4.1. Xác định đường cong tăng trưởng qua các mốc thời gian
Trên môi trường MRS ở 28°C sau 36 giờ lên men chủng L. plantarum phát triển thành các khuẩn lạc tròn trơn màu trắng sữa, kích thước khoảng 1,5 mm (hình 4.1a), kết quả này tương tự như kết quả của Waugh và ctv năm 2009. 60 giờ là khoảng thời gian cần thiết dé chủng 7. fermentum phát triền hình thành khuẩn lạc có màu trắng xám với đường kính khoảng 1 mm (hình 4.1c), hình dạng khuẩn lạc có thé lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẫn, đây cũng là kết quả được công bồ bởi Zhou và ctv năm 2021 ngoài ra trong công bố này còn dé cập đến cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi được quan sát dưới kinh hién vi đây cũng là một đặc điểm nổi bật của chủng 7. fermentum. Cũng trong
nghiên cứu được công bồ của Zhou và ctv năm 2021, chủng 7. acidophilus hình thành khuẩn lạc trang đục trơn bóng với kích thước đồng đều (hình 4. Ib) sau 72 giờ. Cần nhiều thời gian dé hình thành khuẩn lạc cụ thé là 120 giờ đối với chủng L. salivarius, khuan lạc có màu trang tròn trơn, kích thước không đồng đều (hình 4.14), kết quả này cũng giống như nghiên cứu của Valenzuela và ctv năm 2015.
Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính của vi sinh vật sống. Quá trình sinh trưởng và phát triển này thường xảy ra qua bốn giai đoạn khác nhau. Giai đoạn đầu tiên
là giai đoạn vi sinh vật chưa sinh sản mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi với môi trường
mới (pha lag — pha tiền phát); giai đoạn thứ hai pha lũy thừa (pha log), giai đoạn này tế bảo bắt đầu phát triển mạnh và tăng theo cấp lũy thừa, chất dinh dưỡng giảm nhanh do su đồng hóa của vi sinh vật để tạo thành các sản phẩm thứ cấp. Vì thế, dé tận thu được tốt lượng sản phẩm tạo thành từ quá trình trao đôi chất của chúng thì việc kết thúc quá trình nuôi cấy ở cuối giai đoạn này là phù hợp nhất. Giai đoạn thứ ba (pha cân bằng - pha ồn định) là giai đoạn mà quần thé vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động. Tổng số tế bào mới sinh ra bao giờ cũng gần bằng tổng số tế bảo chết đi. Và giai đoạn cuối cùng được coi là giai đoạn suy vong, chất dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt, số lượng tế bào chết sẽ tăng lên. Chính vì vậy, trong quá trình nuôi cấy thu các sản phẩm thứ cấp, chúng ta cần xác định thời gian tăng trưởng tương ứng với các pha sinh trưởng của vi khuẩn để thu được lượng sản phẩm một cách tối đa
9,50 9,00 8,50 8,00
7,50 ơơ
====L. acidophilus 7,00
—[. fermentum 6,50 ơ
====L. salivarius
Mật độ (Log CEU/mL) 6,00 ====L. plantarum
5,50 5,00 4,50
0 24 48 72 Thời gian (giò)
Hình 4.2. Đường cong tăng trưởng của bốn chủng L. plantarum, L. acidophilus,
L. fermentum, L. salivarius qua các mộc thời gian tăng trưởng.
Kết quả từ hình 4.2 cho thấy, cả bốn chủng vi khuẩn đều tăng sinh tốt, mật độ vi khuẩn tăng nhanh trong 24 giờ dau, dat trạng thái cân bằng và cực đại sau 48 giờ nuôi cấy. Sau 48 giờ tốc độ tăng trưởng của cả bốn chủng vi khuẩn chững lại và có xu hướng giảm. Mật độ vi khuẩn cực đại của L. plantarum, L .acidophilus. L. fermentum, L. salivarius lần lượt là 6,93x108 CFU/mL, 5,10x108 CFU/mL, 7,73x108 CFU/mL,
4,50x108 CFU/mL sau 48 giờ tăng sinh trong môi trường MRS broth (môi trường thương mai, pH 6,7- 6,8), ở nhiệt độ 28°C.
