Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm Sinh học: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của 2,4-d lên khả năng phát sinh sẹo và hàm lượng hoạt chất sinh học của lá cây gai ma vương (tribulus terrertris l.) trong điều kiện in vitro

Những thành phần và hoạt tính sinh học có trong Gai ma vương được thấy là có liên quan chặt chẽ đến nguồn gốc của thực vật cụ thê là điều kiện sinh trưởng bao gồm điều kiện khí hậu, chất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỎ CHÍ MINH

to Cos

LÝ QUANG THIỆN

NGHIÊN CỨU SỰ ANH HUONG CUA 2,4-D LEN KHẢ NANG PHAT SINH SEO VA HAM LƯỢNG

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SU PHAM SINH HỌC

TP HO CHÍ MINH - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỎ CHÍ MINH

to ÍLÌ œ

LÝ QUANG THIỆN

NGHIÊN CUU SU ANH HUONG CUA 2,4-D LEN

KHẢ NANG PHÁT SINH SEO VA HAM LƯỢNG

HOAT CHAT SINH HOC CUA LA CAY

GAI MA VUONG (TRIBULUS TERRERTRIS L.)

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SU PHAM SINH HOC

NGUOI HUONG DAN KHOA HOC

ThS Quách Van Toàn Em

TP HO CHÍ MINH - 2024

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành khoá luận tốt nghiệp “Nghién cứu sự ảnh hưởng của 2,4-D lên

khả năng phát sinh sẹo và hàm lượng hoạt chất sinh học của lá cây Gai ma vương (Tribulus terrertris |.) trong điều kiện in vitro”, tôi xin chân thành gửi lời cam ơn sâu

Cô ThS Nguyễn Thị Thanh Tâm, cô Nguyễn Thị Nga vả cô Hà Thị Bé Tư đã luôn

động viên, hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành nghiên cứu này.

Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, cùng quý Thay, quý Cô trong khoa đã giảng day,truyền đạt kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành

nghiên cứu.

Chị Hoàng Thị Mỹ Ngọc và anh Trần Thanh Thức đã đồng hành cùng tôi trong

quá trình thực địa thu mẫu và thực hiện đề tài ở phòng thí nghiệm Anh Lưu Tăng PhúcKhang đã giúp đỡ tôi giải quyết những khó khăn trong khi lam thí nghiệm

Các bạn khóa 47 đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài.Cuối cùng, con xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình, cha mẹ, anh chị em đã luôn làm

hậu phương vững chắc, luôn động viên day bao dé tôi có được sự trưởng thành như

ngày hém nay.

Thanh phố Hỗ Chi Minh, ngày 02 thang 05 năm 2024

Tac gia

Ly Quang Thién

BM Gi đo chạn để GAM ssssscsssasssssssscsscsssscsssasssasssassscnsssssssasssnsssasssasssnssnssssscssoasasanssissnreas 1

IL Mục tiêu nghiên CỨu c5 Sư Hình nu ngưng gen 3

TIT Phạm vi nghiên cứu << 5< HH HH nh nh HH0 010001180011 015e 3

IV Phương pháp nghiên CỨU S5 on THỦ TH TỦ TH Tà g0 m0 3 Chương 1 TONG QUANN co HH HH TH TH HH HH HH gu nh 008g 4

1.1 Đặc điểm thực vật học loài Gai ma vương c-scSs< << scssxeexeesscee 4

2 TN ath Ae —=ẶẶằ-ẽẽ=ễẽằằ5ẽẽ== =- 9 1:3:.Sữ Newt VỀ A AeA sssssssssssssssscssnsscasssnsavssscnssanssasssssasesssanssosssssssoassossenssssessoosaais 11

1.4 Chiết xuất hợp chất từ thực VAt ccssecsssecsseesssecsseesssecssveesssecsnecessecenecesseees 13

1.5 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về quy trình nhân nhanh giống và các hợp chất sinh học o osocoo5ccnG2s2S2sS60n6056692s05666660ø 17

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU s-cssccsssccse 202.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 6-5 +se©xxxeerxesssersrssrrere 20

2.2 Vật liệu nghiên cứu sen ng ng ng ngang nen me 20

2.3 Phương pháp nghiên CỨU << 6< S9 9.01 0108 6 24Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN escessssesssesssssssosse 29

3.1 Ảnh hưởng của 2.4 - D lên khả năng phat sinh seo từ lá chét của cây Gai

Bìa Vero trong điền kiện Ìn VỈ (TÔ: sccosccnnoocoocoocooton Con Gi,Gh 0205002000002006006020006060666 29

3.2 Ảnh hưởng của 2,4 - D lên kha năng phát triển từ mô sẹo lá của cây Gai

ma vương trong điều kiện iM VÏKYO -.6-5<55s<SxscxvEkkrkkrrkkerkeerkeerkerrkerre 40

3.3 Thành phần và hàm lượng hoạt chất sinh học của mô sẹo lá cây Gai ma

VI TT ti 0á6204616611645364516454639864644653ã6554345665684535863546954635ã66863535663446353338ã498568356854695133868986 48

KETLUANVAKIENNGHISS=e====—=- ỶỶỶ= 51

TAD LIỆU THAM KHẨU ko ieaeaeeeeeaaaaeaaaeiiaraaraooorỷoreosere 52

PHHDE {7a {ẽ{a {ẽằẽ sẽ {ẽ an“ nan 60

Bang 3.1 Anh hưởng của 2.4 - D đến tỉ lệ và thời gian tạo seo của mau lá chét

loài Gai ma vương sau 8 tuần nuôi cấy trong điều kiện i wirø 29

Băng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4 — D đến khối lượng va đặc điểm của mô sẹo lá chétloài Gai ma vương sau 8 tuần nuôi cấy trong điều kiện in wrø 33Băng 3.3 Ảnh hưởng của 2,4 - D đến ti lệ màu sắc của mô seo lá chét loài Gai ma

vương sau 8 tuần nuôi cấy trong điều kiện int wifrø -cc c .-.33

Bang 3.4 Ảnh hướng của 2,4 — D đến khối lượng và đặc điểm của mô sẹo lá chét

loài cây Gai ma vương sau 4 tuần cấy chuyên trong điều kiện in vifro 40Bang 3.5 Anh hưởng của 2,4 — D đến tỉ lệ màu sắc của mô sẹo lá chét loài câyGai ma vương sau 4 tuần cấy chuyền trong điều kiện in vifro 40

Hình 2.2 Quả loài Gai ma vượng -c coi 21

Hình 2.3 Hat loài Gai ma Vương, HH HH Hàn du 2I Hình 2.4 Lá chét'Gai ma Vương, : : ::c-:: (c0 2022002022250 csee 21

Hình 2.5 Sơ đồ quá trình nghiên cứu 2 62222212251 211221021021721222322e2 24 Hình 3.1 Ảnh hưởng của 2,4 —- Ð đến tỉ lệ tạo sẹo từ mẫu lá chét loài Gai ma

vương sau 8 tuần nuôi cay trong điều kiện ứ wirø -::55:cc5scccsscccscc- 31

Hình 3.2 Anh hưởng của 2,4 - D đến thời gian tạo sẹo từ mẫu lá chét loài Gai ma

vương sau 8 tuần nuôi cấy trong điều kiện iit wiø -cc-cccc-ec.- 3]Hình 3.3 Anh hưởng của 2,4 — D đến khối lượng sẹo từ mẫu lá chét loài Gai mavương sau 8 tuần nuôi cay trong điều kiện int wi/?o ©2s-2ccccccsccsec- 35Hình 3.4 Ảnh hưởng của 2,4 — D đến độ xốp sẹo từ mẫu lá chét loài Gai ma vươngsau 8 tuần nuôi cấy trong điều kiện it wi/?0 5c ccscccsiecseczkerreerrreee 36

Hình 3.5 Ảnh hưởng của 2,4 — D đến màu sắc sẹo từ mẫu lá chét loài Gai ma

vương sau 8 tuần nuôi cay trong điều kiện in vitro ¿ sc- se+ssccczcrcs2 36Hình 3.6 Anh hưởng của 2,4 — D lên sự tạo mô seo từ lá Gai ma vương về mặthình thái sau 8 tuân nuôi cấy trong điều kiện in vitro - - -5552-222-+37

Hình 3.7 Ảnh hưởng của 2.4 - D lên sự tạo mô sẹo từ lá Gai ma vương về mặt

giải phẫu sau 8 tuần nuôi cấy trong điều kiện in VitrO 55:25: 5ssv5scccsa 38Hình 3.8 Ảnh hưởng của 2,4 — D đến độ xốp từ mẫu sẹo lá loài Gai ma vương sau

4 tuần cay chuyên trong điều kiện int wifr@ - 5-25 22222zccczccrrcrrrcrrrcrvee 43

Hình 3.9 Ảnh hưởng của 2,4 — D đến khối lượng từ mẫu sẹo lá loài Gai ma vương sau 4 tuần cay chuyên trong điều kiện in wifrØ 2 25 222e22ssccsxeccxzcccscc- 43

Hình 3.10 Anh hưởng của 2,4 — D đến màu sắc từ mô sẹo lá loài Gai ma vươngsau 4 tuần cấy chuyên trong điều kiện in vitrO - 2+-22se2cssccssccvzccrxece +4

