Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá khả năng sinh tổng hợp Exopolysaccharide (EPS) từ một số chủng Lactobacillus spp

Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá điều kiện tăng trưởng và khả năng sinh tổng hop EPS thô từ dich lên men của bốn chủng Lactobacillus plantarum, Lactobacillusacidophilus, Lactobaci

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM TP HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HOC

ĐÁNH GIA KHẢ NĂNG SINH TONG HỢP Exopolysaccharide (EPS) TỪ MỘT SÓ CHỦNG

Lactobacillus spp

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : NGUYÊN PHÚC LONG

Mã số sinh viên : 19126091

Niên khóa : 2019 — 2023

TP.Thủ Đức, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO |TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TONG HỢP Exopolysaccharide

(EPS) TỪ MỘT SÓ CHỦNG

Lactobacillus spp

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS LÊ VĂN HẬU NGUYEN PHÚC LONG

TP.Thu Đúc, 08/2023

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh

học Thành phố Hồ Chí Minh và lãnh đạo phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản đã tạo

điều kiện, hỗ trợ kinh phí, nguyên vật liệu và các trang thiết bị dé tôi hoàn thành khóa

luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cám ơn ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phó HồChí Minh, quý thầy cô trong Khoa khoa học Sinh học đã dạy dỗ, truyền đạt những kiếnthức, kinh nghiệm quý giá cho tôi trong suốt quá tình học tập tại trường

Tôi xin bay tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Lê Văn Hậu đãtận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện détôi hoàn thành tốt bài báo cáo này

Nhân đây, tôi xin gửi lời cám ơn đến các anh, chị Phòng Công nghệ Sinh họcThủy sản — Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ và tạo

điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và trau déi kinh nghiệm trong suốt thời

gian vừa qua.

Cuôi cùng, con xin gti lời cám on sâu sắc đên ba mẹ, cám ơn ba mẹ đã nuôi nâng dạy dỗ và yêu thương con, tạo điều kiện cho con được học, được rèn luyện bản thân, ba

mẹ là chỗ dựa, là động lực giúp con vượt qua mọi khó khăn

Tran trọng cam on!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi xin cam đoan day là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướngdẫn khoa học của ThS Lê Văn Hậu; mọi kết quả được trình bay trong cuốn khóa luận

này là được ghi nhận trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, không sao chép, trích

dẫn kết qua của bat kỳ tài liệu nghiên cứu khác

Họ tên: Nguyễn Phúc Long Lóp:DHI9SHD MSSV: 19126091

Số di động: 0985629471 Email: 19126091 @st.hemuaf.edu.vn

Thành phố Hồ Chi Minh ngày tháng năm 2023

Sinh viên thực hiện

NGUYÊN PHÚC LONG

TÓM TẮT

Lactobacillus thuộc nhóm các Lactic Acid bacteria; chúng có khả năng sinh tổnghợp exopolysaccharide (EPS), một loại polysaccharide ngoại bào được tiết ra môi

trường Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá điều kiện tăng trưởng và khả năng sinh

tổng hop EPS thô từ dich lên men của bốn chủng Lactobacillus plantarum, Lactobacillusacidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius Biểu đồ đường congsinh trưởng được xây dựng dựa trên theo dõi chi tiêu mật độ vi khuan sau các mốc thờigian nuôi 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Khảo sát điều kiện thu nhận sinh khối vi khuẩnbằng cách lên men ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau đồng thời xác định hàm lượngEPS thô và khả năng hòa tan EPS trong nước bằng phương pháp phenol — sunfuric Biểu

đồ đường cong tăng trưởng cho biết 24 giờ và 48 giờ là mốc thời gian tốt nhất đề thu

nhận sinh khối Điều kiện thu nhận tốt nhất là pH 6,0 ở 28°C sau 24 giờ lên men đối với

chủng Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum và

pH 5,0 ở 28°C sau 24 giờ lên men đối với chủng Lactobacillus salivarius EPS thu nhận

được có khả năng hòa tan trong nước rat tốt từ 88 — 91%

Từ khóa: đường cong tăng trưởng, EPS, Lactobacillus, phenol — sunfuric, kha nang

hòa tan.

Lactobacillus belongs to the group of Lactic Acid bacteria; they have the ability to biosynthesize exopolysaccharide (EPS), an extracellular polysaccharide secreted into the culture media The purpose of this study was to evaluate the growth conditions and the ability of biosynthesis crude EPS from the fermented juice of 4 strains of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, and Lactobacillus salivarius The growth curve graph was built based on monitoring the bacterial density after the time points of culture 0 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours Investigate the conditions for obtaining bacterial biomass by fermentation in different

culture conditions and at the same time determine the crude EPS content and the ability

to dissolve EPS in water by the phenol-sulfuric method The growth curve graph indicates that 24 hours and 48 hours are the best time points for biomass obtaining The best collection conditions were pH 6.0 at 28°C after 24 hours of fermentation for strains

of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus Lactobacillus fermentum and

pH 5.0 at 28°C after 24h of fermentation for Lactobacillus salivarius strain The obtained EPS has very good water solubility from 88-91%.

Keywords: EPS, Lactobacillus, growth curve, phenol — sulfuric, solubility.

MỤC LỤC

Trang

XÁC NHAN VA CAM DOAN ccsssssssstsstsstsstsststeststsstnstnstsstsetstststnetsatnanseenene i

THÔN: Tối esescnsonsncemanesunsemmanecuranso nese i

ABS TRAC D os scvsesssensonmenecsnnmamecceannes aarciuenve naan ame guarantees ốc iv IVINS) CIS OG ac ose eoreee coer are orev ee ceeereare een eee re eee eee v

DANH SÁCH CAC BANG ssssssssssssssstsssssstsstsstssssnstsssisstsstssisststiseinetsetistinetnet viiiDANH SÁCH CAC HINH sccscsssssstsstssssssssisssstststsstsstssiseistisestsstsstsstsetneieeet ix

RATE SE scat iS 1

CS eet 1

1.2 Mục tiêu đề tài - + 5-22 S2E221 212112121 211211112121111212121121021121 221212 errre 2II) (06400515701) 4,15 101117 2

CHUONG 2 TONG QUAN TAI LIỆU 55555222222222222tvvtt2222122222222122112111 x06 3

2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic ccc ceccccceccecceeessessesssessesseesessesssesseessessesstessessessseesees 3Qlcle LACODACIIUS PIGHATUT cxccceecwcosaesasvsceveveswesiisaworTse eRe ub TTT CT TERETE RTE 3 2.1.2 Lactobacillus 4.2)20 09ẠộaaaAaaAa.d A& 4 213%, LOCODACIING JEINOTIUND cca scscussssss sssmemsonstmamnusss ans wemaaunesxmsunsaeir eae macau sipeusepremnastea’ 5 2A As Bacto bacillus saliva ts ccxcccssseaccosseseec viscera sete cea oe sa A215 EEG EERIE 32.2 Tông quan về polysaccharide và exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 62.2.1 Tổng quan về polysaccharide - 2-2 2+2s22++2E122E2EE2212212212211221271 22 e2 62.2.2 Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic -2-©2z55522 62.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp

exopolysacCharlde ssazcptieii9s94EERSSIOEGEESSSEESEEEREESSESSGEOISEESOEGSDHSGISĐTGISSHSGIGGEĐI4GE0402148S:3.u8o9 / z2./2534.L¿ PH THÔI HHƯỜIE secsc:ssucerscsavesscenssenenascucemmnmnexan someone manera 7

2.2.3.2 NIi6t dO MUO CAY TT 82.2.3.3 Thời gian nuôi cấy 2 +©2s+2222122E222122122112212211211221211211211211 1121 2 ee 82.2.4 Điều kiện tách chiết và tinh chế exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy 82.3 Tình hình nghiên cứu exopolysaccharide từ vi khuẩn laetic 2-5-5 5+ 92,8: ÌNGEHIỆH-GỮU, WONG TU OC kinggsieenionnbisgssnintidstESE C0 CD0018036024074089000Đ09040301i0800303001803000g830 9

2.3 NSHICH €ỮU NSO MLO ceicneainnanieseidinndtigiies044408145114448833355588480S5059000400188 10CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -:-22:2222222222222Etttzrrrcce 123.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu - 2 2 2+22+22EE2EE2EE2EE2EE2EE2EE2EE2EEzEEzrxrrrrred 12

37, Vặt liêng lffEH EỆTHaxseessennninnonisndotiihititiostitEiSDS001000800090197315014005/0031001430080000000800 008 123.2.1 TH ts | ne Ta

cô na 4<54 123.2.3 / 8 oi j0 n6 12 3.3 Phương pháp nghiên cu - - 2252222 * 22% 22123122 231212 2111 1 1 1 re 13

