Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm sinh học: Khảo sát khả năng ức chế của oligochitosan đối với nấm alternaria sp gây bệnh đốm nâu trên cây Chanh dây (pasiflora edulis síms) trong điều kiện in vitro

Số liệu của Chi cục Bảo vệ Thực vật tinh Nghệ An 2012 cho thấy tại Nghệ An, vào nam 2012 ti lệ cây Chanh dây bị bệnh do tập đoàn nam gây ra trung bình 5 - 10%, có vườn bị bệnh tới 40 - 5

BỘ GIÁO DUC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HÒ CHÍ MINH

9 CD os

NGUYEN LE ANH KIET

TRONG DIEU KIEN in vitro

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SƯ PHAM SINH HỌC

TP HO CHÍ MINH - 2022

BO GIAO DỤC VA DAO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC SU PHAM TP HO CHÍ MINH

mò hig

NGUYEN LE ANH KIET

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SƯ PHAM SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC

TS Trần Thị Tường Linh

CN Nguyễn Hồng Phúc

TP HO CHÍ MINH - 2022

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Tran Thị Tường Linh vì đã luôn

quan tâm, hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp.

Những kiến thức và kinh nghiệm mà cô đã truyền dạy sẽ là hành trang quý báu đổi với em trên những chang đường sap tới.

Xin chân thành cam ơn CN Nguyễn Hong Phúc đã tận tình hướng dan, hỗ

trợ em những lúc khó khăn trong quá trình thực hiện nghiên cứu.

Chân thành cảm ơn TS Trương Minh Ngọc - Giám đốc Chỉ nhánh Viện Ứng

dụng Công nghệ tại TP Hồ Chí Minh đã tạo điêu kiện cho em được thực hiện nghiên

cứu tại viện, ThS Lê Thanh Bình - Trưởng phòng sản xuất đã giúp đỡ, cung cap các

thiết bị và hoá chất cần thiết để em thực hiện khoá luận Cảm ơn CN Hồ Thị Nguyệt

và ThS Nguyễn Bá Tho đã hướng dan em những thao tác trong phòng thí nghiệm và

đưa ra nhiều lời khuyên, tư van quý báu giúp em hoàn thiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn tới các quý thay cô thuộc Khoa Sinh

học — Trường Đại học Sư phạm Thanh phố Hỗ Chí Minh đã truyền đạt những kiến

thức quý báu, tận tình diu dat em trong suối 4 năm học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ - người luôn bên cạnh động viên con trongnhững lúc khó khan nhất và hỗ trợ cho con mọi mặt cả về vật chất lan tinh than

TP Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 05 năm 2022

SINH VIÊN

Nguyễn Lê Anh Kiệt

MUC LUC

TSU AGO les sscesses sess anveareeassssesssarnsarruatsnnasasannsarsscrmmsanannserninnansanamiann i

LO Gl 6 Oe ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT sssssssssssvsisssissssssssssssissaisossssasssasssssines iv

DANH MUG BANG sscciscessscosssossscossccasscossscosssecasscsisecasscasscasscavssecssacesseessis V

DANH MUC HINH 0 5a vi

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 222-2525: 222 2222232221222312212212225E2ccee i]

2) MỤC TIỂU NGHIÊN CUG (uuangaiatinoiniainaiannannaiiiantaisniaigi 3

3 DOL TƯỢNG NGHIÊN CỬU -22-22222S222scccsccsrecrrrrcee 3SPH AM VINGBIEN Gia naunenaatintiitiiooinonnaanaatastratiortroinii 3