Hình 3.11 Anh hưởng của 2,4 — D lên sự tăng sinh của mô sẹo lá Gai ma vương

về mặt hình thái sau 4 tuần cấy chuyên trong điều kiện in vitro 45

Hình 3.12 Anh hưởng của 2,4 - D lên sự tăng sinh của mô sẹo lá Gai ma vương

về mặt giải phẫu sau 4 tuần cấy chuyên trong điều kiện in vitro 46 Hình 3.13 Kết quả định tinh saponin trong mẫu sẹo lá loài Gai ma vuong 4§Hình 3.14 Kết quả định tính nhóm phenolic trong mẫu sẹo lá loài Gai ma vương

Thiamin HCI

Pyridoxin HCI

6-benzylaminopurine Kinetin

1-Naphthaleneacetic acid Môi trường Murashige and Skoog

MO DAU

I LY DO CHON DE TÀI

Từ lâu, thực vật đã được con người biết đến với những lợi ich như làm thực phẩm,

vật liệu xây dựng, trang trí và đặc biệt nhất thực vật còn có công dụng làm dược liệu giúp cho con người chữa bệnh và hỗ trợ tăng sức khoẻ Với nền Y học Cô truyền ngày

cảng phát triển, con người ngày cảng tận dụng những nguồn nguyên liệu có nguồn gốc

từ thực vật dé làm dược liệu Trong đó loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) haycòn tên gọi khác là Quỷ kiến sau, Bach tật lê, thuộc họ Gai chéng (Zygophyllaceae)

là loài cây thân thảo hằng năm mọc bỏ lan, phân nhánh nhiêu Gai ma vương thườngphân bó ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á, châu Phi và vùng ôn đới với

nhiệt độ 4m áp của châu Au, tuy nhiên với sự tác động của con người hiện nay, loài Gai

ma vương đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng va được ghi nhận trong Sách do ViệtNam [1] và Danh lục đỏ thé giới ở hạng mục nguy cap (EN) [2] Trong y học cô truyền,

loài Gai ma vương là một trong những vị thuốc có tính ôn, vị đắng có tác dụng bình can,

tán phong, thing thắp, hành huyết, ding trong chữa các bệnh dau nhức, mắt 46, phongngứa, ngoài ra còn dùng làm thuốc bỏ thận, tri đau lưng, cai thiện tình trang sinh lý ởnam và điều hòa sinh lý ở nữ Hơn thế nữa, các chiết xuất của Gai ma vương đang được

sử dụng dé nghiên cứu và bước đầu chứng minh khả năng loại bỏ tận gốc, khả năngchống viêm, khả năng chống oxy hoá và chống ung thư, chống lại sự tăng sinh tế bào

ung thư [3].

Nhờ vào các hợp chất sinh học và thành phần có trong Gai ma vương mà các công

dụng của loài nảy ngày càng được các nhà khoa học và người dân chú ý Loài Gai ma

vương còn được các nhà khoa học phát hiện ra một lượng lớn hợp chất saponin steroidbên trong và hợp chất này có công dụng kích thích sản xuất testosteron ở nam giới [4]

Những thành phần và hoạt tính sinh học có trong Gai ma vương được thấy là có liên

quan chặt chẽ đến nguồn gốc của thực vật cụ thê là điều kiện sinh trưởng bao gồm điều

kiện khí hậu, chất lượng đất và thời ki thu hoạch [5] Trong các dé tài nghiên cứu vẻ

hàm lượng hoạt chất sinh học trong loài Gai ma vương ở các vùng khác nhau đã chứngminh, thành phần và hàm lượng hoạt chất sinh học của Gai ma vương là khác nhau ởcác vùng khác nhau, các điều kiện sinh trưởng khác nhau Đôi với nền y học hiện đại,

loài Gai ma vương được xem là nguôn cung cap flavonoid, saponin steroid và

alkaloid, đây là những hoạt chất sinh học khó tìm Mặc dù có nhiều công dụng và

chứa nhiều hợp chất khó tìm nhưng vẫn chưa có nhiều báo cáo về phương diện trồngloài Gai ma vương và các sản phẩm chiết xuất từ nó Hiện nay, tại Việt Nam và một số

nước trên thế giới vẫn chưa biết rõ về công dụng của Gai ma vương nên những khu vực

phân bố của nó thường bị người dân cắt bỏ rất nhiều, dẫn đến tình trạng khan hiểm dần

và khiến cho giá thành đắt đỏ Bên cạnh đó, các hợp chất thứ cấp của Gai ma vương đều

được ngành dược hiện đại chiết xuất từ cây ngoài tự nhiên và phương pháp này sẽ dẫn

đến tình trạng tuyệt chủng của cây Vì vậy, nuôi cấy mô đã được sử dụng để vi nhân

nhanh giống một cách nhanh chong và giảm thiêu tình trạng tuyệt chủng Ngoài ra, nuôi

cấy mô còn có thể sử dụng với mục đích thương mại hoặc có thẻ đưa trở lại môi trườnghoang đã tuy thuộc vao nhu cầu va mục đích sử dụng

Cùng với khoa học công nghệ phát trién, ngành công nghệ sinh học đã va đang được

khang định trong tương lai, trong đó, nuôi cấy in virro ngày càng được sử dụng nhiều

dé nghiên cứu về các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến việc sinh trưởng va hamlượng các chat trong thực vật Trong điều kiện in virro, những yếu té tác động đến sự

sinh trưởng cúa thực vật được điều khiến thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối

đa của thực vật.

Auxin được xem là chất điều hoà sinh trưởng quan trọng trong việc hình thành mô

seo ở thực vật [6] Bên cạnh đó, nhiều nhà nghiên cứu cho ra các kết quả tích cực khi sử dung 2,4 - D trong môi trường nuôi cấy dé kích thích sự hình thành sẹo ở các loài thực

vật khác nhau [7], [S] [9] Hơn nữa, 2,4-D còn được xem là hormone quan trọng nhất

được sử dụng đề tăng sinh mô seo, tạo mô seo và duy trì mô sẹo { 10] Nhằm nghiên cứu

về sự ảnh hưởng cúa các chất điều hoà sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro lên sự tăngsinh và thành phân, hàm lượng hoạt chất sinh học trong Gai ma vương được tạo ra bởi

sự tác động của các nòng độ chất điều hoa sinh trưởng khác nhau trong môi trường nuôicấy Từ đó, xác định được các nông độ chất điều hoả sinh trưởng thích hợp trong nuôi

cấy in vitro cho sự sinh trưởng và tăng sự tích luỹ về thành phan va hàm lượng các hoạt

chat sinh học của Gai ma vương trong điều kiện nuôi cay in vitro, đề tài “Nghiên cứu

sự ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng phát sinh sẹo và hàm lượng hoạt chất sinh

học của lá cây Gai ma vương (Tribulus terrertris L.) trong điều kiện in vitro” được

thực hiện.

II MỤC TIỂU NGHIÊN CỨU

Xác định được sự ảnh hưởng của 2,4-Ð lên khả năng phát sinh sẹo của lá chét loài

cây Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) trong điều kiện in vitro

Xác định được sự ảnh hưởng của 2,4—D lên sự tăng sinh của mô sẹo lá Gai ma vương

(Tribulus terrestris L.) trong điều kiện in vitro.

Xác định được một số thành phần, hàm lượng hoạt chất sinh học trong mô sẹo lá loải

Gai ma vương (Tribulus terrestris L.)

Ill PHAM VI NGHIÊN CỨUTrong giới han của dé tài chi tập trung nghiên cứu anh hưởng của 2.4-D lên sự tạosẹo của lá chét loài cây Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) (6 nghiệm thức) trong điều

kiện in vitro.

Nghiên cứu anh hướng của 2,4-D lên sự tang sinh của mô sẹo lá loài cây Gai ma

vương (Tribulus terrestris L.) (6 nghiệm thức) trong điều kiện in vitro.

Xác định thành phân, hàm lượng hoạt chất sinh học trong mô sẹo lá chét của loài Gai

ma vương (Tribulus terrestris L.) trong điều kiện in vitro

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nuôi cấy in vitro loài Gai ma vương:

Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo lá chét của loài Gai ma vương:

Phương pháp tăng sinh mô seo loài Gai ma vương:

Phương pháp cắt nhuộm mẫu:

Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng hoạt chất sinh học của mô sẹo lá

chét loài Gai ma vương:

Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu.

Chương 1 TONG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật học loài Gai ma vương

1.1.1 Vị trí trong bảng hệ thống phân loại

Loài Gai ma vương hay còn gọi là Bạch tật lê, Thich tật lê, Gai sau, Gai yết hầu có

vị trí trong sinh giới như sau:

Giới: Thực vật - Plantae

Ngành: Mộc lan - Magnoliophyta

Lớp: Mộc lan — Magnoliopsida

Phân lớp: Hoa hồng — Rosidae

Bộ: Quý kiến sầu — Zygophyllales

Họ: Quỷ kiến sau — Zygophyllaceae

Chỉ: Quỷ kiến sâu — Tribulus

Loài: Gai ma vương ~ Tribulus terrestris L 1753

Tén đồng danh: 7 /anwginosus L 1753 [11]

Hình 1.1 Loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.)

