3.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phó Hồ Chí Minh.
Thời gian: Thang 3/2023 đến tháng 8/2023.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Thiết bị và dụng cụ
May ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf), máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R
(Eppendorf) 13200 max, máy do quang phố UV-Vis (Thermo), máy do pH (Mettler Toledo), may khuay từ (Stuart — UK), tủ cấy, tủ ủ lắc (Bioteck), tủ ủ 30°C (Memmert), tủ ủ 28°C (Sanyo), tủ đông sâu âm 80°C, eppendorf, micropipet và dau tip phù hợp, que cấy trải và một số dụng cụ khác.
3.2.2. Hóa chất
Hóa chất dùng dé giữ chủng vi khuẩn: Glycerol 15%
Hóa chat dùng dé dựng đường chuẩn và thực hiện phương pháp phenol — sulfuric:
D-glucose (Cat#1.08342.1000, Merck), H2SO4 đậm đặc (Cat1.00731.1000, Merck), phenol (Cat#108.95.2, Xilong).
Hóa chat dé tủa: EtOH thuyệt đối 96% (Cat#Ch-B:713 9011) dùng dé tủa EPS thô Hai môi trường được sử dung với bốn chủng vi khuẩn L. plantarum, L. acidophilus, L. fermentum, L. salivarius là: MRS broth (Cat#GM369-500G, HiMedia) có bổ sung
1% NaCl (cat#1.06404.1000, Merck) dùng để nuôi cấy vi khuẩn, MRS Arga (catM6411-500G, HiMedia) có bé sung 1% NaCl (cat#1.06404.1000, Merck), 0,75%
CaCO; (CatM.W.:100.09, Xilong) dùng dé kiểm tra mật độ vi khuẩn.
3.2.3. Vật liệu nghiên cứu
Bốn chủng vi khuẩn Lactobacillus: L. plantarum, L. acidophilus, L. fermentum, L. salivarius phân lập ban dia từ ruột tôm, cá khu vực đồng bằng sông Cửu Long đã định danh 16S RNA được cung cấp bởi phòng CNSH Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phó Hồ Chí Minh.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn, đo mật độ quang (OD) và trải đĩa đếm khuẩn lạc
3.3.1.1. Xác định đường cong tăng trưởng
Bốn chủng vi khuẩn L. plantarum, L. acidophilus, L. fermentum, L. salivarius từ Ống giống được tăng sinh 5% trong 10mL MRS lỏng (môi trường thương mại, pH: 6,7 — 6,8) va nuôi trong tủ ủ lắc 28°C. Sau 24 giờ, dich nuôi cấy được ly tâm 4°C ở 6000 vòng/phút trong 15 phút dé loại bỏ dich nổi thu sinh khối, sau đó sinh khối được huyền phù bằng nước vô trùng đã được hấp tiết trùng với thé tích bằng với thể tích ban đầu. Dịch sinh khối tế bảo vi khuẩn thu được sẽ được pha loãng và điều chỉnh đến giá trị OD6oonm + 1 - 1.2 (tương ứng với mật độ tế bào vi khuẩn ban đầu khoảng 10? CFU/mL).
Bồ sung 0,1 mL sinh khối tế bào vi khuẩn (đã điều chỉnh OD¢00um~ 1 — 1.2) vào 100 mL môi trường dinh dưỡng MRS lỏng dé nuối cấy bốn chủng vi khuẩn trên ở điều kiện 28°C, ủ lắc 200 rpm qua các mốc thời gian tăng trưởng: 0 giờ, 24 gid, 48 và 72 giờ.
Biéu đồ đường cong sinh trưởng được xây dựng dựa trên theo dõi chỉ tiêu mật độ vi khuẩn sau các mốc thời gian nuôi 0 gid, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Pha loãng mẫu thu được ở từng mốc thời gian theo dãy thập phân, tạo đĩa trải môi trường MRS Arga (môi trường thương mại có bố sung 1% NaCl và 0,75% CaCOs), thực hiện cấy nhỏ giọt 0,01 mL dịch khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau (mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần). U ở điều kiện 28°C và thời gian thích hợp.
Đếm khuẩn lạc, tính kết quả và xác định đường cong tăng trưởng. Mật độ tế bao vi khuẩn được xác định bằng công thức:
N
we
mịƒq0 + N2fov + -''Tyf„U
Trong đó:
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được:
n: Số đĩa/ số lần lặp lại;
V: Thể tích dịch khuẩn dùng để trải đĩa:
£: nồng độ pha loãng dịch khuẩn.
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và tông hợp EPS
Tạo các nghiệm thức thí nghiệm với các khoảng điều kiện nhiệt độ: 28°C, 30°C; thời gian: 24 giờ, 4§ giờ qua từng mốc pH 5,0; 6,0; 7,0 môi trường nuôi cấy. Tương ứng với từng điều kiện nhiệt độ, thời gian và pH môi trường thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức và được lặp lại 3 lần.
Chuẩn bị thí nghiệm: Môi trường nuôi cấy của 12 nghiệm thức vẫn là môi trường MRS thương mại (dinh dưỡng giống nhau) nhưng có sự thay đôi về pH (5,0; 6,0; 7,0), sử dụng máy do pH, dung dich NaOH và acid HCI dé chuẩn pH cho môi trường nuôi cấy. Cài đặt tủ ủ lắc (Bioteck) ở 2 mốc nhiệt độ (28°C; 30°C).