5 NỘI DUNG NGHIÊN COU ccssesssssssssssssssssssscssscsssecsssesescusecssnecesnecss 3

6 ¥ NGHIA CUA DE TAL iiaẳađai 3

ElidnpiilL.TONGIOHAN 2 naaineaaaaeanoinangnsoaae 5

1.1 TONG QUAN VÉ CHANH DAY (Passiflora edulis Sims) 5 1.2 TONG QUAN VE NAM Alternaria Sp ii St sec 6

1.3 TONG QUAN VỀ BỆNH DOM NÂU DO NAM Alternaria sp GAY

RA TREN CAV CHANA DAD sscsssssssssisesisscisssissesesssassstsssisosinostsvanisasivesienivsinsesive 8

1.4 TONG QUAN VE CHITIN VÀ CHITOSAN 5<5cc<scc2 9

1.5 CAC NGHIÊN CỨU TRONG VA NGOÀI NƯỚC 9

Chương 2 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU - 2-55 12

2.1 THỜI GIAN, DIA DIEM VA TƯ LIỆU NGHIÊN CỨU 12

2.2 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CUU sssssssssssssssssssessrernsssssssssensneensess 13

Chương 3 KET QUA VA BAN LUAN o cccseccssssseccssssseesssseseecssesssssneeceens 18

3.1 Kết quả phân lập chủng nam bệnh Alternaria sp từ mau bệnh Chanh

3.2 Kết qua phân lập mẫu bệnh và định danh chủng nắm 193.3 Kết qua định danh phân tứ mẫu nấm LV] -cc5555ss¿ 203.4 Kết quả chế tạo oligochitosan cắt mạch từ chitin bằng phương pháp

F702 sisi MMMM 24

3.5 Kết qua khảo sát khả năng ức chế của oligochitosan được cat bang

2 phương pháp H202 và Co-60 với Alternaria macrospora trong điều kiện in vitro

lẽ cac ốc acc ng 27

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ - 2:22:22 222222 sszc2 35

TÀI LIEU THAM KHẢO - 2 22252 2121112111 11211 21 2 1c ee 37

PH Ge sess csssasscssssasssssssassssasssasscsszsasscsstsesesscssecsssasssaszesstsasszsczseasssesncesveas: l

DANH MUC BANG

Bang 2.1 Các nghiệm thức khảo sát kha năng ức chế nam Alternaria của

oligochitosan cắt bang phương pháp Co-60 và HạO -.2222222ccccccccceec 16

Bảng 2.2 Các nghiệm thức bỏ sung sóc 2 2 22201 1022110210221 2 l6

Bang 3.1 Hiệu qua ức chế nam bệnh (%) của oligochitosan cắt bằng 2

phương pháp H202 và Co-60 lên Alternaria macrospora sau 7 ngày nuôi cay - 27

Bang 3.2 Sự gia tăng về đường kính của khuẩn lạc nam Alternaria

macrospora nuôi cây trên môi trường PDA có bỏ sung oligochitosan cắt bằng 2

phương pháp H:O› và Co-60 sau 7 ngày .- cà cicsirrserireirrerrrrrrrrrer 30

Bang 3.3 Hiệu qua ức chế nam bệnh (%) của oligochitosan cắt bằng 2

phương pháp H:O: và Co-60 lên Alternaria macrospora sau 7 ngày nuôi cấy 353085 31

DANH MUC HINH

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái cây Chanh day (Passiflora edulis) c.ccccccesccssecscesseeoes 5

Hình 1.2 Đặc điềm vi thé của chi Alternnariia 2 S5 2s 2S St c2 SE 22512 11 cszEcce2 7

Hình 1.3 Bệnh đốm nâu trên qua, lá và thân cây Chanh đây 55s 55s §

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh tại vườn : :: c-c-c.cccccerieeeseocee 13

Hinh 2.2 Chitin duge su dung cho qua trinh CAC MACH n 1§

Hình 3.1 Triệu chứng bệnh đốm nâu trên các mẫu lá va qua Chanh day thu được 18

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của mẫu LV1 sau 7 ngày nuôi cấy 19

Hình 3.3 Đặc điểm vi thể của mẫu EˆVÌ is 19 Hình 3.4 Sự phát triển của khuẩn lạc nam LV1 qua các ngày 1, 3, 5 và 7 ngày nuôi