1.1.2 Đặc điểm thực vật học Theo sự mô tả của Pham Hoàng Hộ loài Gai ma vương là loài co nằm, đa niên và cólông trắng nằm [12] Đỗ Tat Lợi mô tả đây là loài cỏ bò lan trên mặt đất Lá mọc đối dài

2 - 3 cm, kép lông chim, 5 đến 6 đôi lá chét đều nhau phủ lông trắng mịn ở mặt dưới.Hoa vàng, mọc riêng lẻ ở kẽ lá Hoa phân hóa đài - tràng, đài 5, trang 5, 10 nhị, bau 5 ô.

Hoa nở vào mùa hè tháng Š - 7, quả từ thang 8 - 9, Sau khi hoa nở từ 7 — 10 ngày thì sẽ

hình thành quả Quả nhỏ, khô, gồm 5 vỏ cứng trên có gai, dưới lớp vỏ day là hạt có phôi

không nội nhũ [ I3]

1.1.3 Phân bố

Loài Gai ma vương là cây wa sáng, chịu được khô hạn, thường mọc thành đám nhỏ

trên các bãi cát ven biên, phân bố từ vĩ độ 35°N đến 47°B, ở các vùng nhiệt đới vả cận

nhiệt đới của châu Á, châu Phi và vùng ôn đới với nhiệt độ ấp áp của châu Âu [9] Ở Việt Nam, mọc hoang dại ở những vùng đất khô, đất cát dọc vùng ven biên, ven sông các tinh Quảng Binh, Quang Tri, Thừa Thiên - Huế, Đà Nẵng, Phú Yên, Binh Thuận và các tỉnh miền Nam nước ta.

1.1.4 Thành phần hoá họcHàm lượng chat khô và chất hữu co của Gai ma vương là 932 g/kg và §I Ig/kg.

Trong đó:

Ham lượng protein thô là 156,2Šg/kg.

Hàm lượng chat xơ trung tính là 467g/kg

Ham lượng chat xơ không tan trong acid là 374 g/kg.

Nitrogen không hoa tan trong acid là 14 g/kg [15]

Nhiéu hop chat véi nhiéu lai hoat tinh sinh hoc va cau trac hoa hoc da duge xac dinh

trong chiết xuất của Gai ma vương Đến hiện nay, có hơn 70 hợp chất khác nhau đãđược tìm thấy trong Gai ma vương bao gồm: khoáng 15 loại hợp chất Furostanol

Saponins, khoảng 13 loại hợp chất Spirostanol Saponins; khoảng 3 loại hợp chấtCinnamic Acid Amides; khoảng 4 loại hợp chất din xuất Quinic Acid: khoảng 16 loại

hợp chat Flavonoids; khoảng 8 loại hợp chat Alkaloids; khoảng 5 loại hợp chat Amides

và Lignanamides; khoảng 5 loại hợp chat Acid béo va ester acid béo, khoảng 2 loại hợpchat Phytosterols; khoảng 5 loại các hợp chất khác

Thành phần và hoạt tính sinh học của Gai ma vương có liên quan chặt chẽ đến nguồn

gốc của thực vật cụ thê là điều kiện sinh trưởng bao gồm điều kiện khí hau, chất lượng

đắt, thời kì thu hoạch Các nghiên cứu đã cho thấy có sự chênh lệch lớm vẻ sự có mặt

và hàm lượng các hoạt chất (đặc biệt là ham lượng furostanol va spirostanol saponoside,

được coi là những hoạt chất chủ yếu liên quan đến tac dụng điều trị) ở các mẫu thu khác

nhau của Gai ma vương [5]

1.1.5 Công dung

Quả loài Gai ma vương hay Bach tật lê có vị đăng, tinh ôn, có tác dụng lên hai kinh can và phế làm bình can, tán phong hành huyết, ding dé chữa nhức đầu, chữa đau mắt,đau nhức vùng mắt, mắt đỏ, nhiều nước mắt, phong ngứa, tắc sữa, bố thận, trị dau lưng,

tinh dịch không bền, cải thiện sinh lí nam giới gầy yếu, chữa loét mồm mun 16, viêm

họng đỏ, chữa kiết li Tribulus terrestris L được sử dụng trong y học dan gian như một loại thuốc bỗ, kích thích tình dục, giảm đau, làm se, tiêu da day, hạ huyết áp, lợi tiều, làm tan sỏi và khử trùng tiết niệu.

Nghiên cứu tập trung vào công nghệ chiết xuất, phân tích thành phan, hoạt tính chong

oxy hóa và kháng khuan in vitro của tông flavonoid và axit béo từ quả Tribulus terrestris

L đã được tiền hành Sản lượng của tông flavonoid và axit béo là 0,46 và 9,76% trongđiều kiện tôi ưu hóa Ngoài ra, tong số flavonoid và chiết xuất axit béo đều thê hiện một

số hoạt động chong oxy hóa và kháng khuẩn Những phát hiện biện tại cho thay rằng

tông số flavonoid chiết xuất từ trái T terrestris L là một ứng cử viên tiềm năng tạo ra các axit béo dé nghiên cứu và phát triển các chất chống oxy hóa và kháng khuẩn tự nhiên

và lành mạnh cho ngành công nghiệp được phẩm và thực phẩm [ 16].

fe) Bulgaria, cây được sử dụng như một loại thuốc dân gian dé điều trị chứng bat luc.

Ngoài tat cả các ứng dụng này, được điển Ayurvedic của An Độ còn chứng minh đượccác đặc tính trợ tim cho rễ va quả Trong y học cô truyền Trung Quốc, quả được dùng

đề điều trị các chứng đau mắt, phù thũng, đầy bụng, phát hãn, bệnh bạch cầu và rồi loạn

chức năng tình dục.

Ngoài ra, Gai ma vương còn có tác dụng tây giun san, giảm thâm, khử trùng va chống

viêm, chữa bệnh gout, điều trị bệnh phong, các bệnh da vảy và bệnh vảy nên, giảm đau

do thấp khớp, chữa gan bị suy nhược, tức ngực, viêm tuyến vú làm sáng mắt điều trịviêm kết mạc cấp, và Gai ma vương được báo cáo là có hoạt tính kháng khuẩn [17]

Hơn thé nữa, các chiết xuất của Gai ma vương đang được sử dung dé nghiên cứu và

bước đầu chứng minh khả năng loại bỏ tận gốc, khả năng chống viêm, khả năng chốngoxy hoá và chồng ung thu, chống lại sự tăng sinh tế bào ung thư [3]

1.1.6 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

W O Erhun và A Sofowora (1985) đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo từ lá

và thân của loài Gai ma vương Kết qua cho thay, sự kết hợp giữa 2,5 tửM 2,4-D và 2

uM kinetin là tối ưu cho việc hình thành và đuy trì mô sẹo Quá trình hình thành sẹo ở

lá trải qua nhiều giai đoạn thay đỗi hình thái, trong khi sẹo thân xuất hiện từ những cạnh

bị cat Các hợp chat lignin, saponin, đầu béo, flavonoid được phát hiện trong mô sẹo,

đóng vai trò như chất sinh tong hợp cho cây Tuy nhiên, steroidal saponins lại khôngđược tìm thấy [21]

T D Nikam và cộng sự (2009) cho thấy seo từ lá cây Gai ma vương được hình thành

và phát triển trong 10-15 ngày trong môi trường MS bồ sung 5 uM BA và 2,5 uM NAA,

Seo được nuôi cay trong 4 tuần Ban dau, sẹo có mau trắng mềm và chuyên sang mau

vàng đậm va nâu Tỉ lệ hình thành sẹo cao nhất đạt được với môi trường MS bé sung 5

uM BA, 2,5 uM NAA và 75 mg/L casein thủy phân Seo thu được chứa các alkaloid

B-carboline bao gồm Harmaline (66,4 + 0,5 ug/g khối lượng khô), Harmine (82,7 + 0,6

ug/g khối lượng khô) và diosgenin (170.7 + 1 ug/g khối lượng khô) [20]

Tunhai Xu và cộng sự (2010) đã tìm được từ loài Tribulus terrestris L 1 hợp chất

furostanol saponins Khác với 2 hợp chất glycoside đã biết, glycoside furostanol mới

được phan lập từ quả [25].

Nghiên cứu “Sinh tông hợp các hat nano bạc từ Tribulus terrestris L và hoạt động kháng khuân” được V Gopinath và cộng sự (2012) thực hiện Trong nghiên cứu này

phan thân, quả của cây Gai ma vương chính là đối tượng được nghiên cứu, chiết xuấtthân quả khô được trộn với bạc nitrat đề tông hợp các hạt nano bạc Các hoạt chất thực

vật có trong cây có tác dụng cho sự khử nhanh chóng của ion bạc (Ag*) thành các hat

nano bạc kim loại (Ag”) Dac tính kháng khuẩn của các hạt nano tổng hợp được quan sát bằng phương pháp Kirby - Bauer với các vi khuẩn đa kháng thuốc được phân lập

trên lâm sảng như Streptoceccus pyogens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Bacillus subtilis và Staphyloceccus aureus [22].