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn, đo mật độ quang (OD) và trải

3.3.1.1, Xáo định đường cons tan HUONG -.c.ccssesscssscseoseacsvosmsesesesssasestessseeeaesosssvevsenns 133.3.1.2 Khảo sát anh hưởng của điều kiện nuôi cấy - 2 22 22222z+2+2zzz2+z+2 143.3.2 Phương pháp thu nhận và tách chiết EPS - 2-52 5cccxscrvsrrrcrrreee 14

3.3.3 Phương pháp phenol — SUnÍUTIC cece + +2 S21 2E 2 2E ri, 15

3.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan EPS trong nước - - 163.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 2-©2222222222212E1222122122112212212211221211 2212 xe 16

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUAN ccc222222222222222222222222222222222t ccce 17

4.1 Xác định đường cong tăng trưởng qua các mốc thời gian -2- 2-5522 172.2 Kết quả khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và sinh tổng hợpEPS Q2 2 2222 22212211211221211211111211221211211211211111112111111112121122 11111 ru 19

Di Desde diy TH TU HÌÌÌ sss guangg thotiLSEEASHA 08593858390983010186348.859GBHGBRERASRLHGDESHGBIDNHG.HESIBSEGHSESGHBCBORGEEEESB2088 20

P VN ) an nee< 23 2: s3, Lec [CPIM CULUIM cúagtit dạ gih ng A4314 lJA4EX 391 tapes 013825153383 3SEXS1SGESG3SSSANIXE3SS35L4E13S835E53G38854E0SE 26 Dis Ata dts JSHH-OGNIflsossisendairesoosilitsgronoiuosrdeoetrogsasdEuonsodirdsasooasgirlutosstorttrgtroktoitlsotostrrieigooggltilustsggiplEugxga 292.3 Kha năng hòa tan chế pham EPS trong nước . 2 -2-c5+c5s+cscscssce +33

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ -::¿22222222EEEEE221.2222111112221722 e, 35

5.1 KẾ luận - ¿2+ SE SE 2E2E22121211212111211111211111121111211111 01111112112 1111 21210 ra 35

ee ee 35TAT LW A ncasccccasesensconsintoncantennsermeasnonacmnnemanuasmanenmsoasaen 36TAI LIEU THAM KHẢO TIENG VIET c cccccccccccsecsessessessecsecsessessesseesesseeseesesseesese36TAI LIEU THAM KHAO TIENG NƯỚC NGOÀI o0 cocsccsscssesseeseseeseeseesessecsessvesseeee 36PHU LUC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

LAB : Lactic Acid bacteria

MRS : Man Rogosa Sharpe

PS : Polysaccharide

TCA : trichloroacetic acid

E.coli : Escherichia coli

1, : Lactobacillus

GRAS : Generally Recognized As Safe

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 4.1 Phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS của chủng

L plantarum giữa ba điều kiện tơi ưu được chọn lựa 2-222z22z+2zzzzscsee 22

Bảng 4.2 Phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS của chủng

L acidophilus giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa - 2-2-2 22s s+zzzzzxze+ 25

Bảng 4.3 Phan hang so sánh giá trị mat độ vi khuan và nồng độ EPS của chủng

L fermentum giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa 2+22+2z+zc2Ezzczzzrzex 28Bảng 4.4 Phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuân và nồng độ EPS của chủng

L salivarius giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa - 255 2+s2s+czzzczserxee 31Bảng 4.5 Độ hịa tan trong nước của các EPS từ bốn chủng L plantarum,

L acidophilus, L fermentum, Ù sSaÏÏVATÏMS - s55 55s Sscssesseeseeeserseeeseerseesre.33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đồ thu nhận va tách chiết EPS 2 2s ++SE+E£EE+EE2EEEEEEE2E22E2EEzEred 14 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc của bốn chủng -2- 2 22 2+S22S£2EE+E++EE2EE2E+zzxzzxez 17

Hình 4.2 Đường cong tăng trưởng của bốn chủng -2-©2222++22++22z+c2zze 18

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng tăng trưởng 20

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ va thời gian đến khả năng tổng hợp EPS 21

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng tăng trưởng 23

Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng tổng hợp EPS 24

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng tăng trưởng 26

Hình 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng tổng hợp EPS 37

Hình 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng tăng trưởng 29

Hình 4.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng tổng hợp EPS 30

ctv, 2011) Nhờ đặc tính khả năng giữ nước, EPS được sử dụng rộng rãi làm chất tạo

độ nhớt, ôn định và chất nhũ hóa trong ngành công nghiệp thực phẩm (Singh va ctv,

2017) EPS con được sử dụng dé cải thiện đặc tinh lưu biến, kết cau của bánh mi va

các sản phẩm sữa lên men như sữa chua và pho mát (Garai-Ibabe và ctv, 2010) Ngoài

ra EPS còn có các lợi ích sức khỏe như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, chốngviêm (Liu và ctv, 2010) và tác dụng làm giảm cholesterol, hạ huyết áp, (Wang vactv, 2014).

Dù có nhiều đóng góp trong y học và trong công nghiệp nhưng việc khai thác vàthương mại hóa EPS từ vi khuẩn nói chung và EPS từ vi khuẩn lactic (LAB - Lactic acidbacteria) nói riêng vẫn còn hạn chế vì sinh khối thu nhận thấp Từ khi LAB được “côngnhận là an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), cải thiện quy trình lấy và táchchiết EPS được coi là một cách tiếp cận hữu ích dé sản xuất EPS phù hợp cho các ứngdụng thực phẩm (Harutoshi, 2013) EPS được tổng hợp bởi LAB có kha năng cải thiệnkết cầu của bánh mì, cấu trúc các sản phẩm lên men như sữa chua, phô mai, (Nguyen

và ctv, 2020) Nhờ những điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với conngười ma EPS sinh tông hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn vớiEPS từ các loài khác (Luyen và ctv, 2018).

Thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và đặc tính ứng dụngtiềm năng của EPS được sinh tổng hợp bởi các chủng LAB khác nhau tùy theo loạichủng, điều kiện nuôi cay va thanh phan môi trường (Robijn va ctv, 1996) Su đa dang

về cau trúc của các loài vi khuẩn khác nhau sẽ có tác động lớn đến hoạt tính sinh hoc

và các đặc tính chức năng của EPS ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Vì vậy, đểnâng cao hiệu qua thu nhận EPS sinh tổng hợp từ một số chủng Lactobacillus sp., đề tài

“Đánh giá khả năng sinh tổng hợp Exopolysaccharide (EPS) từ một số ching

Lactobacillus spp.” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát điều kiện tăng trưởng và khả năng sinh tông hợp Exopolysaccharide (EPS)thô từ dịch lên men sinh khối 4 chủng L plantarum, L acidophilus L fermentum,

L salivarius chon lọc.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Xác định đường cong tăng trưởng và đánh giá điều kiện thu nhận sinhkhối vi khuẩn ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau trong quá trình lên men của bốn chủng

L plantarum, L acidophilus L fermentum, L salivarius.

Nội dung 2: Thu nhận sinh khối, tách chiết va xác định hàm lượngExopolysaccharide (EPS) thô của bốn chủng L plantarum, L acidophilus,

L fermentum, L salivarius.

Nội dung 3: Đánh giá khả năng hoa tan EPS trong nước của 4 chúng L plantarum,

L acidophilus L fermentum, L salivarius.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn LAB thuộc họ Lactobacteriacae, là vi khuẩn Gram dương có phản ứngcatalase và oxidase âm tính, sống trong điều kiện hiếu khí hoặc ky khí bắt buộc, không

di động và không có khả năng sinh bào tử LAB có thé lên men carbohydrate dé tạo ra

sản phẩm cuối cùng là lactic acid và được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp

thực phẩm cũng như sản xuất các chế phẩm sinh học nhờ khả năng tạo ra acid và mùi

thơm và có khả năng thủy phân protein (Wang và ctv, 2021) Các LAB bao gồm cả cầukhuẩn (Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus,Tetragenococcus, Streptococcus, Enterococcus) va trực khuan (Lactobacillus,Carnobacterium, Bifidobacterium) LAB (đặc biệt là các chi Lactococcus,Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus va Streptococcus) được sử dụng làm giéngkhởi đầu cho quá trình lên men của nhiều loại thực phẩm và đồ uống từ rat lâu vì chúng

đóng góp trong việc tạo hương vị cũng như là làm chậm quá trình hư hỏng Những quá

trình trên được cho là một trong những kỹ thuật về bảo quản thực phẩm lâu đời nhấtđược biết đến nay (De Vuyst và ctv, 2012) Ngày nay, LAB chủ yếu được kết hợp phổbiến trong các sản phẩm từ sữa (như pho mát, sữa chua, bơ sữa, kefir) hoặc khai tháclàm men vi sinh, chế biến thực phẩm hoặc chất bổ sung vào chế độ ăn uống tùy thuộc

vào tính nang probiotic nhằm cải thiện sức khỏe con người và vật nuôi (Halász, 2009)

Lactobacillus sp hay còn gọi là trực khuẩn Döderlein, là một chi vi khuẩn Gram

dương ky khí tùy tiện hoặc hiếu khí với 64 loài phố biến (De Vuyst và Vandamme,

2012) Chúng là nhóm lên men dị hình chính của ruột người, phát triển tối ưu ở

pH = 5.5 — 5,8 do đó có kha năng sống sót tốt trong hệ tiêu hóa của con người

2.1.1 Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum là vi khuẩn Gram dương, không gây bệnh, không có kha

năng di động và không sinh bao tử, khuẩn lạc tròn và trơn, màu trắng sữa, chúng lên

men ky khí tùy tiện và thường được sử dụng trong bảo quản các loại thực phẩm lên

men L plantarum thuộc nhóm vi khuẩn có bộ gen lớn nhất trong số các LAB, thường

được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, chúng cũng được tìm thấy trong

đường tiêu hóa và nước bọt của người (Waugh và ctv, 2009).