Theo nghiên cứu của Trần Thị Ngọc Ánh và ctv năm 2018 thời gian tăng sinh tốt nhất cho chủng vi khuẩn LAB là 24 giờ tuy nhiên trong thí nghiệm này sinh khối thu được đạt cực đại ở mốc 48 giờ. Vì vậy, 24 giờ và 48 giờ được lựa chọn làm mốc thời gian đánh giá điều kiện thu nhận sinh khối của bốn chủng vi khuẩn L. plantarum, L. acidophilus. L. fermentum, L. salivarius ở thí nghiệm tiếp theo.
4.2. Kết quả khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và sinh tông hợp EPS
pH ban đầu của môi trường, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy là những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của các loại vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn lactic.
Nhiều vi khuẩn sinh trưởng và tổng hợp EPS trong môi trường pH trung tính, một số trong môi trường pH có tính acid (Cerning, 1990). Vì vậy, sự thích ứng với các giá trị pH của các chủng vi khuẩn khác nhau là không giống nhau.
Nhiệt độ cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và tạo hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu nhất định dé phát triển và ở nhiệt độ này sự phát triển của vi sinh vật xảy ra thuận lợi nhất. Nguyên nhân của sự ảnh hưởng nay là do vi sinh vật hầu hết có cấu tạo đơn bào nên chúng rất nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ và thường bị biến hóa cùng với sự thay déi của nhiệt
độ xung quanh.
Mặc dù các thông số quan trọng về mặt công nghệ trong công nghiệp như pH, nhiệt độ tối ưu cho các chủng đã được biết rõ nhưng hoạt động về các đặc tính tăng trưởng định lượng như tốc độ tăng trưởng, năng suất tăng sinh khối vi khuẩn với sự thay đối pH. nhiệt độ và yếu tố ảnh hưởng khác được nghiên cứu còn tương đối kém (Adamberg và ctv, 2003). Do đó nghiên cứu này đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy và
thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng, tạo sinh khối vi khuẩn vả khả năng sinh tổng hợp EPS trên từng cum pH môi trường nuôi cấy.
4.2.1. L. plantarum
9,30
9,00
8,70
Mật độ (log CFU/mL) 8,107,80
7,50 8,40 -
a)
Mật độ (log CFU/mL)
9,30 A
ơ 9,00
=
E 5 8,70
= 2)
so 8,40
&
$ 810
&
= 7,80 7,50
28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 48 giờ Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
b)
9,30
a 9,00
8,70
8,40
8,10
7,80
7,50
28°C 30 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
c)
Hinh 4.3 Anh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng của
vi khuân L. plantarum qua từng mộc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.
Kết quả từ hình 4.3 cho thay rằng, quá trình tăng trưởng của chủng L. plantarum qua từng mốc pH đều đạt cực đại sau 24 giờ lên men cụ thé mật độ vi khuẩn cao nhất trong môi trường pH 5,0 là 1,04 x 10° CFU/mL khi nuôi ở nhiệt độ 30°C, môi trường
pH 6,0 là 1,17 x 10° CFU/mL và 1,50 x 10° CFU/mL với môi trường pH 7,0 ở nhiệt độ 28°C.
Có một điểm chung giữa ba mốc pH được thể hiện rõ trên hình 4.3 là sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tăng trưởng là không rõ ràng, không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhiệt độ khi phân tích thống kê (p<0,05).
Yếu tố thời gian là yếu tố duy nhất gây ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất tạo sinh khối của chủng L.plantarum trong cả ba điều kiện pH này, kết quả phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình khi thu nhận sinh khối ở 24 giờ và 48 giờ. Do đó thời gian tốt nhất cho quá trình tăng sinh chủng L. plantarum là 24 giờ.Không giống quá trình tăng trưởng, yếu tố nhiệt độ và thời gian lại có tương tác
với nhau cùng tạo nên sự khác biệt có ynghia giữa các nghiệm thức thu nhận EPS với
mức ý nghĩa p<0,05 được thể hiện qua hình 4.4
1050,00 1050,00
920,00 920,00 a a
z 790,00 z 790,00 N ° ES . 2 \ b n
© 660/00 ` # 660,00 \
=m =530,00 530,00 ` 400,00 400,00 N
28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
a) b)
1050,00
920,00
=} aE 790,00 - — —
E; be # b ẹ
& 660,00 Rẹ WS N
530,00 — |
400,00
28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
c)
Hình 4.4. Anh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cay đến kha năng tổng hợp EPS
của vi khuân L. plantarum qua từng mộc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.