Saurabh Chhatre và cộng sự (2014) đã đưa ra công tình nghiên cứu “Tong quan vềthực thé học của loài Gai ma vương”, trong đó có hoạt động dược lực học của Gai ma vương về hoạt động lợi tiêu, kích thích tình dục, chống ung thư, điều hoà miễn địch,chồng đái tháo đường, chất tăng cường hap thu, ha lipid máu, điều trị các bệnh tim,

chong tram cảm, âu lo, bảo vệ gan, chống viêm, giảm đau, chỗng co thắt, chống ung

thư, kháng khuan, tây giun san, điệt bọ gậy và chống dj ứng [23]

Cao Thị Mỹ (2020) đã nghiên cứu được sự này mam của hạt cây Gai ma vương

tốt nhất khi xử lý hạt với nước ấm tỉ lệ 2 sôi : 3 lạnh trong 8 giờ trên giá thé đất cát của

xã Phú Lạc huyện Tuy Phong tỉnh Bình Thuận Sự sinh trưởng của cây Gai ma vương

trong giai đoạn vườn ươm tốt nhất ở nghiệm thức đối chứng (nước máy) không can bónphân Chất lượng nảy mam của cây Gai ma vuong tốt nhất là trên giá thẻ dat cát của xã

Phú Lạc, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận Thời gian nảy mam nhanh nhất là ở các

nghiệm thức xứ lí hạt với nước ấm 2 sôi : 3 lạnh trong 8 giờ [ I8]

Chunlian Tian và cộng sự (2021) cho thấy 14 chế phẩm được xác định tách biệt với

phan flavonoid bằng HPLC-DAD-ESI-MS2 sau khi tiến hành nghiên cứu công nghệchiết xuất, phân tích thành phan, hoạt động chống oxy hóa, kháng khuẩn, giảm đau vàchồng viêm của phần nhỏ flavonoids từ 7 terrestris L Không chỉ vậy, phan flavonoidnày còn thẻ hiện hoạt động chống oxy hóa tốt hơn qua các xét nghiệm ABTS, hoạt động

quét gốc DPPH và hoạt động năng lượng chống oxy hóa làm giảm chất sắt [24].

Lê Nguyễn Thu Ngàn và cộng sự (2022) đã “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hoa sinh trưởng IBA và BA đến khả năng nay mầm của hạt Gai ma vương (Tribulus

terrestris L.) trong điều kiện in vitro” đã kết luận Khử trùng của hạt Gai ma vương: Ởnông độ HgCl2 0.1% trong thời gian 30 giây là tốt nhất tỉ lệ mẫu vô trùng là 66.67% tỉ

lệ sóng là 80% Ở nông độ NaClO 0,1% trong thời gian 60 giây là tốt nhất, tỉ lệ mẫu vôtrùng là 100%, ti lệ sông là 100% Sự nảy mam trong điều kiện in vitro của hạt Gai mavương thích hợp trong các điều kiện môi trường có bộ sung chất kích thích sinh trưởng

với nồng độ thích hợp nhất là: bo sung IBA 1,0 mg/L cho tỉ lệ nảy mam là 100%, số ngày nảy mầm trung bình là 2.60 ngày, số lá đầu tiên trung bình là 3.80 lá tỉ lệ tạo sẹo

ở phan trụ dưới lá mam là 73,33%; bỗ sung BA 2,0 mg/L cho tỉ lệ nảy mam là 86,67%,

số ngày nay mam trung bình là 2,54 ngày, số lá đầu tiên trung bình là 2.85 lá, tỉ lệ tạosẹo ở phan trụ dưới lá mầm là 92,31% bd sung 0,25 mg/L IBA và 0,5 mg/L BA cho tỉ

lệ này mam trung bình là 100%, số ngày nảy mam trung bình là 2,67 ngày, số lá trung

bình là 4,33 14, nỗng độ thích hợp cho việc tạo sẹo ở phan trụ đưới lá mam là 0.5 mg/L

IBA và 1,0 mg/L BA với tỉ lệ là 85,71% [19].

1.2 Nuôi cấy in vitro

Nuôi cay mô tế bao thực vật là công cụ rất cần thiết trong nhiều lĩnh vực như nghiên

cứu cơ bản, ứng dụng vào ngành công nghệ sinh học và thương mai Nhờ vào những

thành tựu mới mẽ của nuôi cay mô mà người ta đã có thé tạo ra những giống cây có

năng suất cao và chất lượng vượt trội hơn thế hệ trước Hơn nữa, nuôi cấy mô còn giúp

khôi phục những giống cây quý hiểm Do đó, nuôi cây mô tạo ra cá thê mới và giữnguyên tính trạng di truyền ban đầu, đồng thời rút ngắn thời gian đưa vào sản xuất

Nuôi cay mô là phạm tra khái niệm dành cho tat cả loại nuôi cấy trong môi trường

nhân tạo và hoàn toàn sạch vi sinh vật bao gồm: nuôi cay các cơ quan, bộ phan của thực vật như rễ, thân, lá, hoa, qua, bao phan, ; nuôi cấy phôi: nuôi cay mô sẹo (callus); nuôi cay tế bào đơn; nuôi cay Protoplast (nuôi cay tế bảo trần) Nuôi cấy mô, tế bảo thực vật

con gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm) dé phân biệt với qua trình nuôicay trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm [26]

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro)

Theo nhà khoa học người Đức Haber Landt, vào năm 1902 ông đã dé xướng ra

phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật và điều đó đã chứng minh cho tính toàn năng của thực vật, Theo ông, ở sinh vật đa bao chúng ta lay bat kì cơ quan nao của chúng thi chúng đều có khả năng phát triển thành cơ thê hoàn chỉnh Khi cho chúng vào môi

trường thích hợp, tế bào này sẽ có khả năng phân chia giống như hợp tử ban đầu đochúng đều chứa bộ gene mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thé

Nhờ vào khả năng biệt hoá và phản biệt hoá tế bào và đó cũng là cơ sở khoa học trongnuôi cay in vitro Sự chuyển hoá các tế bảo phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá và

đảm nhận các chức năng khác nhau gọi là sự biệt hoá Tuy nhiên, sau khi đã phân hoá

thành các tế bào có chức năng chuyên hoá, chúng vẫn không hoàn toàn mat đi khá năng

biến đôi của mình Khi ở trong điều kiện thích hợp, các tế nào này sẽ quay trở lại trạng

thái phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, đây gọi là quá trình phản biệt hoá Tóm lại, quá

trình phat sinh hình thai trong nuôi cấy mô là kết quả của quá trình phản biệt hoá va biệt

hoá [26]

1.2.2 ¥ nghĩa của nuôi cấy mô

Với sự ra đời của kĩ thuật nuôi cấy mô kĩ thuật này đã góp phan to lớn và mang lạihiệu quả ve kinh tế cũng như ý nghĩa về sinh học Nhờ vào tru điểm nối bật như nhân

cao từ một cây ban đầu có thé tạo ra hàng nghìn đến hàng triệu cây mỗi năm Đây là ýnghĩa to lớn đôi với việc duy trì các nguồn giống quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng cầnđược bảo tồn Cùng với ưu điểm ôn định di truyền và có tính đông nhất, vì vậy cây con

được tạo ra giống với cây mẹ ban đầu Không những vậy nuôi cấy mô còn nâng cao

chất lượng giống do được tạo từ các đòng sạch bệnh và không chịu ảnh hưởng bởi khí

hậu, thời tiết và loại bỏ các vi khuân hai, sâu bệnh Dù vậy, vẫn còn những nhược điểm

như hạn chế chủng loại sản phẩm, có hiện tượng sản phẩm bị biến đôi kiểu hình do biến

dj soma làm cây con không giữ được kiều hình của cây mẹ ban dau, chi phí sản xuất cao

đo kĩ thuật này đòi hoi thiết bị hiện đại và tay nghề cao [26][27][28].

1.2.3 Mô sẹo (mô callus)

Khi thay đôi sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật, cụ thê các

mô đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra và nuôi cấy trên môi trường gidu auxinthì mô seo sẽ được hình thành Do là các khối tế bào phát sinh vô tô chức, có đặc tínhphân chia mạnh và có hình dạng không nhất định với màu vàng, trắng hoặc hơi xanh.Phan non của cây là nguyên liệu đề tạo mô sẹo, được đưa vào môi trường nuôi cấy trêncác loại môi trường có bỏ sung auxin hoặc auxin phối hợp với cytokinin Trong quátrình nuôi cấy mô tạo mô sẹo, mam thường phải dé trong tối, tạo mô sẹo có thé là quá

trình phản biệt hóa, đưa những mẫu đã biệt hóa trở vẻ dạng ban đầu của nhu mô [29]

Theo lí thuyết định nghĩa mô sẹo là một nhóm các tế bào toàn năng không biệt hóa,

đo khả năng tái sinh các tế bào khác nhau các loại cơ quan thực vật Vì vậy, sự hình

thành mô sẹo từ các mẫu cấy được cho là một quá trình khử biệt hóa Tuy nhiên, những

nghiên cứu gan đây về cây Arabidopsis đã đã chứng minh rang mô sẹo là một khối các

tế bào đỉnh của mô phân sinh rễ và mô sẹo đó cảm ứng giống như sự hình thành rễ bên.

[30]{31]I32]33]

Mô sẹo hình thành được chia thành hai loại Loại mô xốp với nhiều tế bảo xốp với

nhân nhỏ, chất tế bào loãng và không bảo to Loại mô cứng thì ngược lại, các tế bảochắc, nhân to, chất tế bào đậm đặc, không bao nhỏ Từ các khối sẹo có thé đưa vào môi

trường nhân sinh khối dé thu lượng lớn mô sẹo.

Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường hợp khác nhau, có thẻ kẻ đến

như nhân giống in — vitro ở những thực vật ma phương pháp nhân giỗng bằng phươngpháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít hiệu quả hoặc không thực hiện được Nuôi cấy mô sẹo

làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bao đơn, thu nhận các chất có hoạt tinh sinh học Ngoài

ra, nuôi cay mô sẹo còn dùng làm nguyên liệu cho chon dòng tế bào và nghiên cứu quá

trình hình thành cơ quan thực vật [34]

1.3 Sơ lượt về Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật, được sử dụng thường xuyên trong

nuôi cay in — vitro Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liễu lượng thấp hiệuứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các

quá trình sinh lý, trao đôi chất nào đó trong những cơ quan khác

Auxin là thuật ngữ chung đại điện cho lớp của những hợp chất được đặc tính hóa bởi

khả năng gây ra sự vươn dai trong tế bao chỗi trong vùng gan đỉnh và giỗng như

indole-3-acetic acid trong hoạt động sinh lí Auxin cũng có những ảnh hưởng khác bên cạnh sự

vươn đài, nhưng sự vươn đài được xem là then chốt nhất

Khi auxin kết hợp với thành phần khác của môi trường dinh dưỡng sẽ kích thích sự

tăng trưởng của khối mô sẹo, huyền phù tế bào, điều khiển sự phát sinh hình thái, đặc

biệt là khi auxin được phối hợp với cytokinin Tùy theo kiêu tăng trưởng, phát triển củamẫu nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh trong mẫu, khả năng tông hợp auxin nội sinh

và sự tác động lẫn nhau giữa auxin nội sinh vả auxin ngoại sinh mả người ta sử dụng

loại và nông độ thích hợp trong môi trường nuôi cấy Auxin được chia thành hai nhóm

có nguồn gốc khác nhau, đó là auxin tự nhiên (IAA) va auxin nhân tạo (IBA, 2,4-D,

NAA).

1.3.1 1-naphtalenaxetic acid (NAA)

|-naphtalenaxetic acid (NAA) là một loại hormone thực vat tong hop trong ho auxin

và là một thành phan có mặt trong các sản phẩm chăm sóc rễ cây trên thị trường, nó làmột tác nhân tạo rễ và được sử dung dé nhân giống thực vật từ thân và cảnh lá đặc biệt

là sử dụng thường xuyên trong nuôi cây mô thực vật.

oe

Hình 1.2 Cau trúc phân tử NAA

I-naphtalenaxetic acid (NAA) la một hợp chất hữu cơ có công thức C;aẴH:CH:CO:H.Chất rắn không màu nảy có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ Nó có nhóm

cacboxylmetyl (CH2CO2H) được liên kết với "vị trí 1" của naphtalen.

Hormone NAA không xuất hiện tự nhiên và giống như tất cả các auxin khác, là chat

độc đối với thực vật ở nồng độ cao NAA được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp vớinhiều mục đích khác nhau Hợp chất được xác định gây độc cho động vật ở nông độ cao[35].

Bởi vi thuộc ho auxin nên NAA cũng có tác dụng ngăn ngừa sự rụng sớm của quả từ

thân cây NAA được áp dụng sau khi hoa được thụ phần dé hạn chế sự rụng quả Tuynhiên, lượng tăng lên thực sự có thé có tác động tiêu cực và gây ra sự ức chế sinh trưởng

đối với sự phát triển của cây trồng.

Trong vi nhân giống các loại thực vật khác nhau, NAA thường được thêm vào môitrường có chứa các chất đinh dưỡng cần thiết cho sự tồn tai của thực vật Nó được thêm

vào dé giúp hình thành rễ ở nhiều loại thực vật khác nhau Nó cũng có thê được áp dụng bằng cách phun lên cây trồng và đây là cách điển hình trong việc sử đụng nông nghiệp.

O nhiều khu vực nó bị cam sử dụng với nồng độ cao do những lo ngại về sức khỏe đối

với con người và các động vật khác.

1.3.2 2,4- diclorophenoxyacetic acid (2,4-D)

2,4- diclorophenoxyacetic acid (2,4-D) là một hợp chat hữu cơ có công thức hóa học

CsHoChO; thường được gọi bằng tên chung ISO 2,4-D

ci” "cl

Hình 1.3 Cau trúc phan tử 2.4-D

2,4-D (2,4-acid diclorophenoxyacetic) là một thành viên của ho phenoxy 2,4-D được

sản xuất tir acid chloroacetic và 2.4-dichlorophenol, chính nó được tao ra bang cach clo

hóa phenol Ngoài ra, nó được sản xuất bằng cách clo hóa acid phenoxyacetic

2,4-D đã được sử dụng trong các phòng thí nghiệm dé nghiên cứu thực vat như một chất bỗ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật như môi trường MS ít nhất là từ

năm 1962 2.4-D được sử dụng trong nuôi cây tế bào thực vật như một chất cảm ứng

mô seo nội tiết tổ Nó được phân loại như một dẫn xuất hormone thực vật auxin [34] [36] Bên cạnh đó, auxin 2,4-D còn là chất điều hoà tế bào thực vật hiệu quả trong việc tạo ra sự kéo dài và mở rộng tế bào Vì vậy 2.4-D rất phô biến trong việc ứng dụng tạo

mô sẹo

2.4-D còn là một loại thuốc diệt cỏ toản than, giết chết hầu hết các loại có đại lá rộngbằng cách gây ra sự phát triển không kiểm soát ở chúng nhưng hau hết các loại cỏ nhưngũ cốc , cỏ và đông có tương đối không bị ảnh hưởng 2.4-D hoạt động bằng cách bắt

chước hoạt động của hormone tang trưởng thực vật auxin , dẫn đến tăng trưởng không kiểm soát và cudi cùng là chết ở những cây mẫn cảm Nó được hap thy qua lá và được

chuyền tới mô phân sinh của cây Sự phát triển không được kiêm soát, không bền vữngxảy ra sau đó, gây ra hiện tượng quăn thân, héo lá và cuối cùng là cây chết.

1.4 Chiết xuất hợp chất từ thực vật

1.4.1 Kĩ thuật chiết tách hợp chất hữu cơ từ thực vật

1.4.1.1 Xứ lí mẫu cây

Mẫu cây thu hái về được rửa sạch với nước, đề ráo, làm khô tự nhiên trong mát có

quạt hoặc nơi thoáng gió.

Muốn khảo sát cây khô thì ngay khi cây còn tươi nên sắc nhuyễn, rồi rãi ra phơi khô

ở nhiệt độ phòng hoặc sấy trong lò sấy ở 60 — 80°C Quá trình này cần tránh không dé

cây chồng đống dồn nén lên nhau có thé phát sinh nam mốc, bằng cách thường xuyên

dao trộn cây Nếu không có lò sấy, có thé phơi khô nhờ ánh sáng, tuy nhiên cần tránh

phơi đưới ánh nắng mặt trời gay gat vi tia tử ngoại (UV).

Mẫu cây sau khi phơi khô cần được xay nghiền thành bột Quá trình nghiền làm phá

vỡ màng tế bảo thực vật, giúp cho dung môi dé thắm vao bột cây dé tách hết các hợp

chất ra khỏi cây [37]

1.4.1.2 Dung môi để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây

Do cấu tạo hoá học của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chat đại phân tử tương

đối tro, không hoà tan trong dung môi hữu co, vì thế việc khảo sát hợp chất tự nhiên

nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có lượng phân tử nhỏ

Các hợp chất tự nhiên có mức độ phân cực khác nhau nên khi chiết những hợp chất

có trong cây có thé sử dụng lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dan hoặc

chiết một lần lay tất cả các loại hợp chat bằng cách sử dụng dung môi vạn năng metanol

(có thé chiết hau hết các loại hợp chất tự nhiên).

Nguyên tắc tông quát là lựa chọn dung mdi và quy trình phù hợp đề chiết tách hợp chat ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp có

trong cây mà người khảo sát mong muốn cô lập [37]

1.4.1.3 Kĩ thuật chiết ngâm dâm

Kĩ thuật ngâm dam không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thé dé dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Bột cây được ngâm trong bình chứa bằng thuỷ tỉnh hoặc bằng thép

không ri, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bang nhựa vi dung môi hữu cơ có thê

hoà tan một ít nhựa, gây nhằm lẫn là hợp chất có chứa trong cây.

Dung môi được rót vào bình cho đến xap xap be mặt của bột cay Giữ yên ở nhiệt độ

phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào

thực vật và hoả tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang quamột tờ giấy lọc, thu hôi dung môi sẽ được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vàobình chứa bột cây vả tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt

mẫu cây.

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi có định

trong bình, mẫu chat chỉ hoà tan vào dung môi đến dat mức bão hoà, không thé hoà tan

thêm được nhiều hơn nữa, có ngâm lâu hơn chỉ mắt thời gian Quy tắc chiết là chiết

nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan và được

tiếp tục sử đụng đẻ chiết các lần sau [37]

1.4.1.4 Làm khô mẫu chất Sau khi làm chiết mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi có được cao, Cao

chiết này can được say khô vì các lý do sau: các hợp chat ở trong cao ở trạng thái khô

sẽ ôn định, bền chắc hơn; đẻ tính đúng thu suất của cao chiết so với lượng cây khô ban

dau; dé tiếp tục tinh chế cao bang sắc ký cột, dé đo các số liệu phô dé dang va không

khó khăn trong việc giải đoán cau trúc.