L plantarum có thé nang cao tinh toan ven, hoat động trao đổi chất của các tế baoruột, kích thích phan ứng miễn dich (Nissen va ctv, 2009), giảm thiểu một số triệuchứng tối loạn tiêu hóa khi điều trị bang kháng sinh ( Lönnermark va ctv, 2010) Ngoài

ra, chúng còn ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhay làm giảm độc tố doE.coli tiết ra nhằm bảo vệ tế bào biéu mô bằng cách thay đôi hình thái tế bao chủ, tăng

sức dé kháng và khả năng thâm thấu đơn lớp phân tử (Qin va ctv, 2009)

Nghiên cứu gần đây cho thay L plantarum có khả năng làm giảm cholesterol (Lim,2004), theo công bố của Dương Nhật Linh và ctv nam 2013 vi khuẩn Lactobacillusplantarum NT1.5 có khả năng làm giảm cholesterol thông qua việc hap thụ cholesterolqua mảng tế bào đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH đạ dày, khángmuối mật, kháng khuẩn

2.1.2 Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus là vi khuân Gram dương mạch ngắn, hình que, không di

động, không hình thành bào tử và không dung nạp muối, là vi khuẩn hiếu khí, lên menđồng hình được sử dụng phô biến trong lên men thực phẩm L acidophilus thuộc nhóm

các vi khuẩn sinh acid lactic, có kha năng ồn định nhiệt và duy trì hoạt động ở phạm vi

pH rộng cùng với khả năng ức chế chống lại vi khuan gây bệnh, khiến chúng được sửdụng như một chất bao quản sinh học L acidophilus có thé được thêm vào như mộtchất phụ gia trong nhiều quá trình lên men thực phẩm góp phần tạo nên hương vị và kếtcấu độc đáo (Anjum và ctv, 2014) Chúng thường có mặt ở ruột non và giúp giữ cânbằng hệ vi sinh vật đường ruột, duoc xem như một chất kháng sinh tự nhiên chống các

vi sinh vật có hai (Sanders va ctv, 2001).

Vi khuẩn 7 acidophilus có khả nang sản sinh acid lactic, lên men lactose, maltose,cellobiose, galactose, sucrose va không lên men được sorbitol, xyloseo, mannitol,

melezitose, rhamnose (Gomes và ctv, 1999) Đồng thời nó còn có kha năng sinh ra một

số chất kháng sinh mạnh bao gồm acidophilin, acidolin, lactocidin va bacteriocin trongruột có tác dụng ngăn chặn sự sinh trưởng của một số loài vi sinh vật gây bệnh baogồm Campylobacter listeria và Staphylococci Giúp ngăn ngừa tiêu chảy do kháng sinhgây ra và tiêu chảy cho đường tiêu hóa.

2.1.3 Lactobacillus fermentum

Lactobacillus fermentum là vi khuan Gram dương, thường được tìm thay trong cácsản phẩm lên men từ động vật va thưc vật Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có như cầudinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thé lên men các đường như glucose,fructose, maltose, sucrose, lactose Chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám vớiđường kính khoảng Imm Hình dạng khuẩn lạc này có thé lỗi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt

nhẫn Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc 7 fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ởtrung tâm khi được quan sát đưới kính hiền vi (Zhou và ctv, 2021) Hầu hết các tế bao

vi khuẩn được sắp xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo căp; chúng không có khả năng sinhbảo tử và không di động.

Chúng còn có giá trị thương mại lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng

tao gel, tạo kết cau, tạo độ đặc trong thực phẩm cùng những tác động có ích cho sức

khỏe như có tiềm năng probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung

thư (Mikelsaar va ctv, 2009; Pan va ctv, 2011).

2.1.4 Lactobacillus salivarius

Lactobacillus salivarius được phan loại trong nhóm GRAS (công nhận là vi sinhvật an toàn) được công nhận bởi Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA),chúng là một loại vi khuân Gram dương, không sinh bao tử, lên men đồng hình, tạo raacid lactic từ qua trình chuyén hóa carbohydrate, được đề xuất là chế phẩm sinh học

cho cả đường tiêu hóa và niệu sinh dục (Juarez Tomas và ctv, 2002) Ở động vật,

L salivarius thường được ứng dụng hỗ trợ cải thiện tình trạng miễn dịch và giảm sự

xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh

L salivarius được tìm thay tự nhiên trong đường tiêu hóa, sữa mẹ, âm đạo, khoangmiệng của con người và trong một số các nguồn khác 7 salivarius được phân lập từngười, động vật hoặc thực phẩm đã được nghiên cứu và tiết lộ rằng loài này rất đa dạng

về mặt di truyền, khi tiếp xúc với các điều kiện đường tiêu hóa, chúng bám dính mạnh

mẽ vào các tế bào ruột, kích thích sự biéu hiện của các gen mã hóa chất nhay, tao ra cachợp chat kháng vi sinh vật (lactate, acetate, va hydrogen peroxide), đồng thời thé hiệncác đặc tính điều hòa miễn dich, kháng viêm va kháng khuẩn in vivo và in vitro đối với

vi khuẩn gây bệnh (Langa và ctv, 2012)

2.2 Tổng quan về polysaccharide và exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

2.2.1 Tổng quan về polysaccharide

Polysaccharide (PS) là một dạng carbohydrate tự nhiên, mạch lớn thăng hoặc phân

nhánh tạo nên các tính chất đặc trưng riêng, được cấu tạo từ nhiều các phân tử đườngđơn hoặc dẫn xuất từ đường gọi là monosaccharide Chúng thường được coi là cácpolyme sinh học đa chức năng, một số chức năng được biết đến như: tạo nên cấu trúcvững chắc cho động vật hoặc thực vật (cellulose, chitin); là nguồn năng lượng dự trữ(tinh bột, glycogen); chat bao vé (exopolysaccharide cua vi sinh vat) (De Vuyst va

Degeest,1999).

PS là một chuỗi dai các monosaccharide liên kết với nhau bằng mối liên kếtglycoside, không có tính khử Tùy thuộc vào cau trúc mạch monosacchride mà cau tạo

giữa các PS cũng có sự khác nhau Homopolysaccharide (HoPS) hoặc homoglycan là

các PS chỉ chứa một loại monosaccharide, heteropolysaccharide (HePS) hoặcheteroglycan là các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide (Tran Thị Ái Luyện vàctv, 2018).

2.2.2 Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

Rat nhiều vi khuẩn có khả năng sinh tông hợp polysaccharide, các PS của chúng tạothành một nhóm lớn polymer sinh học có nhiều vai trò khác nhau Chúng có thé là mộtphan của thành tế bào (như j-glucan của nam), là chu chất (periplasmic) bảo vệ tế bao,

là một chat dạng nhờn ở trên các bề mặt giúp gắn kết tế bao này với tế bao khác (xanthan

và gellan) hay là một phan năng lượng dự trữ cho tế bào (như polyhydroxybutyrate), (Giavasis, 2013).

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thé sinh tổng hợp nhiều loại

PS khác nhau Tùy theo vi trí của chúng trên tế bào, các PS có thé là nội bào hoặc ngoạibào Những PS tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại bào Nếu PS ngoạibào bám chặt vào màng tế bào thì được gọi là PS dạng màng bao (nằm trong vùng chuchat) Còn néu chúng gan lỏng lẻo hoặc được tiết hoàn toàn ra môi trường như là cácchất nhờn thì được gọi là Exopolysaccharide (Cerning, 1995), chúng là những PS chuỗinhánh dài với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất củachúng PS dang màng bao thường rat khó dé tách chiết, tinh chế Dé thu nhận chúng canpha vỡ tế bào và tách ra các phân đoạn cần thiết dé loại bỏ các tạp chất khác trước khi

kết tủa EtOH Trong khi đó, EPS được tiết ra khỏi tế bào, thường dễ dàng tách chiếtbằng cách lọc hoặc ly tâm để loại bỏ các tế bào, sau đó kết tủa.