CAV i052i06611455016314548122315560955835584353851385518559855118813851953 5136814 8138335881333943834546152815538953835381.552: 20

Hình 5:5./Bloitì en DV sss cassscssanocesasesocoaasssnsnaanssnesosusssnncasssssncoansnensesessiiessnne 20

Hình 3.6 Kết qua so sánh sự tương đồng của trình tự vùng ITS của chủng LV1 vàcác kết quả blast trên NCBI 22 s22 12 112 11 31 3112111 111721721711711112 12g12 21

Hình 3.7 Cây phát sinh chúng loại của chúng LV1 và các kết qua blast trên NCBI

Hình 3.8 Kết quả so sánh vùng trình tự ITS của chủng LV1 và Alernaria maerospora

578128ã853183587158188593378185515818551585818331885318531813851882819531885838531237858782581127855133187Z539557883118297853138 23

Hình 3.9 Kết quả so sánh vùng trình tự ITS của chủng LV1 và Alernaria zinniae 24

Hình 3.10 Dung dịch chitin ban đầu - 2-52 2222 22222222 22122112211211 21 sec 25

Hình 3.11 Dung dịch chitin sau 9 giờ cắt bằng HzO: .5-c5sccsccc- 25

Hình 3.12 Chitin trước khi cắt 222-222+222122212221222112 2111221121121 122cc 26

Hình 3.14 Dung dich oligochitosan 10% (cắt bằng phương pháp Ha©›) 27

Hình 3.15 Anh hưởng của các mức nông độ oligochitosan cắt bằng phương pháp

Co-60 và H:O: đối với sự phát triển của khuẩn lac A macrospora sau 7 ngày nuôi

Nợ" 6 CC Cô 0/0/0700 00 000050 (0000/00 01 01 Ẳ 29

Hình 3.16 D6 thị thé hiện tỉ lệ phần trăm hiệu quả ức chế nắm Alternaria macrospora

của oligochitosan cat bằng phương pháp Co-60 - -5co: 555 2ccscscsc-escc 32

Hình 3.17 Dò thị thé hiện tỉ lệ phần tram hiệu quả ức chế nắm Alternaria macrospora

của oligochitosan cắt bang phương pháp H2O2 c cccccsssesssesssesssesseessesseesseeereeeveee 33

Hình 3.18 Dường kính khuân lạc của nắm Alternaria macrospora sau 7 ngay nudi

cấy với các nồng độ oligochitosan 0,05%; 0,1%; 0,15%; 0,2% -. - 34

MO DAU

1 LÍ DO CHON DE TÀI

"Chanh day” là từ dân gian gọi hai loại qua Mác mác tia (Passiflora edulis)

và trái Mác mác vàng (Passiflora edulis f flavicarpa O Deg) Do hai loài này đều

cho quả hơi giống nhau và có vị chua chua như Chanh, có thé pha thành nước giải

khát uống thay Chanh nên có tên như vậy Day là loại cây trồng quan trọng, đượctrông tại nhiêu nơi trên thế giới Chanh dây (Passiflora edulis) đã được du nhập vào

Việt Nam từ năm 1998 [I], việc trồng Chanh dây mang lại hiệu quả kinh tế cao Tính

đến năm 2019, Chanh day được trồng tại 36 tỉnh, thành phố trong nước Diện tích

trồng Chanh dây trên cả nước khoảng 10.500 ha, tông sản lượng quả tươi ước tính

khoảng trên 222 nghìn tân, hiện tại Chanh dây đang giữ vị trí thứ 17 trong những loài

cây ăn quả được trồng với tông diện tích trên 10.000 ha tại Việt Nam.