Say khô bang khí tro trong máy cô quay chân không: Khi cô quay chân không, đếnlúc mẫu đã khô hoàn toàn cho một luồng khí tro, vi dụ như khí nito đi vào máy này, di

nhè nhẹ từ đầu trên của máy cô quay (tại đầu trên của máy, chỗ đóng - mở áp suất dé tạo chân không cho máy, có một ống dé châm dung địch vào bình cô quay ma không can tat ngưng may, cho khí vào bằng ngõ này) Nếu không có khí nitrogen, có thẻ dé mẫu lâu hơn trong máy cô quay vẫn hoạt động [37]

1.4.2 Điều kiện ảnh hưởng quá trình tách chiết

1.4.2.1 Những yếu tổ thuộc về thành phan, cầu tạo của nguyên liệuMang té bào: có nhiều ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán Khi còn sông đó lả nơi

xuất hiện quá trình trao đôi chất có tính chọn lọc Khi chết, đó là sự xuất hiện của các

hiện tượng khuếch tán, thâm thâu, thâm tich, Màng tế bào có cau trúc không ôn định,

có thê được thay đôi tính chất vật lí và thành phần hoá học để đáp ứng với các chứcnăng Đối với nguyên liệu thực tế non hay mềm mỏng như cỏ cây, hoa lá, thành phancủa tế bảo chủ yếu là cellulose Cellulose có tinh chất không tan trong nước và không

tan trong môi trường khác, bèn vững ở nhiệt độ cao, có tính chất dẻo dai Đối với loại

nguyên liệu nay, môi trường dé thâm vào được liệu, do đó chỉ cần xay thô Nếu xaynhuyễn, dé kéo theo nhiều tạp chất vào dịch chiết xuất, Đối với nguyên liệu già, chắcchắn như hạt, gỗ, vỏ, vó thì tế bảo trở nên day đặn Do đó với những nguyên liệu gia,

ran chắc, nên xay nhỏ, tạo điều kiện cho môi trường để thấm ướt, chất tan dé khuếch tán

vào mồi trưởng.

Chat nguyên sinh: có tinh chat bản tham, có nghĩa là chỉ thấm đối với dung môi mà

không cho chat tan đi qua Do đó dé chiết xuất các chat tan trong tế bào, người ta phải

tìm cách loại bỏ các chất nguyên sinh bằng cách làm đông vón chúng bằng nhiệt (say

hoặc phơi khô) hoặc bằng côn (hơi hoặc côn nóng) [38]

1.4.2.2 Các yếu tổ thuộc về dung môi

Một số yếu tô của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ phân cực,

độ căng, sức căng bê mặt.

Độ phân cực: Nói chung dung môi ít phân cực, dé hòa tan các chat không phân cực

và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, tính phần cực mạnh thì déhỏa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực

Độ nhớt, sức căng bê mặt: Nói chung dụng môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức

căng bé mặt càng nhỏ thi dung môi càng dé thấm vào nguyên liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại [38]

1.4.2.3 Các yếu 16 thuộc về kĩ thuật Nhiệt độ chiết xuất: Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi tăng độ thì hệ số khuếch tán cũng ting, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng

tăng theo Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng lên thì độ nhớt của môi trường giảm, do đó sẽ tạo

ra điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ sẽ gây bất

lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp, vì vậy tuỳ vào từng trường hợp cụ thé mà lựa chọn nhiệt độ thích hợp (tuỳ thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu, dung môi, phương pháp chiết xuất).

Thời gian chiết xuất : Khi bắt đầu chiết xuất, các chất phân tử lượng nhỏ (thường là

hoạt chất) sẽ được hòa tan và khuếch tán vao dung môi trước sau đó mới đến các chất

có phân tử lượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo ) Do đó, nếu thời gian chiếtxuất ngắn sẽ không chiết được hét các hoạt chat trong nguyên liệu, nhưng nếu thời gian

chiết dài quá, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chat, gay bat lợi cho qua trinh tinh ché va

bao quản Tóm tắt lại, cần phải lựa chọn thời gian chiết xuất dé phù hợp với thành phan

của nguyên liệu, dung môi, phương pháp chiết xuat,

Độ min của được liệu: Khi nguyên liệu với kích thước quá thô, dung môi sẽ khó thấm

ướt, hoạt chất khó chiết xuất vào dung môi Khi độ mịn nguyên liệu tăng lên, bẻ mặt

tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi cũng tăng lên; theo định luật Fick, lượng chat

khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết xuất sẽ nhanh hơn Tuy nhiên

trong thực tế néu xay nguyên liệu quá mịn cũng sẽ gây ra một số bat lợi cho quá trình

chiết xuất,

Khuấy trộn: khi dung môi tiếp xúc với nguyên liệu, dung môi sẽ thấm vào nguyên

liệu hòa tan chat tan, chat tan sẽ khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi qua màng tếbảo Sau một thời gian khuếch tán, nòng độ chất tan trong dung môi tăng và trong tế

bào giảm dân, tốc độ khuếch tán sẽ giảm dần Đến lúc nào đó sẽ xảy ra quá trình cân

bằng giữa hai bên, vì vậy nếu không có sự khuấy trộn quá trình khuếch tán sẽ rất chậm

Do đó dé tăng cường tốc độ khuếch tan, người ta thực hiện việc khuấy trộn [38]

1.4.3 Định danh các loại hợp chất tự nhiên

Từ mẫu cây sử dụng những kĩ thuật chiết tách khác nhau đề có được cao chiết toản

phân hoặc các loại cao có tính phân cực khác nhau Áp dụng phương pháp phân tích sơ

bộ về hoá - thực vật đề biết trong cao chiết có thé chứa các loại hợp chat tự nhiên nao.Sau đó, cần tiễn hành xác định sự hiện diện của các loại hợp chat tự nhiên nói trên bằng

những phương pháp cụ thé hơn, dé có thé chọn các biện pháp xử lí thích hợp nhăm cô

1.5 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về quy trình nhân nhanh giống và các hợp chất sinh học

I Kostova & D Dinchev (2005) đã nghiên cứu “Saponin trong Tribulus terrestris L.

- hóa hoc và hoạt tính sinh hoc” đã kết luận ham lượng cao của saponin steroid là một

tính năng đặc trưng của loại cây này, Các hợp chất được tìm thấy như tigogenin,

neotigogenin, gitogenin, neogitogenin, hecogenin, neohecogenin, diosgeni, chlorogenin, ruscogenin thuộc nhóm saponin furostanol va spirostanol, một vai loại

sarsasapogenin thường được tim thấy trong cây Bốn hợp chat saponin sulphat hóa thuộc

loại tigogenin và diosgenin cũng được phan lập Các lượng đường của furostanol cô lập

va spisaponin rostanol là oligosaccharid, chứa 2-4 loại đưởng khác nhau - glucose,rhamnose, galactose và xylose Chiết xuất các saponin đã được tìm thấy có các hoạt tínhđược lý khác nhau [15]

Dragomir Dinchev và cộng sự (2007) so sánh sự hiện điện cua steroidal saponins

trong Tribulus terrestris L từ các vùng địa lí khác nhau Cac saponin steroid được coi

là yếu tổ chịu trách nhiệm cho hoạt động sinh học của các sản phẩm có nguồn gốc từ

thực vật này Hoạt tính phụ thuộc vào nông độ và thành phần của saponin hoạt động do

đó chịu anh hưởng của nguồn gốc địa lí của nguyên liệu thực vật Kết qua cho thấy sự

khác biệt rõ rệt vẻ hàm lượng của các hợp chất này tùy thuộc vào khu vực lấy mẫu, phânthực vật được nghiên cứu và giai đoạn phát trién của cây.[43]

Nguyễn Thế Chiến và cộng sự (2008) đã tiên hành phân lập tribulosin, một

spirostanol saponin từ cao n — butanol cây Bach tật lê (Tribulus terrestris L.) bằng

phương pháp sắc kí Kết quả thu được trubulosin (TLBS) dưới dạng bột không màu,không tan trong EtOAc, CHC]:, tan it trong MeOH, tan nhiêu trong hỗn hợp CHC]:-

MeOH (1:1), điểm tan chảy mp = 303 — 305°C [44]

Dương Tan Nhựt và cộng sự (2009) đã tién hành nghiên cứu vẻ cây Sâm Ngọc Linh

và tác giả đã ghi nhận rằng đối với nòng độ 0.5 - 3mg/1 2,4-D tỉ lệ sẹo đạt 100% ở các

nghiệm thức nuôi cấy cuốn lá, và giao động từ 20 — 90% đối với các nghiệm thức nuôi

cấy lá Mô sẹo được ghi nhận có mảu vàng vả cứng Thời gian chiều sáng 16h/ngay cho

tỉ lệ tạo mô sẹo tương đương với nuôi cấy mô sẹo trong điều kiện tối hoàn toan, tuy

nhiên tác giả cho biết chất lượng sẹo và số lượng sẹo ở điều kiện tối thấp hơn ở điều

kiện chiều sáng 16h/ngày do sự hình thành tỉnh thê [41].

Bùi Dinh Thạch và cộng sự (2011) đưa ra kết quả đề tài “Diéu tra và xác định hàmlượng hoạt tính chất tribulosin trong cây Tat lê (Tribulus terrestris L.) phân bỗ ở ViệtNam” Tác giả nhận định hàm lượng Tribulosin trung bình của cây Tat lê đạt 0,0S§mg/g.Ham lượng Tribulosin cao nhất đạt 0,083mg/g (Đà Nang) và thấp nhất đạt 0.044 mg/g

(Phú Yên) Mẫu có số hiệu ĐNI (Đà Nẵng 1) thu ở vùng ven biên thuộc quận Sơn Trà

và Ngũ Hanh Sơn, thành phố Đà Nẵng có ham lượng Tribulosin cao nhất (0,189 mg/g).