Thanh phan monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp là cơ sở dé phânloại EPS sinh tổng hợp từ LAB, chúng được thành 2 nhóm lớn: heteropolysaccharide(HePS) va homopolysaccharide (HoPS) (Badel và ctv, 2011; Sutherland, 1972) Quá

trình sinh tổng hop EPS bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB là một quá trình rat phức

tạp với rất nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi rất nhiều loại ezyme, quá trình này

có thê xảy ra ở bên trong hoặc bên ngoài tế bao (Patel va ctv, 2013)

Polysaccharide là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng ngàn phân tửmonosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết glycoside Để có thể sử dụngpolysaccharide ứng dụng vào thực phẩm thì việc hiểu được tính chất hòa tan củapolysaccharide là cực kỳ quan trọng vì hầu hết các chức năng của polysaccharide bao

gồm tính 6n định, đặc tính nhũ hóa, phân phối thuốc hay đặc tính tao màng v.v đều thu

được dưới dạng dung dịch (Guo va ctv, 2017).

2.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợpexopolysaccharide

Mặc dù có nhiều ứng dụng quan trong trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS

từ vi khuẩn vẫn bị hạn chế ở năng suất tạo thành thấp Đây là lý do khiến khả năng

thương mại hóa EPS từ vi khuẩn còn chưa cao Một phương pháp hữu ich dé quá trình

sinh tong hop EPS đáp ứng nhu cầu sử dụng hiện nay là cải thiện khả năng sinh tổnghợp EPS (Harutoshi, 2013) Năng suất của EPS từ LAB chịu tác động bởi các yếu tô hóahọc (nguồn C, N, tỉ lệ C/N, ), các yếu tố vật lý (nhiệt độ pH, thời gian lên men, ) do

đó, có thé điều chỉnh các điều kiện lên men nhằm tăng quá trình hình thành các polymer

sinh học này (Cerning, 1995).

2.2.3.1 pH môi trường

Quá trình sinh tổng hợp EPS có thể phụ thuộc vào độ pH Nhiều vi khuẩn có thểsinh tổng hợp EPS trong môi trường có pH trung tính, một số khác lại có thé sinh tổnghợp ở môi trường pH kiềm Các chủng vi khuân phân lập từ thịt có khả năng sinh pHtrong dung dịch đệm pH 5,2 — 6,5, pH môi trường thích hợp với hầu hết các vi khuẩnLAB sinh tổng hop EPS nằm trong khoảng 6 — 6,5, tuy nhiên vẫn có một số chủng vikhuẩn thích hợp với pH thấp hơn như L helveticus ATCC 15807 (4,5) (Torino và ctv,2005) hay L delbrueckii subsp bulgaricus RR (4,4 - 5,5) (Welman, 2015).

2.2.3.2 Nhiệt độ nuôi cấy

Một yếu té ảnh hưởng khá lớn đến kha năng sinh tổng hợp EPS đó là nhiệt độ nuôi

cấy Nhiệt độ tối ưu cho các chủng LAB ưa nhiệt đó là 44°C và các chủng ưa am khoảng25°C (Welman, 2015) Theo nhiều công bố thì nhiệt độ nuôi cấy tối ưu nhất cho các vikhuẩn LAB là 37°C (Górska-Fraczek va ctv, 2013; Jiang và Yang; 2018; Welman,2015) Riêng L plantarum KF5 sinh tông hợp EPS cao nhất khi ở 30°C (Wang va ctv,2010) va 25°C là nhiệt độ tốt nhất cho L rhamnosus (Gamar và ctv, 1997)

EPS thường được tổng hợp nhiều hơn nếu vi khuẩn được nuôi ở nhiệt độ thấp hơnnhiệt độ phát triển tối ưu do nhiệt độ thấp dẫn đến tốc độ sinh trưởng chậm, kéo dài giai

đoạn logarit Sự khác biệt này cũng có thé do hoạt động của các enzyme tham gia vào

quá trình tổng hợp các tiền chất của EPS tăng lên

2.2.3.3 Thời gian nuôi cấy

Mặc dù có sự tương đồng khá lớn về nhiệt độ nhưng thời gian nuôi cấy dé thu nhậnEPS từ LAB lại rất khác nhau, có thé kéo dai từ 18 giờ tới 72 giờ (Sharma và ctv, 2018;Van Calsteren và ctv, 2015) Tùy thuộc vào loải v1 khuẩn, sẽ có nhiều thời điểm để sinhtổng hợp EPS tối ưu Một số loài lượng EPS đạt cực đại trong giai đoạn tăng trưởng,nhưng cũng có một số loại đạt cực đại trong giai đoạn én định Một vài loài vi khuẩn,

sự sinh trưởng và tổng hop EPS xảy ra cùng một lúc (Suresh Kumar và ctv, 2007).2.2.4 Điều kiện tách chiết va tinh chế exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy

Quá trình thu nhận các polysaccharide ngoại bao của vi khuẩn từ môi trường lỏng

thường trải qua một số giai đoạn (Li và ctv, 2014; Nakajima và ctv, 1992; Pham va ctv,2000).

Loại bỏ protein, tế bao bang cách ly tâm hoặc loc Garcia — Garibay va Marshall(1991) đã dé xuất việc sử dung acid tricloroacetic (TCA) dé loại bỏ protein hoặc peptidetrong môi trường lên men Tuy nhiên, một phan lớn của EPS sẽ đồng kết tủa trong TCA

vì vậy cần phải rửa kết tủa ít nhất một hoặc hai lần dé thu được lượng EPS cao hon.Thu nhận các polymer kết tủa từ địch nổi phía trên bằng cách cho thêm tác nhân kết

tủa Đó là một dung môi hòa tan được trong nước trong đó các polymer không hòa tan(chắng hạn như methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetone)

Thu polymer kết tua bằng phương pháp sấy đông khô (quy mô phòng thi nghiệm)hoặc say trồng (quy mô công nghiệp)

2.3 Tình hình nghiên cứu exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

Đã có rất nhiều nghiên cứu về LAB trên thế giới trong những thập kỉ qua được công

bố Một số nghiên cứu tập trung về việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và điều kiệnthu nhận EPS Hầu hết các kết quả nghiên cứu được công bố đều là EPS đã được tinhsạch Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng công trình nghiên cứu về vi khuẩn lactic còn ratkhiêm tốn và có rất ít công trình nghiên cứu về tối ưu hóa hay đánh giá điều kiện môitrường nuôi cay Lactobacillus Các công trình đã công bố chủ yếu là các nghiên cứu xácđịnh điều kiện tách chiết, tính chất được lý, khả năng chống oxy hóa từ một số loại nam(Luyen và ctv,2018).

2.3.1 Nghiên cứu trong nước

Theo nghiên cứu của Trần Thị Hồng Hà và ctv năm 2013 hoạt tính sinh học củapolysaccharide và các hợp chất tách chiết từ nắm hương Poly 1 và ergosterol peroxide(NH3) có hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dong tế bào ung thư gan Hep-G2 (Ung thưbiểu mô tế bào gan) va RD (sarcom cơ vân) với giá trị IC50 là 29,62 và 34,24; lần lượt

là 3,84 và 7,61 ug/mL Poly 1 và NH3 cho thấy kha năng làm giảm mật độ khối u

Hep-G2 lần lượt là 54,09 và 58,33% so với đối chứng Ngoài ra, kích thước trung bình của

các khối u được điều trị bằng Polyl và NH-3 đã giảm lần lượt là 35,36 và 55,18% sovới đôi chứng

Theo nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi va ctv năm 2016, Nam Sò trắng (Pleurotusflorida) trồng tại Thừ Thiên Huế có chứa hàm lượng lớn tổng phenolic và tổngflavonoid Đánh giá lực kháng oxy hóa tổng cộng bằng mô hình phosphomolybdenumcho thấy tổng lực khang oxi hóa tổng của mẫu nam So trắng thấp hơn so với các mẫucủa nhóm nam Linh chi nhưng cao hơn so với nấm Tràm Nam Sò trắng có hàm lượngtriterpenoid dạng phytosterol tương đối thấp so với một số loài nam dược liệu (quytương đương 2,94 + 0,25 mg cholesterol/g mau) Polysaccharide trong phân đoạn PS-E32 (kết tủa trong ethanol 320) của nam So trang là hetero-glycan được cau tạo chủ yêu

từ bộ khung D-glucan và D-galactan với tỷ lệ mol các monosaccharide là D-glucose:D-galactose : D-ribose : D-xylose = 1,00 : 0,41 : 0,32 : 0,19 với các liên kết chủ yếu là

1—6-D-glucoside, —>I-D-glucoside, 1—5-D-riboside.

Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa và cấu trúc của Polysaccharide tách chiết namThượng hoàng (Phellinus linteus (Berk Et Curt.) Teng) được công bố vào năm 2017của Trần Thị Van Thi và ctv PS được tách chiết từ nấm Phượng Hoàng có hoạt tính

kháng oxy hóa thấp hơn so với curcumin nhưng hoạt tính thé hiện qua bắt gốc tự do thi

DPPH cao hơn.

Theo nghiên cứu của Trần Thị Ái Luyện năm 2019, chọn lọc được bốn chủng cókhả năng sinh tông hop EPS tốt là L fermentum TC13, TC1, TC21, MC3 Khảo sát điềukiện thu nhận EPS tốt nhất là sau 36 đến 48 giờ tròn môi trường có pH 5,5 — 6,0, ở nhiệt

độ 35°C - 40°C Tính chất hòa tan trong nước, giữ nước, giữ dầu của EPS thu được từ

cả bốn chủng trên là khá cao từ 73% - 87% rất có tiềm năng ứng dụng trong cong nghệthực phẩm

2.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Theo nghiên cứu của Fukuda và ctv (2010) điều kiện thu nhận EPS cao từ chủngLactobacillus fermentum TDS030603 khi nuôi trong môi trường MRS có pH = 6,5, ởnhiệt độ 30°C, nuôi cấy trong 72 giờ là 97,1 (ug/mL)

Cũng trong năm 2010, Wang và ctv đã báo cáo về điều kiện thu EPS cao nhất từ

chủng Lactobaillus plantarum KF5 được phan lập ở Tây Tạng, Trung Quốc khi bé sung

whey vào môi trường MRS đồng thời điều chỉnh pH môi trường về 6,5, lên men 6 30°C

trong 30 giờ là 95.58 (hg/mL)

Nhóm nghiên cứu của Wang va ctv (2015), đã tiến hành thí nghiệm với chủng

Lactobacillus plantarum YW32 đã được phân lập trong phòng thí nghiệm từ hạt Kefir

được thu thập từ Tây Tạng ở Trung Quốc Vi khuẩn được nuôi trong môi trường MRS

thương mại thông thường, điều kiện thu được EPS tinh sạch cao nhất là lên men ở 37°Ctrong 32 giờ sẽ thu được 90 (ug/mL) EPS đã tinh sạch.

Theo kết quả nghiên cứu được công bố vào năm 2006, Altaf và ctv đã tối ưu hóamôi trường thu acid lactic cho chủng Lactobacillus amylophilus GV6 bang cách sử dụngcác nguồn carbon, nitơ rẻ tiền như: bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho peptone,,glucose trong môi trường MRS bằng phương pháp Plackett-Burman va đáp ứng bề mặt(RSM) Kết quả cho thay Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% vànăng suất 96% (g acid lactic/ g tinh bột được sử dụng)

Vào năm 2012, nhóm Randhawa và ctv đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của quá

tình sản xuất đường mía) làm nguồn carbon trong môi trường tối ưu thu sinh khối của

vi khuân Lactobacillus delbrueckii Năng suất được phát hiện là bị ảnh hưởng bởi thờigian lên men, nhiệt độ và mức độ cơ chất Sản lượng axit lactic tối da đạt được sau 7

ngày lên men trong môi trường chứa 18% mức cơ chất ở 42°C Khả năng thu hồi tối đa

của axit lactic đối với hàm lượng đường tổng số ban đầu của môi trường là 78,30%

Năm 1995, Oh và ctv đã công bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton, caonam men, glucose, nhiệt độ nuôi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei YTT

9018 Kết quả tối ưu cho thấy các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L casei YTT

9018 có giá trị như sau: Tryptone, 3,04%; cao nắm men, 0,8929%; glucose,1,58%; nhiệt

độ nuôi cấy là 35°C

Theo nghiên cứu của Gorska-Fraczek và ctv năm 2013, hai chủng L johnsonii 151

và 142 được phân lập từ đường ruột của chuột được nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C trong môi

trường MRS và lên men trong 48 giờ Cả hai EPS khác nhau về khả năng phản ứng vớikháng huyết thanh EPS từ 7 johnsonii 151 phản ứng với kháng huyết thanh huyết thanh

đa dòng Lactobacillus chỗng lại các tế bào của năm chủng khác nhau, trong khi EPS từ

L johnsonii 142 được phát hiện chỉ phản ứng với kháng huyết thanh của chính nó

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ Sinhhọc Thành phó Hồ Chí Minh

Thời gian: Thang 3/2023 đến tháng 8/2023

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ

May ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf), máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R(Eppendorf) 13200 max, máy do quang phố UV-Vis (Thermo), máy do pH (MettlerToledo), may khuay từ (Stuart — UK), tủ cấy, tủ ủ lắc (Bioteck), tủ ủ 30°C (Memmert),

tủ ủ 28°C (Sanyo), tủ đông sâu âm 80°C, eppendorf, micropipet và dau tip phù hợp, quecấy trải và một số dụng cụ khác

3.2.2 Hóa chất

Hóa chất dùng dé giữ chủng vi khuẩn: Glycerol 15%

Hóa chat dùng dé dựng đường chuẩn và thực hiện phương pháp phenol — sulfuric:D-glucose (Cat#1.08342.1000, Merck), H2SO4 đậm đặc (Cat1.00731.1000, Merck), phenol (Cat#108.95.2, Xilong).

Hóa chat dé tủa: EtOH thuyệt đối 96% (Cat#Ch-B:713 9011) dùng dé tủa EPS thôHai môi trường được sử dung với bốn chủng vi khuẩn L plantarum, L acidophilus,

L fermentum, L salivarius là: MRS broth (Cat#GM369-500G, HiMedia) có bổ sung1% NaCl (cat#1.06404.1000, Merck) dùng để nuôi cấy vi khuẩn, MRS Arga(catM6411-500G, HiMedia) có bé sung 1% NaCl (cat#1.06404.1000, Merck), 0,75%CaCO; (CatM.W.:100.09, Xilong) dùng dé kiểm tra mật độ vi khuẩn

3.2.3 Vật liệu nghiên cứu

Bốn chủng vi khuẩn Lactobacillus: L plantarum, L acidophilus, L fermentum,

L salivarius phân lập ban dia từ ruột tôm, cá khu vực đồng bằng sông Cửu Long đã địnhdanh 16S RNA được cung cấp bởi phòng CNSH Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinhhọc Thành phó Hồ Chí Minh

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn, đo mật độ quang (OD) vàtrải đĩa đếm khuẩn lạc

3.3.1.1 Xác định đường cong tăng trưởng

Bốn chủng vi khuẩn L plantarum, L acidophilus, L fermentum, L salivarius từ Ốnggiống được tăng sinh 5% trong 10mL MRS lỏng (môi trường thương mại, pH: 6,7 — 6,8)

va nuôi trong tủ ủ lắc 28°C Sau 24 giờ, dich nuôi cấy được ly tâm 4°C ở 6000 vòng/phúttrong 15 phút dé loại bỏ dich nổi thu sinh khối, sau đó sinh khối được huyền phù bằng

nước vô trùng đã được hấp tiết trùng với thé tích bằng với thể tích ban đầu Dịch sinh

khối tế bảo vi khuẩn thu được sẽ được pha loãng và điều chỉnh đến giá trịOD6oonm + 1 - 1.2 (tương ứng với mật độ tế bào vi khuẩn ban đầu khoảng 10? CFU/mL)

Bồ sung 0,1 mL sinh khối tế bào vi khuẩn (đã điều chỉnh OD¢00um~ 1 — 1.2) vào

100 mL môi trường dinh dưỡng MRS lỏng dé nuối cấy bốn chủng vi khuẩn trên ở điềukiện 28°C, ủ lắc 200 rpm qua các mốc thời gian tăng trưởng: 0 giờ, 24 gid, 48 và 72 giờ.Biéu đồ đường cong sinh trưởng được xây dựng dựa trên theo dõi chỉ tiêu mật độ vikhuẩn sau các mốc thời gian nuôi 0 gid, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Pha loãng mẫu thu được

ở từng mốc thời gian theo dãy thập phân, tạo đĩa trải môi trường MRS Arga (môi trường

thương mại có bố sung 1% NaCl và 0,75% CaCOs), thực hiện cấy nhỏ giọt 0,01 mL

dịch khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau (mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần) U ởđiều kiện 28°C và thời gian thích hợp

Đếm khuẩn lạc, tính kết quả và xác định đường cong tăng trưởng Mật độ tế bao vikhuẩn được xác định bằng công thức:

V: Thể tích dịch khuẩn dùng để trải đĩa:

£: nồng độ pha loãng dịch khuẩn

3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng vàtông hợp EPS

Tạo các nghiệm thức thí nghiệm với các khoảng điều kiện nhiệt độ: 28°C, 30°C; thờigian: 24 giờ, 4§ giờ qua từng mốc pH 5,0; 6,0; 7,0 môi trường nuôi cấy Tương ứng vớitừng điều kiện nhiệt độ, thời gian và pH môi trường thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức và

Dịch khuẩn (đã được điều chỉnh OD) được bồ sung vào môi trường sinh dưỡng MRSlỏng tiếp tục lên men trong môi trường nuôi cấy có giá trị pH ban đầu khác nhau(5,0; 6,0; 7,0) ở nhiệt độ nuôi cấy 28°C va 30°C ủ lắc 200rpm qua 2 mốc thời gian

24 giờ và 48 giờ.