Trong những năm gần đây, người trồng Chanh dây phải đối mặt với một loạtnhững van dé vé dich hại trên loại cây trồng này Theo nghiên cứu của Phan Thị Thu

Hiền (2021) các loại dich hại phổ biến trên Chanh dây bao gồm than thư

(Colletotrichum gloeosporioides), đốm nâu (Alternaria spp.) phình than (Fusarium

solani), Trong đó bệnh dém nâu trên quả và lá Chanh day đã được ghi nhận từ

năm 2011 [1] Số liệu của Chi cục Bảo vệ Thực vật tinh Nghệ An (2012) cho thấy tại Nghệ An, vào nam 2012 ti lệ cây Chanh dây bị bệnh do tập đoàn nam gây ra trung

bình 5 - 10%, có vườn bị bệnh tới 40 - 50% diện tích trồng gây ảnh hưởng rõ rệt tớisinh trưởng và chất lượng quả; trong đó bệnh đốm nâu do loại nắm thuộc chi

Alternaria gây ra khá phô biển và được xem là nguy hiểm đối với Chanh dây [2].

Bệnh gây hại ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây do đối tượng bị gây hại chính

là lá và quả Tác hại của bệnh gây ra rất nghiêm trọng gây suy giảm chất lượng vànăng suất quá thương phẩm, giảm tuôi thọ nhiều vườn Chanh day

Chitosan là một polymer sinh học gồm các đơn vị của glucosamin và

N-acetylglucosamin liên kết với nhau qua cau nói B-1,4-glucoside Do các đặc tính quý

như không độc, tính tương hợp sinh học cao nên chitosan được sử dụng nhiều trong bao quản thực phâm, trong lĩnh vực y tế để làm màng điều trị bỏng [3] Chitosan và

các phân đoạn oligochitosan cũng có kha năng kháng các loại vi khuân, virus, nam

bệnh trên thực vật mà không gây ô nhiễm môi trường, do vậy chitosan rất hữu ích

trong việc sản xuất các loại nông sản và rau quả sạch [4], [5], [6] [7] [8]

Các nhà khoa học đã phát hiện rằng oligochitosan tác động lên hệ thông miễn

dịch của thực vật theo các con đường sau:

- Tác động lên thực vật như một hormone tín hiệu: Khi tín hiệu oligochitosan

đi vào tế bào chất sẽ truyền nhanh chóng và phát triển một mạng lưới tín hiệu phức

tạp Ca**, nitric oxide (NO), Jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA) va abscisic acid

(ABA) đều tham gia vào con đường tin hiệu hoạt hóa oligochitosan Kluesener và

cộng sự (2002) báo cáo rằng oligochitosan lam tăng nông độ Ca** tự do trong tế bào

của cây Arabidopsis [9] Trong một nghiên cứu khác được thực hiện trên cây Bông

vải, thuốc chen kênh Ca?* LaC13 hoặc trifluoroacetic acid đối kháng calmodulin được

đồng xử lý với oligochitosan (DP = 3 - 7) làm giảm các hoạt động của enzyme liên

quan đến phòng thủ do oligochitosan gây ra [10] Những kết quả này cho thay Ca?

là một yếu tổ quan trọng trong việc truyền tín hiệu oligochitosan

- Thông qua thy thể: oligochitin (sản phẩm acetyl hóa của oligochitosan) có

thé tạo liên kết ái lực cao với một protem gọi là octa-N-acetylchitopentaose năm trên màng tế bào hoặc màng vi thể của một số loài thực vật như Lúa gạo Lúa mạch, Đậu

tương, Ca rốt [11], [12], [13], [14]