Kết quả định lượng nồng độ EPS ở mốc pH 5,0 cho thấy khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng L. plantarum đạt cao nhất ở 24 giờ lên men, phân tích thống kê cho thay sự khác biệt về nồng độ EPS thu được ở 28°C và 30°C với giá trị thu nhận lần lượt là 817,37 ug/mL và 767,96 ug/mL. Vì vậy, điều kiện nuôi cấy 28°C sau 24 giờ lên men cho phép thu nhận EPS cao nhất khi lên men trong môi trường có pH ban đầu 5,0.
Tương tự như pH 5,0 thông qua kết quả phân tích thống kê cho thấy nồng độ EPS cao nhất khi nuôi trong môi trường có pH bang 6,0 là 829,14 g/mL với điều kiện nhiệt
độ 28°C lên trong trong 24 giờ.
Khác biệt lớn nhất khi thu nhận EPS là ở mốc pH 7.0 vì khi nhìn vào hình 4,2c có thé thay sau 48 giờ lên men không thu được sinh khối vi khuẩn ở cả 3 lần lặp lại nhưng biểu đồ hình 4.4c cho kết quả thu nhận EPS ở mốc thời gian này cao hơn so với mốc 24 giờ cụ thé nồng độ EPS thu được ở điều kiện 28°C là 699,73 g/mL và 763,65 pg/mL ở 30°C. Điều này chứng tỏ, EPS thu nhận không ty lệ thuận với sinh khối vi khuẩn, du vi khuẩn đã chết hoàn toàn ở mốc 48 giờ nhưng EPS tiết ra trước thời gian đó vẫn tồn tại trong dịch lên men và với mục đích thu nhận nhiều EPS nhất thì nhiệt độ 30°C lên men 48 giờ là điều kiện thu nhận EPS tốt nhất trong môi trường có pH 7.0.
Thực hiện phân tích thống kê, trắc nghiệm phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS giữa ba điều kiện tối ưu lựa chọn. Kết quả được trình bay ở bang 4.1 Bảng 4.1. Phân hang so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS của chủng L. plantarum giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa
; Mật độ tối ưu EPS tối ưu
Moc pH
(log CFU/mL) (ug/mL) 5,0 8,97° 817,378
6,0 9,062 829,142
7,0 - 763,65
p value 0,000 0,003
Trong cùng một cội, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mat thông ké(p<0,05). pH 5,0: 28°C, 24 giờ; pH 6,0: 28°C, 24 giờ; pH 7,0: 30°C, 48 giờ.
Có thể thấy rằng điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 28°C, 24 giờ lên men trong môi trường có pH ban đầu bằng 6,0 đạt hiệu quả tổng hợp EPS cao nhất. Theo như kết quả được công bồ bởi Fu va ctv, 1999 độ pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào đồng thời sản sinh ra các hợp chất thứ cấp nằm trong khoảng từ 5,0 đến 6,0 phù hợp với kết quả của bài nghiên cứu này, ngoài ra còn có nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp EPS của L. plantarum KF5 trong môi trường MRS có bổ sung whey dat cao nhất tại pH 6,3
(Wang và ctv, 2010).
4.2.2. L. acidophilus
Kết qua thu nhận sinh khối được trình bày bời biểu đồ hình 4.5 cho thay yếu tổ nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tương tác với nhau cùng gây ảnh hưởng đến quá trình tăng
trưởng của chủng L. acidophilus tạo sự khác biệt giữa các nghiệm thức lên men.
9,30 9,30
ơ 900 - — 9,00 —
E EŠ 8/70 5 870
3 : 3
\ 8,40 7 co 8,40 2 Š
$ 8,10 $ 8,10
= 7,80 = 7,80
7,50 7,50
28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ Mắc 24 giờ Méc 48 giờ
a) b)
9,30
9,00
5)
š 8,70 5=, 8,40
ề
@ 810 - Ea
E 7,80
7,50
28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
c)
Hinh 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng của
vi khuân L. acidophilus qua từng móc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.
Biéu đồ hình 4.5 cho thấy rõ mật độ vi khuân ở mốc 48 giờ cao hơn han so với mốc 24 giờ và cùng đạt giá trị cực đại khi lên men ở điều kiện 28°C với giá tri tại các mốc pH 5,0; 6,0; 7,0 lần lượt là 6,61 x 108 CFU/mL, 5,57 x 108 CFU/mL và 5,84 x 108 CFU/mL. Vì vậy 48 giờ lên men ở nhiệt độ 28°C là điều kiện thích hop dé
lên men chung L . acidophilus.