Thực hiện các bước lấy mẫu, pha loãng mẫu qua từng mốc thời gian như đã trìnhbày ở mục 3.3.1.1

3.3.2 Phương pháp thu nhận và tách chiết EPS (Yuksekdag và Aslim 2008)

Môi trường Dịch lên men từ Dịch nồi chứa

————> ————>

dinh dưỡng (1) các chủng LB (2) EPS (3)

(1) Bồ sung sinh khối tế bào EPS tủa

(2) Ly tâm 42G, 6000 vòng/ phit, 15 phút (4)

Bồ sung TCA 30%, lac 90 vòng/ phút, 40 phút

theo nhiệt độ phù hợp |

(3) Bồ sung Ethanol ( tỉ lệ dich nổi: Ethanol = 1:2),

giữ 24 giờ Phương pháp

Ly tâm 4°C, 6000 vòng/ phút, 15 phút Phenol - sulphuric (4) Hòa với nước vo trùng

Hình 3.1 Sơ đồ thu nhận và tách chiết EPS

Quá trình thu nhận và tách chiết EPS được thực hiện như Yuksekdag và Aslim năm

2008 có sửa đổi Tại mỗi mốc thời gian, lấy 10 mL dich lên men từ các chủng Lb (quá

trình lên men được trình bay ở mục 3.3.1.2) sau đó ly tâm 4°C ở 6000 vong/ phút trong

15 phút dé thu dịch nổi chứa EPS và protein, bổ sung acid trichloroacetic (TCA) 30%

để tủa protein trong 40 phút (Luyen và ctv, 2018) Tủa EPS bằng ethanol 96% trong

24 giờ (tỉ lệ dịch nỗi: ethanol = 1: 2) Hòa tan tủa EPS sau ly tâm thu được trong nước

vô trùng với thé tích bằng với thé tích địch lên men ban đầu (khoảng 10 mL) Dung dichnày được xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol — sulfuric

3.3.3 Phương pháp phenol — sunfuric

Nguyên tắc: dựa vào phản ứng thủy phân polysaccharide thành monosaccharide,monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bướcsóng A = 490nm Xây dựng đường chuẩn glucose sau đó đo mẫu thực rồi tinh ra lượngEPS.

Phương pháp thực hiện: 1 mL dung dịch có chứa EPS được trộn với 1 mL phenol

5% và 5 mL H2SO, đậm đặc, votex và hấp cách thủy 2 phút Làm nguội về nhiệt độphòng trong 30 phút Do ODøoun Tinh hàm lượng EPS dựa trên đường chuẩn glucose.Cách xây dựng đường chuẩn:

Cân chính xác 0,2500 (g) D-glucose cho vào bình định mức 250 mL, rồi định mức

bằng nước cat ta được dung dich A Như vay, nồng độ dung dich D-glucose là 1 mg/mL

Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, thu được cácgiá trị độ hấp thụ quang.

Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn glucose

3.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan EPS trong nước

Khả năng hòa tan trong nước của các EPS tách chiết từ dịch nuôi cấy các chủng

L plantarum, L acidophilus, L fermentum, L salivarius được thực hiện theo Ahmed

va ctv, 2013 có sửa đôi Cụ thé là ly tâm 13000 vòng/ phút, 4°C 1 mL dich sinh khốiEPS thu nhận theo sơ đồ hình 3.1 trong 15 phút, cặn EPS được hòa tan trong ImL nướccất vô trùng và khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Sau đó, dung dịch được lytâm ở 13000 vòng/ phút, 4°C trong 15 phút để tách EPS không tan Lượng EPS hòa tantrong nước được xác định bằng phương pháp phenol — sulfuric acid

Khả năng hòa tan được tính theo công thức sau:

Khối lượng của EPS trong dịch nổiKhả năng hòa tan (%) = , 7

Khôi lượng mau EPS

Tất cả thi nghiệm được lặp lại 3 lần

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thô được xử lý và tính toán bằng Excel 2016 Thống kê mô tả và trắc nghiệmphân hạng với số mẫu lặp lại là 3 và sai số giữa các thí nghiệm với mức ý nghĩa (p<0,05)bằng minitab 21

Số liệu trình bày ở dạng % + Std Trong đó Std (Standard Deviation) là độ lệchchuẩn cho thấy sự chênh lệch về giá trị của từng thời điểm đánh giá so với giá trị trungbình.

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định đường cong tăng trưởng qua các mốc thời gian

Trên môi trường MRS ở 28°C sau 36 giờ lên men chủng L plantarum phát triểnthành các khuẩn lạc tròn trơn màu trắng sữa, kích thước khoảng 1,5 mm (hình 4.1a), kết

quả này tương tự như kết quả của Waugh và ctv năm 2009 60 giờ là khoảng thời gian

cần thiết dé chủng 7 fermentum phát triền hình thành khuẩn lạc có màu trắng xám với

đường kính khoảng 1 mm (hình 4.1c), hình dạng khuẩn lạc có thé lồi lõm hoặc hơi lồi,

bề mặt nhẫn, đây cũng là kết quả được công bồ bởi Zhou và ctv năm 2021 ngoài ra trongcông bố này còn dé cập đến cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi được quan sát

dưới kinh hién vi đây cũng là một đặc điểm nổi bật của chủng 7 fermentum Cũng trong

nghiên cứu được công bồ của Zhou và ctv năm 2021, chủng 7 acidophilus hình thành

khuẩn lạc trang đục trơn bóng với kích thước đồng đều (hình 4 Ib) sau 72 giờ Cần nhiều

thời gian dé hình thành khuẩn lạc cụ thé là 120 giờ đối với chủng L salivarius, khuanlạc có màu trang tròn trơn, kích thước không đồng đều (hình 4.14), kết quả này cũnggiống như nghiên cứu của Valenzuela và ctv năm 2015

Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính của vi sinh vật sống Quá trình sinh

trưởng và phát triển này thường xảy ra qua bốn giai đoạn khác nhau Giai đoạn đầu tiên

là giai đoạn vi sinh vật chưa sinh sản mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi với môi trường

mới (pha lag — pha tiền phát); giai đoạn thứ hai pha lũy thừa (pha log), giai đoạn này tếbảo bắt đầu phát triển mạnh và tăng theo cấp lũy thừa, chất dinh dưỡng giảm nhanh do

su đồng hóa của vi sinh vật để tạo thành các sản phẩm thứ cấp Vì thế, dé tận thu đượctốt lượng sản phẩm tạo thành từ quá trình trao đôi chất của chúng thì việc kết thúc quátrình nuôi cấy ở cuối giai đoạn này là phù hợp nhất Giai đoạn thứ ba (pha cân bằng -pha ồn định) là giai đoạn mà quần thé vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động Tổng số tếbào mới sinh ra bao giờ cũng gần bằng tổng số tế bảo chết đi Và giai đoạn cuối cùng

được coi là giai đoạn suy vong, chất dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt, số lượng

tế bào chết sẽ tăng lên Chính vì vậy, trong quá trình nuôi cấy thu các sản phẩm thứ cấp,chúng ta cần xác định thời gian tăng trưởng tương ứng với các pha sinh trưởng của vikhuẩn để thu được lượng sản phẩm một cách tối đa

Thời gian (giò)

Hình 4.2 Đường cong tăng trưởng của bốn chủng L plantarum, L acidophilus,

L fermentum, L salivarius qua các mộc thời gian tăng trưởng.