- Thông qua gene và protein đáp ứng oligochitosan: Cac gene dap ứng

oligochitosan là một phát hiện mới về cơ chế miễn dịch thực vật gây ra bởi

oligochitosan Có nhiều protein liên quan đến phòng vé/tin hiệu như MAPK [15],

SKPI [16], OPRI [17], WRKY [18] được xác định lam tăng điều tiết oligochitosan

trong Lúa gạo Thuốc lá, hạt Cải dầu Các nghiên cứu cho thấy oligochitosan có thểtạo ra một số protein, enzyme liên quan khả năng phòng vệ của thực vật như

glucanase, chitinase, PAL,

- Thông qua các chất chuyển hóa thứ cap: Oligochitosan có kha năng kíchhoạt hệ thông phòng vệ của thực vật thông qua sản xuất các chất chuyên hóa thứ cấp.Hadwiger và Beckman (1980) nhận thay oligochitosan tir thanh tế bào F solani có

thé tạo ra pisatin (một phytoalexin) trong vỏ đậu tương trong 24 giờ [19].

Oligochitosan còn tăng cường tạo lignin làm vững chắc thành tế bào thực vật [20]

Với những lí do nêu trên, đẻ tài “Khao sát khả năng ức chế của oligochitosan

đối với nam Alternaria Spp gây bệnh đốm nâu trên cây Chanh day (Passiflora edulis Sims) trong điều kiện in vitro” được đề xuất thực hiện; qua đó, nhằm góp phan cung

cấp những dẫn liệu cần thiết cho việc nghiên cứu kha năng phòng bệnh đốm nâu do

nam Alternaria spp gây ra của chế pham oligochitosan trong điêu kiện đồng ruộng.

Từ đó, góp phan dé xuất giải pháp bảo vệ thực vật an toàn, ít độc cho cây trồng và

môi trường: cung cấp dữ liệu cho việc triển khai nghiên cứu và ứng dụng chế pham

oligochitosan ra thị trường.

2 MỤC TIEU NGHIÊN CỨU

Đánh giá được kha năng ức chế của oligochitosan cắt bang hai phương pháp

H:O: và Co-60 đối với nam Alternaria spp gây bệnh đốm nâu trên cây Chanh dây

trong điều kiện phòng thí nghiệm.

3 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đề tải nghiên cứu trên đối tượng là khả năng ức chế của oligochitosan - cắt bằng

hai phương pháp H;O; và Co-60 đối với nam Alternaria spp gây bệnh đốm nâu trên

cây Chanh dây.

4 PHAM VI NGHIÊN CỨU

Dé tai được thực hiện trong điều kiện in vitro, trên chủng nắm Alternaria Spp

phân lập được từ các mẫu lá va qua bệnh đốm nâu thu thập trong vườn Chanh dây 8

tháng tudi tại thôn Da Sơn, xã Da K’nang, huyện Dam Rông, tinh Lâm Đồng

5 NOI DUNG NGHIÊN CỨU

1) Phân lập va định danh chủng các nam Alrernaria spp thu thập trên các mẫu

lá và quả Chanh đây có biêu hiện bệnh đôm nâu.

2) Đánh giá kha năng ức chế của oligochitosan cắt bằng hai phương pháp H›Oa

và Co-60 đối với nắm Alternaria spp phân lập được.

6 Ý NGHĨA CUA DE TÀI

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài có thé được bỏ sung vào nguồn tài liệu

tham khảo trong công tác nghiên cứu, giảng dạy và học tập trong lĩnh vực Sinh học

và Nông học.

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của dé tài có thể góp phần vào cơ sở khoa học cho việc sử dụng oligochitosan như một hoạt chất sinh học trong bảo vệ thực vật.

Chuong 1 TONG QUAN

1.1 TONG QUAN VE CHANH DAY (Passiflora edulis Sims)

Ặ-Hình 1.1 Đặc điểm hình thái cây Chanh day (Passiflora edulis) [23]

Chanh dây (Passiflora edulis Sims) - hay Lạc tiên trứng, Chùm bao trứng,

Mác mác (Tây) Chi pha kỳ thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) - có dang cây leo mảnh,

dai hàng chục mét Than cây mem, hình trụ, có rãnh doc, nhiều lông thưa Lá mọc so

le, chia 3 thùy nhẫn bóng, mép khía răng, gốc lá hình tim có 2 tuyến nhỏ, đầu nhọn,

gân lá chẻ 3 từ gốc; lá kèm nhọn hình sợi, tua cuỗn mọc ở kế lá, dai hơn lá, đầu cuộn

lại như lò xo (Hình 1.1.) [24].