Tuy nhiên 48 giờ không phải là khoảng thời gian tốt nhất cho quá trình sinh tổng hop EPS của chủng này khi kết quả thu nhận EPS được biểu dién bởi biểu đồ hình 4.6 lại cho thấy 24 giờ lên men mới là khoảng thời gian phù hợp cho việc thu nhận EPS.
1050,00 1050,00
a
920,00 920,00 N
a a
a ay b a
= 790,00 a E 790,00
‘oD Eì
= =
4£ 660,00 #_ 660,00 m m
530,00 530,00
400,00 400,00
28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 gio Mắc 48 giờ Mắc 24 giờ
a) b)
1050,00
a a 920,00
2 790,00
= > b b
=
L 660,00
m
530,00
400,00
28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
c)
Hình 4.6. Anh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cay đến khả năng tong hợp EPS
của vi khuân L. acidophilus qua từng mộc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.
Hình 4.6 cho thấy nồng độ EPS khi thu nhận tại mốc 24 giờ có giá trị cao hơn mốc
48 giờ ở cả ba pH. Khi thu nhận EPS từ chủng L. acidophilus được lên men trong môi
trường có pH ban dau là 5,0 và 7,0 chỉ có yêu tô thời gian nuôi cấy là ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp EPS. Kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai moc thời gian 24 giờ và 48 giờ, nồng độ EPS cao nhất khi lên men trong môi trường có pH ban đầu bằng 5,0 là 837,37 „g/mL khi lên men ở 28°C va 900,51 g/mL trong môi
trường có pH 7,0 ở cùng nhiệt độ.
Với môi trường có pH bằng 6,0 yếu tố thời gian và nhiệt độ nuôi cấy tương tác với nhau tạo sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị EPS thu được (p<0,05). Nồng độ EPS cao nhất là 958,16 g/mL khi thu nhận ở điều kiện nhiệt độ 28°C sau 24 giờ lên men và
có xu hướng giảm mạnh trong 24 giờ tiếp theo khi chỉ thu được 711,10 g/mL ở cùng điều kiện nhiệt độ
Với kết quả từ hình 4.5 và hình 4.6 có thể thấy quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng L. acidophilus không phụ thuộc vao sinh khối thu nhận. Việc thu nhận sinh khối
sẽ đạt hiệu quả cao ở cả hai nhiệt độ 28°C và 30°C sau 48 giờ lên men nhưng với mục
tiêu thu nhận EPS thì 24 giờ lên men ở nhiệt độ 28°C là điều kiện tốt nhất cho quá trình tổng hợp EPS của chủng L. acidophilus.
Kết quả so sánh giá trị mật độ vi khuẩn và nồng độ EPS tại các điều kiện tối ưu ở ba mốc pH cho thấy mật độ vi khuẩn ở pH 5,0; 6,0 và 7,0 là không có sự khác biệt nhưng nồng độ EPS thu nhận khi lên men trong môi trường có pH 6,0 lại cao vượt trội so với hai pH còn lại (kết quả được biểu diễn ở bảng 4.2)
Bảng 4.2. Phân hạng so sánh giá trị mật độ vi khuan và nồng độ EPS của chủng L. acidophilus giữa ba điều kiện tối ưu được chọn lựa
„ Mật độ tôi ưu EPS tối ưu
Moc pH
(log CFU/mL) (ug/mL)
5,0 8,38 837,37.
6,0 845) 958.16.
7.0 8,45 900,51a b
p value 0,593 0,000
; Ti rong cùng mot cột, các giá trị trung bình có ki tự theo sau khác nhau có sự khác biệt
về mặt thống ké(p<0,05). pH 5,0: 28°C, 24 giờ; pH 6,0: 28°C, 24 giờ; pH 7,0: 30°C, 48 gio:
Theo nghiên cứu của Tomas va ctv năm 2003, điều kiện tối ưu nhất cho sự phát triển và sản xuất acid lactic của L. acidophilus là pH 6,5 hoặc 8,0 được nuôi cấy ở 37°C. Vào năm 1998, Bogoviš-Matijašié và Rogelj đã nghiên cứu sản xuất phức hop bacteriocin bởi chủng L. acidophilus LF221 thu được lượng phức hợp cao nhất (106 AU/mL) trong môi trường MRS có pH 6,5. Có thé thấy pH 6,5 là điều kiện tối ưu cho quá trình phát triển của L. acidophilus và đây cũng là giá trị pH tiệm cận với điều
kiện tôi ưu trong nghiên cứu này.