Phương pháp tiến hành
Bốn chủng vi khuẩn 7. plantarum, L. acidophilus, L. fermentum, L. salivarius từ Ống giống lần lượt tăng sinh 5% giống trong môi trường MRS lỏng, sau 24 giờ dịch khuẩn được điều chỉnh OD6o0um~* 1 — 1.2 như đã trình bày ở mục 3.3.1.1
Dịch khuẩn (đã được điều chỉnh OD) được bồ sung vào môi trường sinh dưỡng MRS lỏng tiếp tục lên men trong môi trường nuôi cấy có giá trị pH ban đầu khác nhau (5,0; 6,0; 7,0) ở nhiệt độ nuôi cấy 28°C va 30°C ủ lắc 200rpm qua 2 mốc thời gian
24 giờ và 48 giờ.
Thực hiện các bước lấy mẫu, pha loãng mẫu qua từng mốc thời gian như đã trình
bày ở mục 3.3.1.1
3.3.2. Phương pháp thu nhận và tách chiết EPS (Yuksekdag và Aslim. 2008)
Môi trường Dịch lên men từ Dịch nồi chứa
————> ————>
dinh dưỡng (1) các chủng LB. (2) EPS (3)
(1) Bồ sung sinh khối tế bào EPS tủa
(2) Ly tâm 42G, 6000 vòng/ phit, 15 phút (4) Bồ sung TCA 30%, lac 90 vòng/ phút, 40 phút
theo nhiệt độ phù hợp |
(3) Bồ sung Ethanol ( tỉ lệ dich nổi: Ethanol = 1:2),
giữ 24 giờ Phương pháp Ly tâm 4°C, 6000 vòng/ phút, 15 phút Phenol - sulphuric (4) Hòa với nước vo trùng
Hình 3.1. Sơ đồ thu nhận và tách chiết EPS.
Quá trình thu nhận và tách chiết EPS được thực hiện như Yuksekdag và Aslim năm 2008 có sửa đổi. Tại mỗi mốc thời gian, lấy 10 mL dich lên men từ các chủng Lb. (quá
trình lên men được trình bay ở mục 3.3.1.2) sau đó ly tâm 4°C ở 6000 vong/ phút trong
15 phút dé thu dịch nổi chứa EPS và protein, bổ sung acid trichloroacetic (TCA) 30%
để tủa protein trong 40 phút (Luyen và ctv, 2018). Tủa EPS bằng ethanol 96% trong 24 giờ (tỉ lệ dịch nỗi: ethanol = 1: 2). Hòa tan tủa EPS sau ly tâm thu được trong nước vô trùng với thé tích bằng với thé tích địch lên men ban đầu (khoảng 10 mL). Dung dich này được xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol — sulfuric.
3.3.3. Phương pháp phenol — sunfuric
Nguyên tắc: dựa vào phản ứng thủy phân polysaccharide thành monosaccharide, monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng A = 490nm. Xây dựng đường chuẩn glucose sau đó đo mẫu thực rồi tinh ra lượng
EPS.
Phương pháp thực hiện: 1 mL dung dịch có chứa EPS được trộn với 1 mL phenol
5% và 5 mL H2SO, đậm đặc, votex và hấp cách thủy 2 phút. Làm nguội về nhiệt độ phũng trong 30 phỳt. Do ODứoun. Tinh hàm lượng EPS dựa trờn đường chuẩn glucose.
Cách xây dựng đường chuẩn:
Cân chính xác 0,2500 (g) D-glucose cho vào bình định mức 250 mL, rồi định mức bằng nước cat ta được dung dich A. Như vay, nồng độ dung dich D-glucose là 1 mg/mL
(1000 pg/mL).
Lay 50 mL dung dich A pha thành 500 mL thu được dung dich D-glucose có nồng
độ 100 wg/mL (dung dịch B).
Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 mL dung dịch B pha thành 100 mL thu được dung dịch D-glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 ug/mL.
Lay 125 mL dung dich A pha thành 500 mL thu được dung dịch D -glucose có nồng
độ 250 hg/mL (dung dịch C).
Lần lượt lấy 50; 60; 70; 80 mL dung dich C pha thành 100 mL thu được dung dich D-glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200 pg/mL.
Mỗi mẫu lay 1 mL cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm ImL dung dịch phenol 5%, 5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm
ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, thu được các giá trị độ hấp thụ quang.
Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn glucose
3.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan EPS trong nước
Khả năng hòa tan trong nước của các EPS tách chiết từ dịch nuôi cấy các chủng
L. plantarum, L. acidophilus, L. fermentum, L. salivarius được thực hiện theo Ahmed
va ctv, 2013 có sửa đôi. Cụ thé là ly tâm 13000 vòng/ phút, 4°C 1 mL dich sinh khối EPS thu nhận theo sơ đồ hình 3.1 trong 15 phút, cặn EPS được hòa tan trong ImL nước cất vô trùng và khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó, dung dịch được ly tâm ở 13000 vòng/ phút, 4°C trong 15 phút để tách EPS không tan. Lượng EPS hòa tan trong nước được xác định bằng phương pháp phenol — sulfuric acid.
Khả năng hòa tan được tính theo công thức sau:
Khối lượng của EPS trong dịch nổi
Khả năng hòa tan (%) = , 7
Khôi lượng mau EPS
Tất cả thi nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thô được xử lý và tính toán bằng Excel 2016. Thống kê mô tả và trắc nghiệm phân hạng với số mẫu lặp lại là 3 và sai số giữa các thí nghiệm với mức ý nghĩa (p<0,05) bằng minitab 21.
Số liệu trình bày ở dạng % + Std. Trong đó Std (Standard Deviation) là độ lệch chuẩn cho thấy sự chênh lệch về giá trị của từng thời điểm đánh giá so với giá trị trung
bình.