Kết quả từ hình 4.2 cho thấy, cả bốn chủng vi khuẩn đều tăng sinh tốt, mật độ vi

khuẩn tăng nhanh trong 24 giờ dau, dat trạng thái cân bằng và cực đại sau 48 giờ nuôi

cấy Sau 48 giờ tốc độ tăng trưởng của cả bốn chủng vi khuẩn chững lại và có xu hướnggiảm Mật độ vi khuẩn cực đại của L plantarum, L acidophilus L fermentum,

L salivarius lần lượt là 6,93x108 CFU/mL, 5,10x108 CFU/mL, 7,73x108 CFU/mL,

4,50x108 CFU/mL sau 48 giờ tăng sinh trong môi trường MRS broth (môi trường

thương mai, pH 6,7- 6,8), ở nhiệt độ 28°C.

Theo nghiên cứu của Trần Thị Ngọc Ánh và ctv năm 2018 thời gian tăng sinh tốtnhất cho chủng vi khuẩn LAB là 24 giờ tuy nhiên trong thí nghiệm này sinh khối thu

được đạt cực đại ở mốc 48 giờ Vì vậy, 24 giờ và 48 giờ được lựa chọn làm mốc thời

gian đánh giá điều kiện thu nhận sinh khối của bốn chủng vi khuẩn L plantarum,

L acidophilus L fermentum, L salivarius ở thí nghiệm tiếp theo

4.2 Kết quả khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và sinhtông hợp EPS

pH ban đầu của môi trường, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy là những yếu tố ảnh

hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của các loại vi sinh vật,

đặc biệt là vi khuẩn lactic

Nhiều vi khuẩn sinh trưởng và tổng hợp EPS trong môi trường pH trung tính, một

số trong môi trường pH có tính acid (Cerning, 1990) Vì vậy, sự thích ứng với các giá

trị pH của các chủng vi khuẩn khác nhau là không giống nhau

Nhiệt độ cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và tạo hợp chấtthứ cấp của vi sinh vật Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu nhất định déphát triển và ở nhiệt độ này sự phát triển của vi sinh vật xảy ra thuận lợi nhất Nguyênnhân của sự ảnh hưởng nay là do vi sinh vật hầu hết có cấu tạo đơn bào nên chúng rấtnhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ và thường bị biến hóa cùng với sự thay déi của nhiệt

độ xung quanh.

Mặc dù các thông số quan trọng về mặt công nghệ trong công nghiệp như pH, nhiệt

độ tối ưu cho các chủng đã được biết rõ nhưng hoạt động về các đặc tính tăng trưởngđịnh lượng như tốc độ tăng trưởng, năng suất tăng sinh khối vi khuẩn với sự thay đối

pH nhiệt độ và yếu tố ảnh hưởng khác được nghiên cứu còn tương đối kém (Adamberg

và ctv, 2003) Do đó nghiên cứu này đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy và

thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng, tạo sinh khối vi khuẩn vả khả năng sinhtổng hợp EPS trên từng cum pH môi trường nuôi cấy.

Mắc 48 giờ Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ

b)

9,30

a

9,00 8,70 8,40 8,10 7,80 7,50

28°C 30 28°C 30°C

Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ

c)

Hinh 4.3 Anh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng của

vi khuân L plantarum qua từng mộc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.

Kết quả từ hình 4.3 cho thay rằng, quá trình tăng trưởng của chủng L plantarumqua từng mốc pH đều đạt cực đại sau 24 giờ lên men cụ thé mật độ vi khuẩn cao nhấttrong môi trường pH 5,0 là 1,04 x 10° CFU/mL khi nuôi ở nhiệt độ 30°C, môi trường

pH 6,0 là 1,17 x 10° CFU/mL và 1,50 x 10° CFU/mL với môi trường pH 7,0 ở nhiệt độ 28°C.

Có một điểm chung giữa ba mốc pH được thể hiện rõ trên hình 4.3 là sự ảnh hưởngcủa nhiệt độ đến quá trình tăng trưởng là không rõ ràng, không có sự khác biệt có ýnghĩa giữa hai nhiệt độ khi phân tích thống kê (p<0,05)

Yếu tố thời gian là yếu tố duy nhất gây ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất tạo sinhkhối của chủng L.plantarum trong cả ba điều kiện pH này, kết quả phân tích thống kêcho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình khi thu nhận sinh khối ở

24 giờ và 48 giờ Do đó thời gian tốt nhất cho quá trình tăng sinh chủng L plantarum là

24 giờ.Không giống quá trình tăng trưởng, yếu tố nhiệt độ và thời gian lại có tương tácvới nhau cùng tạo nên sự khác biệt có ynghia giữa các nghiệm thức thu nhận EPS vớimức ý nghĩa p<0,05 được thể hiện qua hình 4.4

Tương tự như pH 5,0 thông qua kết quả phân tích thống kê cho thấy nồng độ EPScao nhất khi nuôi trong môi trường có pH bang 6,0 là 829,14 g/mL với điều kiện nhiệt

độ 28°C lên trong trong 24 giờ.

Khác biệt lớn nhất khi thu nhận EPS là ở mốc pH 7.0 vì khi nhìn vào hình 4,2c cóthé thay sau 48 giờ lên men không thu được sinh khối vi khuẩn ở cả 3 lần lặp lại nhưngbiểu đồ hình 4.4c cho kết quả thu nhận EPS ở mốc thời gian này cao hơn so với mốc 24giờ cụ thé nồng độ EPS thu được ở điều kiện 28°C là 699,73 g/mL và 763,65 pg/mL ở30°C Điều này chứng tỏ, EPS thu nhận không ty lệ thuận với sinh khối vi khuẩn, du vikhuẩn đã chết hoàn toàn ở mốc 48 giờ nhưng EPS tiết ra trước thời gian đó vẫn tồn tạitrong dịch lên men và với mục đích thu nhận nhiều EPS nhất thì nhiệt độ 30°C lên men

48 giờ là điều kiện thu nhận EPS tốt nhất trong môi trường có pH 7.0

Thực hiện phân tích thống kê, trắc nghiệm phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuẩn

và nồng độ EPS giữa ba điều kiện tối ưu lựa chọn Kết quả được trình bay ở bang 4.1Bảng 4.1 Phân hang so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS của chủng

L plantarum giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa

; Mật độ tối ưu EPS tối ưu

Moc pH

(log CFU/mL) (ug/mL) 5,0 8,97° 817,378 6,0 9,062 829,142

7,0 - 763,65

p value 0,000 0,003 Trong cùng một cội, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về

mat thông ké(p<0,05) pH 5,0: 28°C, 24 giờ; pH 6,0: 28°C, 24 giờ; pH 7,0: 30°C, 48 giờ.

Có thể thấy rằng điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 28°C, 24 giờ lên men trong môi

trường có pH ban đầu bằng 6,0 đạt hiệu quả tổng hợp EPS cao nhất Theo như kết quảđược công bồ bởi Fu va ctv, 1999 độ pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào đồng thời

sản sinh ra các hợp chất thứ cấp nằm trong khoảng từ 5,0 đến 6,0 phù hợp với kết quảcủa bài nghiên cứu này, ngoài ra còn có nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp EPS của

L plantarum KF5 trong môi trường MRS có bổ sung whey dat cao nhất tại pH 6,3(Wang và ctv, 2010).

4.2.2 L acidophilus

Kết qua thu nhận sinh khối được trình bày bời biểu đồ hình 4.5 cho thay yếu tổ nhiệt

độ và thời gian nuôi cấy tương tác với nhau cùng gây ảnh hưởng đến quá trình tăng

trưởng của chủng L acidophilus tạo sự khác biệt giữa các nghiệm thức lên men.

Hinh 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng của

vi khuân L acidophilus qua từng móc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.

Biéu đồ hình 4.5 cho thấy rõ mật độ vi khuân ở mốc 48 giờ cao hơn han so với mốc

24 giờ và cùng đạt giá trị cực đại khi lên men ở điều kiện 28°C với giá tri tại các mốc

pH 5,0; 6,0; 7,0 lần lượt là 6,61 x 108 CFU/mL, 5,57 x 108 CFU/mL và5,84 x 108 CFU/mL Vì vậy 48 giờ lên men ở nhiệt độ 28°C là điều kiện thích hop délên men chung L acidophilus.

Tuy nhiên 48 giờ không phải là khoảng thời gian tốt nhất cho quá trình sinh tổnghop EPS của chủng này khi kết quả thu nhận EPS được biểu dién bởi biểu đồ hình 4.6lại cho thấy 24 giờ lên men mới là khoảng thời gian phù hợp cho việc thu nhận EPS.

Hình 4.6 cho thấy nồng độ EPS khi thu nhận tại mốc 24 giờ có giá trị cao hơn mốc

48 giờ ở cả ba pH Khi thu nhận EPS từ chủng L acidophilus được lên men trong môitrường có pH ban dau là 5,0 và 7,0 chỉ có yêu tô thời gian nuôi cấy là ảnh hưởng đếnquá trình tổng hợp EPS Kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa haimoc thời gian 24 giờ và 48 giờ, nồng độ EPS cao nhất khi lên men trong môi trường có

pH ban đầu bằng 5,0 là 837,37 „g/mL khi lên men ở 28°C va 900,51 g/mL trong môi

trường có pH 7,0 ở cùng nhiệt độ.