4.2.3. L. fermentum
Biểu đồ hình 4.7 biểu diễn kết qua mật độ vi khuẩn anh hưởng bởi các yếu tố thời gian và nhiệt độ ở từng mốc pH được khảo sát.
9,30 9,30
9,00 5 9,00
<i Kì a E 870 £ 8,70
= 2
O 8,40 © 8,40
2 2
= 8,10 < 8,10
sc so
Š 7,80 Š 7,80
7,50 ee 7,50 ee
28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
a) b)
9,30
9,00 ey
= 870
=)
© 8,40
oD
E)
= 8,10
Li]
&
= 7,80
7,50
28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
c)
Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng của
vi khuân L. fermentum qua từng mộc pH (a) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.
Ở pH 5,0 (Hình 4.7a), hai yếu tố thời gian và nhiệt độ cùng tác động đến sự tăng trưởng của vi khuẩn, tạo nên sự khác biệt về mật độ vi khuẩn giữa các nghiệm thức.
Biểu đồ 4.6a cho thấy mật độ vi khuẩn đạt cao nhất với nghiệm thức 30°C ở cả hai mốc thời gian nuôi cấy 24 giờ và 48 giờ (7,25 x 108 CFU/mL ở 24 giờ và 8,41 x 108 CFU/mL ở 48 giờ), tuy nhiên, kết quả phân tích không có khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa 2 nghiệm thức. Ở pH 6,0 (Hình 4.7b), ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ lên sự phát triển của vi khuẩn tương tự như mốc pH 5,0, mật độ vi khuẩn giữa các nghiệm thức có khác biệt có ý nghĩa, đồng thời, 2 nghiệm thức vi khuẩn nuôi cấy tại nhiệt độ 30°C, ở cả 2 mốc 24 và 48 giờ cũng đạt mật độ cao nhất (2,33 x 108 CFU/mL ở 24 giờ và
Ở pH 7,0 (hình 4.7c), ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn không rõ ràng, kết quả ở cùng mỗi mốc thời gian, mật độ vi khuẩn của 2 nghiệm thức thay đổi nhiệt độ không có khác biệt có ý nghĩa với nhau. Thay vào đó, yếu tố thời gian lại là yếu tố ảnh hưởng chủ yếu đến sự tăng trưởng của vi khuẩn này, cụ thể là có sự khác biệt giữa 2 mốc thời gian 24 giờ và 48 giờ với mật độ vi khuẩn dat cao nhất ở 24 giờ là 9,36 x 108 CFU/mL ở điều kiện nhiệt độ 30°C.
Khả năng sinh tổng hợp EPS là chỉ tiêu được quan tâm chính yếu trong nghiên cứu nay. Nồng độ EPS trong dịch nuôi cấy cũng được khảo sát dé đánh giá sự ảnh hưởng
của các điêu kiện nuôi cây lên chủng v1 khuân này.
1050,00 1050,00 b
a a ) ẹ Ê Rẹ â
920,00 ẹ b x 920,00 NS ẹ
= x B
§ 790,00 N = 790,00
š ` ồ
£ 660,00 ` ⁄# 660,00
m m530,00 ` 530,00
400,00 : L 400,00\
28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
a) b)
1050,00
a a a 920,00 N RY
E 790,00ơ \N
%
£ 660,00
m
530,00
400,00
28°C 30°C 28°C 30°C
Mắc 24 giờ Mắc 48 giờ
c)
Hình 4.8. Anh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến kha năng tổng hợp EPS của vi khuẩn 7. fermentum qua từng mốc pH (4) pH 5,0; (b) pH 6,0; (c) pH 7,0.
Kết quả định lượng nồng độ EPS có trong dịch nuôi cấy vi khuẩn của các nghiệm thức khảo sát được trình bay trong biểu đồ hình 4.8. Ở pH 5,0 và 6,0 (hình 4.8 a, b), nồng độ EPS giữa các nghiệm thức đều có sự chênh lệch nhất định và có sự khác biệt có ý nghĩa khi phân tích thống kê. Dựa vào kết quả định lượng EPS và đếm mật độ vi