Với nghiên cứu của Ngô Thị Trang va cộng sự (2016) đã kết luận: Sẹo hình thành và

phát triển thu được từ lá trong 2 — 3 tuần ở môi trường MS với nồng độ 0.5 — 2.5 mg/l2,4-D Mô sẹo được duy trì nuôi cấy trong 4 tuần, tỉ lệ sẹo tăng dần khi nồng độ 2,4-D

tăng, cụ thé tỉ lệ sẹo đao động từ 16,67% đến 80% Ở tat ca nghiệm thức có bd sung

2.4-D, ghi nhận mô sẹo đều có màu nâu, vàng và xốp mềm [39]

Đến năm 2020, Phạm Thị Mỹ Tâm va cộng sự đã nghiên cứu về nuôi cấy mô sẹo từ lát cắt thân non Xa den, tác giả ghi nhận thấy tỉ lệ hình thành seo đạt 100% ở nồng độ 1

mg/l 2,4-D và thời gian tạo seo chỉ sau 4 ngày nuôi cay Sau 4 tuần nuôi cấy, nhóm tác

giả ghi nhận mô sẹo mong nước, xốp và có mau trắng đục, trắng xanh Sau 2 tuần nuôicấy khối lượng sẹo chỉ 0,026g nhưng kết quả ghi nhận được sau 4 tuần đã thấy khối

lượng sẹo tăng gấp 2 lần dat 0.042g [40]

Chunlian Tian và cộng sự (2021) tiến hành nghiên cứu công nghệ chiết xuất, phân

tích thành phần, hoạt động chồng oxy hóa, kháng khuân, giảm đau và chống viêm của phần nhỏ flavonoids từ 7' terrestris L Cho thấy 14 chế phẩm được xác định tách biệt

với phan flavonoid bằng HPLC-DAD-ESI-MS2 Ngoài ra, phan flavonoid thé hiện hoạtđộng chống oxy hóa tốt hơn được thé hiện bang các xét nghiệm ABTS, hoạt động quét

góc DPPH và hoạt động năng lượng chống oxy hóa làm giảm chất sắt [42]

Gai ma vương là một được liệu với rất nhiều công dụng, nhưng hiện đang được xếp

vào Sách đỏ Việt Nam với mức độ nguy cấp (EN), cho thấy đây là loài cần được bảo

ton va nhân giống Đồng thời, với những giá trị được liệu mà loài Gai ma vương mang

lại đã thúc day việc khai thác loài này trong tự nhiên ngày càng nhiều Vì thé việc nhân

giống nhằm duy trì nguồn giống và đồng thời cung cấp nguồn được liệu Gai ma vương

Với một số lượng lớn phục vụ cho nhu cầu của cộng đồng, tìm hiểu hoạt chất sinh học

để khai thác các giá trị của loài này một cách bền vững là một điều can thiết.

Trên thé giới, đã có những công trình nghiên cứu về nhân nhanh giống loài Gai mavương, còn ở Việt Nam đã có những bước đầu thực hiện những nghiên cứu về Gai mavương nhưng có rat it công trình nghiên cứu nhân nhanh gidng để bảo tôn, nhân giống

nhằm tăng sinh và nghiên cứu về hoạt chất của loài Gai ma vương Vì thé việc nghiên cứu kĩ thuật và quy trình nuôi cay mô loài Gai ma vương trong điều kiện in vitro để

nhân nhanh giống vả tăng sinh mô, hoạt chất là rất cần thiết và ý nghĩa về mặt thực tiễn

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Hinh 2.1 Vi tri thu mau

Tién hanh thi nghiệm in vitro: Phong thi nghiệm Sinh thái — Thực vật (M203), khoa

Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thanh phó Hò Chí Minh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn nguyên liệu nuôi cấy

2.2.1.1 Nguôn mau hạt Gai ma vương

Thu mẫu: Tién hanh thu quả loài Gai ma vương tại phường Bao An, Thanh phố Phan

Rang — Thap Cham, Tinh Ninh Thuan Chon qua chin, mau xanh hoi vang, khi cham

vào qua dé rụng va tách thành 5 mảnh quả rời nhau.

2.2.1.2 Nguồn nguyên liệu in vitroNguyên liệu tao cây in virro là các hạt chắc của cây Gai ma vương đã được bóc vỏhạt,

Nguyên liệu tạo sẹo in vitro cho việc tạo mô sẹo là lá chét của cây khoảng 1,5 tháng

tuôi được nuôi cay trong điều kiện in vitro

Hình 2.2 Quả loài Gai ma vương Hình 2.3 Hạt loài Gai ma vương

Phêu thủy tinh Muỗng cân hóa chat

THIẾT BỊ Nỗi hap vô trùng

Đèn côn, kẹp gap mau

Bếp điện từ, nỗi nau môi eo

Đũa thủy tỉnh

Máy cô quay

CoC]:.6H¿0 Myo-inositol

— PyridoxineHCI _

Stock vitamin Thiamine HCI

Ngoài ra trong đề tài, chúng tôi còn sử một so hóa chat khác như NaOH IN, HCI 1N,

Stock khoáng

đa lượng

côn 70°, sodium hypochlorite

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu chính của dé tải được trình

bay tóm tắt trong sơ đồ sau đây:

| Hat chắc Gai ma vương |

Khử trùng hạt |

Nuôi cây hạt trong môi trường MS

Cây 1,5 tháng tuôi in vitro

Tạo seo từ lá ebét trong melt trường MS với ndeg

độ | ing’ 24 - D và 1 sz/1 Kinetin kết hợp:

Thi nghiệm ting sinh khối từ mổ sẹo

Hình 2.5 Sơ đồ quá trình nghiên cứu

Š nghiệm thức 3.4

-2.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô in vitro loài Gai ma vương

2.3.1.1 Điều kiện nuôi cayMẫu được cấy trên môi trường MS có bồ sung các chất điều hoà tăng trưởng thực vật,

được khử trùng ở 1,4 atm, 121 °C.

pH của môi trường là 5,8 — 6.0.

Nhiệt độ phòng nuôi là: 25 + 2°C.

Cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng là 12 giờ sáng

2.3.1.2 Vô trùng hạt Gai ma vương bằng sodium hypochlorite

Lựa chọn các hạt chắc, còn nguyên vỏ hạt, không bị tôn thương, tiễn hành vô trùng

theo các bước:

Ngâm hạt trong nước xà phòng 2 - 3 phút.

Rửa sạch dưới vòi nước chảy.

Khi đưa vao tủ cấy: khử trùng bẻ mặt với cồn 70° trong 30 giây Rửa lại 5 lần với nước cất đã hắp vô trùng.

Ngâm va lắc hạt trong sodium hypochlorite 1% trong thời gian 1 phút

Rửa lại 5 lần với nước cat vô trùng va tiền hành cấy mẫu

2.3.1.3 Các thí nghiệm anh hưởng của 2,4-D lên sự tạo sẹo

Lá chét của cây Gai ma vương sau khi được thu trong điều kiện in vitro sé được

chuyển vào môi trường MS bé sung chat điều hoa sinh trường 2.4-D với các nông độ

khác nhau để khảo sát sự tạo sẹo Mỗi nghiệm thức cay 10 mau va lap lai 3 lần Thời

gian nuôi cay in vitro là 8 tuần Mẫu được nuôi trong bình tam giác 250ml

Bảng 2.3 Bồ trí nghiệm thức tạo seo

2.3.1.4 Các thí nghiệm anh hưởng của 2,4-D lên sự tăng sinh và tích luỹ hoạt chất

sinh học trong mô sẹo lá cây Gai ma vương.

Lá chét của cây Gai ma vương khi được thu trong điều kiện in vitro sẽ cay vào môitrường MS có bé sung 1,0 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l kinetin dé tạo mô sẹo lá trong 2 tuần

Sau đó chuyên mô sẹo vào môi trường MS ở các nồng độ 2,4 - D khác nhau dé khảo sát

sự tăng sinh và tích luỹ hoạt chat sinh học trong lá chét cây Gai ma vương Mỗi nghiệm

thức cây chuyền 10 mẫu vả lặp lại 3 lần Thời gian khảo sát trong môi trường nuôi cấy

in vitro là 4 tuần Mẫu được nuôi trong bình trụ 250ml.

Bảng 2.4 Bồ trí nghiệm thức cây chuyền

2.3.2 Phương pháp cắt nhuộm mẫu

Cắt mẫu trực tiếp bằng tay với lưỡi đao lam.

Sử dụng phương pháp nhuộm kép của Tran Công Khánh (1981), gồm các bước:

Ngâm mẫu sẹo vào nước javel trong 15-20 phút dé tây sạch nội chất của tế bao, rửa sạch lại bằng nước cat dé loại Javel.

Ngâm mẫu sẹo với acid acetic 1% khoảng 5 phút dé loại hết javel còn lại, rửa sạch mẫu bằng nước cat dé loại acid acetic.

Nhuộm đỏ mẫu bằng dung dịch carminphén trong 30 phút, rửa lại bằng nước cat 2

-3 lần.