Với môi trường có pH bằng 6,0 yếu tố thời gian và nhiệt độ nuôi cấy tương tác vớinhau tạo sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị EPS thu được (p<0,05) Nồng độ EPScao nhất là 958,16 g/mL khi thu nhận ở điều kiện nhiệt độ 28°C sau 24 giờ lên men và

có xu hướng giảm mạnh trong 24 giờ tiếp theo khi chỉ thu được 711,10 g/mL ở cùngđiều kiện nhiệt độ

Với kết quả từ hình 4.5 và hình 4.6 có thể thấy quá trình sinh tổng hợp EPS của

chủng L acidophilus không phụ thuộc vao sinh khối thu nhận Việc thu nhận sinh khối

sẽ đạt hiệu quả cao ở cả hai nhiệt độ 28°C và 30°C sau 48 giờ lên men nhưng với mụctiêu thu nhận EPS thì 24 giờ lên men ở nhiệt độ 28°C là điều kiện tốt nhất cho quá trìnhtổng hợp EPS của chủng L acidophilus

Kết quả so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS tại các điều kiện tối ưu ở

ba mốc pH cho thấy mật độ vi khuẩn ở pH 5,0; 6,0 và 7,0 là không có sự khác biệt nhưngnồng độ EPS thu nhận khi lên men trong môi trường có pH 6,0 lại cao vượt trội so vớihai pH còn lại (kết quả được biểu diễn ở bảng 4.2)

Bảng 4.2 Phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuan và nồng độ EPS của chủng

L acidophilus giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa

„ Mật độ tôi ưu EPS tối ưuMoc pH

(log CFU/mL) (ug/mL)

; Ti rong cùng mot cột, các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt

về mặt thống ké(p<0,05) pH 5,0: 28°C, 24 giờ; pH 6,0: 28°C, 24 giờ; pH 7,0: 30°C, 48 gio:

Theo nghiên cứu của Tomas va ctv năm 2003, điều kiện tối ưu nhất cho sự phát triển

và sản xuất acid lactic của L acidophilus là pH 6,5 hoặc 8,0 được nuôi cấy ở 37°C Vàonăm 1998, Bogoviš-Matijašié và Rogelj đã nghiên cứu sản xuất phức hop bacteriocin

bởi chủng L acidophilus LF221 thu được lượng phức hợp cao nhất

(106 AU/mL) trong môi trường MRS có pH 6,5 Có thé thấy pH 6,5 là điều kiện tối ưucho quá trình phát triển của L acidophilus và đây cũng là giá trị pH tiệm cận với điềukiện tôi ưu trong nghiên cứu này.

28°C 30°C 28°C 30°C

Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ

c)

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng của

vi khuân L fermentum qua từng mộc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.

Ở pH 5,0 (Hình 4.7a), hai yếu tố thời gian và nhiệt độ cùng tác động đến sự tăng

trưởng của vi khuẩn, tạo nên sự khác biệt về mật độ vi khuẩn giữa các nghiệm thức

Biểu đồ 4.6a cho thấy mật độ vi khuẩn đạt cao nhất với nghiệm thức 30°C ở cả hai mốcthời gian nuôi cấy 24 giờ và 48 giờ (7,25 x 108 CFU/mL ở 24 giờ và 8,41 x 108 CFU/mL

ở 48 giờ), tuy nhiên, kết quả phân tích không có khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê

giữa 2 nghiệm thức Ở pH 6,0 (Hình 4.7b), ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ lên sựphát triển của vi khuẩn tương tự như mốc pH 5,0, mật độ vi khuẩn giữa các nghiệm thức

có khác biệt có ý nghĩa, đồng thời, 2 nghiệm thức vi khuẩn nuôi cấy tại nhiệt độ 30°C,

ở cả 2 mốc 24 và 48 giờ cũng đạt mật độ cao nhất (2,33 x 108 CFU/mL ở 24 giờ và

Ở pH 7,0 (hình 4.7c), ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn không rõ

ràng, kết quả ở cùng mỗi mốc thời gian, mật độ vi khuẩn của 2 nghiệm thức thay đổinhiệt độ không có khác biệt có ý nghĩa với nhau Thay vào đó, yếu tố thời gian lại là yếu

tố ảnh hưởng chủ yếu đến sự tăng trưởng của vi khuẩn này, cụ thể là có sự khác biệtgiữa 2 mốc thời gian 24 giờ và 48 giờ với mật độ vi khuẩn dat cao nhất ở 24 giờ là9,36 x 108 CFU/mL ở điều kiện nhiệt độ 30°C

Khả năng sinh tổng hợp EPS là chỉ tiêu được quan tâm chính yếu trong nghiên cứu

nay Nồng độ EPS trong dịch nuôi cấy cũng được khảo sát dé đánh giá sự ảnh hưởngcủa các điêu kiện nuôi cây lên chủng v1 khuân này.

Kết quả định lượng nồng độ EPS có trong dịch nuôi cấy vi khuẩn của các nghiệm

thức khảo sát được trình bay trong biểu đồ hình 4.8 Ở pH 5,0 và 6,0 (hình 4.8 a, b),

nồng độ EPS giữa các nghiệm thức đều có sự chênh lệch nhất định và có sự khác biệt

có ý nghĩa khi phân tích thống kê Dựa vào kết quả định lượng EPS và đếm mật độ vi

khuẩn, lựa chọn nghiệm thức vi khuẩn nuôi cấy ở điều kiện 28°C, 24 giờ làm điều kiệnnuôi cấy vi khuẩn tối ưu ở pH 5,0 và pH 6,0 Ở điều kiện pH 7,0 (hình 4.8c), kết qua

định lượng EPS cho thấy cả yếu té thời gian và nhiệt độ đều làm thay đôi giá tri EPS,

nồng độ EPS cao nhất dat 935,02 g/mL ở 30°C, 48 giờ nuôi cấy, tuy nhiên không cókhác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức 28°C, 48 giờ, 28°C, 24 giờ Cùng với kết quamật độ vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy ở 30°C, 48 giờ được lựa chọn làm điều kiện tối ưucho hiểu quả sinh tổng hợp EPS cao nhất ở mốc pH này

Dé lựa chọn được điều kiện tối ưu nuôi cấy cho hiệu quả thu nhận EPS cao nhất,

thực hiện phân tích thống kê và trắc nghiệm phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuẩn

và nồng độ EPS trong dịch nuôi cấy ở điều kiện tối ưu của mỗi mốc pH, kết quả đượctrình bay trong bảng 4.3 Giá trị nồng độ EPS là giá trị được quan tâm và tập trung khaithác của nghiên cứu, dựa vào kết quả thống kê cho thấy, ở điều kiện pH 6,0, 28°C nuôicấy trong vòng 24 giờ cho phép thu nhận giá trị EPS cao nhất đạt 1032,28 g/mL

Bang 4.3 Phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS của chủng

L fermentum giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa

; Mật độ tối ưu EPS tối ưu

mặt thống kê (p<0,05) (pH 5,0: 28°C, 24 giò; pH 6,0: 28°C, 24 giờ; pH 7,0: 30°C, 48 giỏ).

Điều kiện pH 6,0 cũng phù hợp với một số nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiệnnuôi cấy ching L fermentum Sự phát triển và tong hợp EPS bởi chủng L fermentum

F6 được phân lập từ các sản phẩm sữa truyền thống của Trung Quốc được nghiên cứu

khi nuôi cấy trong môi trường chứa 10% (w/v) sữa tách béo với điều kiện lên men khác.Kết quả cho thấy điều kiện pH 6,5 ở nhiệt độ 37°C cho sự phát triển tối ưu nhất (Zhang

và ctv, 2011) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh EPS của một số chủng

LAB tương ứng là L fermentum TDS030603, S thermophilus ST1 (Fukada va ctv,

pH 6,0 Thời gian và nhiệt độ trong nghiên cứu này không giống với những bài nghiên

cứu đã công bó có thé do sự khác biệt về môi trường nuôi cay, chủng vi khuẩn

4.2.4 L salivarius

Tương tự 3 chủng vi khuẩn trên, mật độ vi khuan và nồng độ EPS cũng được địnhlượng dé đánh giá sự anh hưởng của các yếu tô môi trường nuôi cấy bao gồm pH, nhiệt

độ, thời gian nuôi cấy đến sự tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợp EPS của

L.salivarius Kết quả được trình bày dưới dạng biểu đồ hình 4.9 và 4.10

Hinh 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến kha năng tăng trưởng của

vi khuân L salivarius qua từng moc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.