đối với VSV hiếu khí). Như vậy đây là quá trình thúc đẩy VSV sinh sản và phát triển.
* Dòng khí được cung cấp liên tục và thải ra liên tục sẽ kéo theo những chất khí được tạo ra trong quá trình phát triển của VSV. Những chất khí được tạo ra trong quá trình trao đổi chất này thường gây ức chế quá trình trao đổi chất, sinh sản và phát triển của VSV. Nhờ có dòng khí thổi vào môi trường sẽ hạn chế ảnh hưởng xấu của các chất khí được tạo ra từ quá trình trao đổi chất.
2.2 Tác động của hệ thống khuấy trộn:
- Hệ thống khuấy trộn được thiết kế và lắp đặt trong các thiết bị lên men không chỉ trong lên men hiếu khí mà cả trong lên men yếm khí. Khuấy trộn là quá trình cơ học có ý nghĩa rất lớn trong thiết bị thu nhận chế phẩm enzym. Các tác động đó được tóm tắt như sau:
- Cánh khuấy làm xáo trộn môi trường nuôi cấy, làm các thành phẩm môi trường và các tế bào VSV không lắng xuống, tăng khả năng tiếp xúc
của các thành phần môi trường và VSV, từ đó làm tăng khả năng trao đổi chất của VSV, lượng enzym được tổng hợp sẽ tăng lên.
- Trong lên men hiếu khí có thổi không khí, cánh khuấy hoạt động sẽ làm tăng khả năng hòa tan của oxy có trong không khí khi được thổi vào môi trường. Khi đó, các bọt khí, một mặt bị vỡ nhỏ ra, tăng thiết diện tiếp xúc với dung dịch, một mặt dòng thoát khí khỏi dung dịch sẽ tồn tại lâu hơn trong môi trường nước. Thời gian tồn tại của các bọt khí lâu sẽ làm tăng khả năng tan của oxy. VSV chỉ có thể đồng hóa oxy hòa tan chứ không có khả năng đồng hóa oxy ở dạng tự do.
Cánh khuấy làm tăng nhanh quá trình sinh sản vô tính do tác động cơ học.