Nhuộm xanh mẫu bằng dung dịch xanh metylen 3% trong 30 giây, rửa sạch bằngnước cat

Màng tế bào sẽ bắt màu đỏ, màng tế bào hóa gỗ, hóa suberin sẽ bắt màu xanh.

Sau đó lên kính bang giọt glycerin, đặt lên kính hiển vi quan sát các thành phan của

tế bào [46]

2.3.3 Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng hoạt chất sinh học

của Gai ma Vương

Tạo dịch chiết bằng methanol, được tiên hành theo phương pháp của Nguyễn Kim

Phi Phụng (2007)

2.3.2.1 Phương pháp định tính thành phân hoạt chất sinh học Xác định sự hiện diện của các nhóm hợp chất thực vật có trong địch chiết theo quy trình của Tambe and Bhambar (2014) có cải tiến.

Phenolic: cho 50 pL địch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 500 L nước cất và 2 - 3giọt FeCl: 5% Néu dung dich xuat hiện kết tủa màu xanh đen, chứng tỏ địch chiết chứahợp chất của phenolic.

Flavonoid: cho | mL dich chiét cho vao ống nghiệm, thêm vải giọt HaSO¿ đậm đặc

Cho thêm 0,1g bột Mg Thêm từ từ rượu isoamylic vào rồi đun nóng Nếu dung dịch

xuất hiện mảu hồng sau đó chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím chứng tỏ địch chiết có sự

hiện điện của hợp chất flavonoid.

Alkaloid: cho 2 mL địch chiết phan ứng với 3 mL thuốc thử Bouchardat (2,5g iod, 5g

KI, và 100 mL nước cất) dé gây kết tủa hoàn toàn acid của alkaloid Nếu trong dịch chiết

thì dung dịch xuất hiện nhũ tương màu sữa [47]

2.3.2.2 Phương pháp định lượng thành phần hoạt chất sinh học

Định lượng các hợp chất trong dịch chiết cũng được thực hiện theo phương pháp của

Tambe and Bhambar (2014) có cải tiền

Hàm lượng phenol tong (mg/g trong lượng khó): Nồng độ phenolic tông trong mẫu

mã đề được xác định theo phương pháp Folin-Ciocalteu như sau: Hỗn hợp phan ứng baogồm 1 mL dịch chiết và 9 mL nước cất cho vào bình định mức 25 mL; thêm | mL thuốc

thử Folin-Ciocalteu vào hỗn hợp và lắc déu; sau 5 phút, thêm 10 ml dung dịch NaxCOs

35%; sau đó thêm nước cat dé dung địch vừa đú 25 mL; ủ mẫu trong 90 phút ở nhiệt độ

phòng Thực hiện phản ứng của các dung dịch chuẩn của gallic acid (nông độ 20, 40,

40, 60, 80 va 100 ng/mL) tương tự như mẫu địch chiết Sau khi ủ, tiến hành độ hap thụ

đối với dung dịch dịch chiết và dung dịch chất chuẩn ở bước sóng 550 nm

Hàm lượng flavonoid tổng (mg/g TLK): Tông lượng flavonoid được xác định thông

qua sự tạo phức chất với aluminium chloride như sau: cho 1 mL dịch chiết và 4 mL nướccất vào bình định mức 10 mL; thêm 0,3 mL sodium nitrite 5% và để trong 5 phút; sau

đó thêm 0,3 mL aluminium chloride 10%; sau 5 phút, cho thêm 2 mL dung dich NaOH

IM và định mức đến 10 mL bằng nước cất Các dung dịch chuan của quercetin (20, 40,

40, 60, 80 and 100 tug/ml) được chuẩn bị tương tự như mẫu địch chiết trên Độ hap thụ

đối với các dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn được đo ở bước sóng 510nm [47]

2.3.3 Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu

Theo dõi các chỉ tiêu:

Tỉ lệ tạo seo = (EZ số mẫu tạo sẹo / E số mẫu cây ban đầu) x 100 (%)).

Khối lượng seo = khối lượng trung bình của 30 mẫu sẹo trên 1 nghiệm thức.

Thời gian tao seo = thời gian trung bình của 30 mẫu trên | nghiệm thức.

Đặc điểm mẫu sẹo = màu sắc va độ đặc xốp của sẹo sau mỗi tuần.

Dùng toán thông kê đẻ xử lí các số liệu thu được và ứng dụng thong kê toán học trong

sinh học sử dụng phần mềm Excel 2007 và SPSS phiên ban 20 dùng cho Windows dé

xử lí các số liệu

Chương 3 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Anh hưởng của 2.4 - D lên khả năng phát sinh seo từ lá chét của cây Gai

ma vương trong điều kiện in vitro

3.1.1 Anh hưởng của 2,4 - D lên chỉ tiêu về tỉ lệ và thời gian tạo sẹo từ lá

chét cây Gai ma vương trong điều kiện in vitro

Lá được xem là nguồn nguyên liệu khá phô biến trong các nghiên cứu tạo mô sẹo, do

lá có thé tái sinh liên tục và không làm chết cây khi thu mẫu Bên cạnh đó, 2,4-D thường

được sử đụng lam nguồn auxin ngoại sinh cho việc hình thành sẹo ở các loài thực vật

[48] (49] [50] [51] Theo d6i qua trình tạo seo từ mẫu lá chét của loài Gai ma vương

sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bỏ sung 2,4-D ở 5 nồng độ khác nhau (0,4mg/l: 0,8 mg/l; 1,2 mg/I; 1,6 mg/l và 2 mg/l) Kết quả thí nghiệm được thé hiện ở bang3.1 dựa trên ti lệ tao seo và thời gian tao seo như sau:

Bang 3.1 Ảnh hưởng của 2,4 - D đến tỉ lệ và thời gian tạo seo của mau lá chét

loài Gai ma vương sau 8 tuần nuôi cay trong điều kiện in vitro

Ở nghiệm thức đối chứng (nồng độ 0 mg/l 2,4 — D), sau 10 ngày nuôi cấy mau lá chét

cây Gai ma vương bắt đầu có dau hiệu chết dan, tỉ lệ mẫu cay seo là 0% và sau 14 ngàythì tắt cả các mẫu ở nghiệm thức đối chứng đã chết hoàn toàn

Đối với nghiệm thức 1 (nông độ 0.4 mg/l 2.4 — D), sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy khả

năng tạo sẹo ở nghiệm thức này là thấp nhất, ti lệ tạo sẹo chỉ đạt 53,33% và có sự khác biệt thông kê so với các nghiệm thức còn lại Quá trình cảm ứng tạo sẹo ở nghiệm thức

1 cũng diễn ra chậm hơn so với các nghiệm thức còn lại là 10,23 ngày.

Nghiệm thức 2 (nồng độ 0,8 mg/l 2.4 — D), sau 8 tuần nuôi cay cho thay khả năng tạo

sẹo ở nghiệm thức này đạt mức trung bình 60% và có sự khác biệt thông kê so với

nghiệm thức 3 và nghiệm thức 4 Thời gian cảm ứng tạo sẹo ở nghiệm thức này trung

bình đạt 8.26 ngày va có sự khác biệt thông kê so với tất cả các nghiệm thức còn lại

Ở nghiệm thức 3, trong điều kiện môi trường MS bỏ sung 1,2 mg/l 2,4 — D, cho thay

tỉ lệ tạo sẹo cao vượt trội hơn hắn so với nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 đồng thời có sự khác biệt thống kê Khả năng tạo sẹo đạt tỉ lệ cao nhất

trong các nghiệm thức đạt 93,33% sau 8 tuần nuôi cay, Theo quan sát, thời gian tạo sẹo

ở nghiệm thức 3 tương tối nhanh đạt 5.63 ngày

Ở nghiệm thức 4 (nồng độ 1,6 mg/l 2,4 — D), sau 8 tuân nuôi cấy cho thấy tỉ lệ tạosẹo ở nghiệm thức 4 tương đối cao đạt 83,33% Theo quan sat, thời gian cảm ứng tạo

seo ở nghiệm thức 4 trung bình đạt 4,6 ngày, cảm ứng seo nhanh nhất và có sự khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại.

Đối với nghiệm thức 5 (nồng độ 2 mg/l 2.4 - D), sau 8 tuần nuôi cay cho thay mặc

di tăng nông độ lên cao nhưng tỉ lệ tao sẹo đã giảm dan so với nghiệm thức 3 va nghiệmthức 4 Kha nang tạo sẹo trung bình đạt 76,67% và có sự khác biệt thông kê so vớinghiệm thức đối chứng Tuy nhiên, thời gian cảm ứng tạo sẹo vẫn tương đối nhanh đạtŠ,7 ngày, không có sự khác biệt so với nghiệm thức 3 nhưng lại khác biệt thống kê so

với các nghiệm thức còn lạ

Ti LỆ TẠO SEO

0,4 mg/L 0,8 mg/L 1.2mg/L 1,6mgL 2 mg/L

Nghiệm thức

Hình 3.1 Anh hưởng của 2.4 - D đến tỉ lệ tạo sẹo từ mau lá chét loài Gai ma vương

sau 8 tuần nuôi cấy trong điều kiện in vitro

THỜI GIAN TẠO SEO

Thời gian tạo sẹo (ngây)

Hình 3.2 Ảnh hưởng của 2,4 - D đến thời gian tạo sẹo từ mẫu lá chét loài Gai ma

vương sau 8 tuần nuôi cay trong điều kiện in vitro