Hoa Chanh đây mọc riêng lẻ ở ké lá, có cuống dai, màu trắng: không có tổng bao; dai 5 lá mau xanh luc, tràng 5 cánh rời nhau, xếp xen kẽ với các lá đài, có một

vòng tua gồm rất nhiều phan phụ hình sợi chỉ (tràng phụ) loin xoăn, phần giữa màu

tím, nhị 5 mọc ở ngọn cuống nhị nhụy, chỉ nhị năm ngang, bao phan mau vàng, bau

thượng hình cầu, 1 6 Quả mong, hình trứng khi chín mau da cam; hat nhiều có áo

bao bọc Cây ra hoa vào tháng 3 - 5 [24].

Chanh dây thuộc loại cây ưa sang và mọc nhanh có biên độ sinh thái khá rộng

và có thê trồng ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới Nhiệt độ trung bình 15 - 30°C, lượng

mưa 2.000 - 3.000 mm/nam Cây sống được trên nhiều loại đất, trồng được bằng hạt,

sau khoảng 2 tuần hạt sẽ nảy mầm và cho quả sau 5 - 6 tháng Cây trồng bằng cành

sẽ nhanh ra qua hơn Chanh đây trồng ở Việt Nam cho nhiều qua (10 - 15 kg

qua/cay/nam) [24].

Quả Chanh day loại tia chứa 49,6% vô quả, 36,8% dich quả và 13,6% phancòn lại Vỏ quả chứa nhiều pectin và khi thủy phân tạo ra D-galacturonic, L-arabinose

va galactose; ruột qua chứa 97% cyanidin 9-glucosid; dịch quả chứa 70 mg/100 g

vitamin C, dehydroscorbic acid, carotenoid (chủ yếu là B-caroten), tỉnh dau va amino

acid [24].

Qua chín có thé được dùng làm món trắng miệng sau bữa ăn Thịt qua Chanh dây được dùng làm thuốc bỏ kích thích than kinh Thịt quả và dịch ép từ quả được xem là có giá trị dinh dưỡng cao dùng dé pha chế đô uống, làm đồ hộp, bánh kẹo,

kem Dau từ hạt có thé dùng dé ăn [24]

1.2 TONG QUAN VE NAM Alternaria sp.

1.2.1 Dinh loai

Chi: Alternaria Họ: Dematiaceae

Bo: Moniliales

Lớp: Hypomycetes

Nganh Nam túi: Ascomycota [25]

chua, Quyt và Táo Ngoài ra, bào tử nắm Alternaria là một trong những chất gây dịứng phô bién trong không khí [26].

Đặc điềm phân loại chính của các loài Alrernaria là chúng tạo ra các túi bào

tử lớn, đa bao, sâm màu Các túi bào tử này rộng nhất ở phần gốc và thuôn dan tạo

thành dạng chùy Chúng được tạo ra trên một cảnh đơn hoặc phân nhánh trên các

cuống ngắn, mọc thăng Nhìn chung, việc phân loại dựa trên các đặc điểm của túi bào

tử khá phức tạp do sự tương đông với các Chi nam Stemphylium và Ulocladium [26].Simmons (1995) phân biệt các loài Stemphylium và Alternaria dựa vào cau trúc phanđôi ở định cuống bào tử, cấu trúc nay chi xuat hiện ở Stemphylium (Hình 1.2) [27]

Có hơn 100 loài thuộc chi Alternaria đã được mồ tả, do sự đa dang của các loài

Alternaria, việc phân chia thành các nhóm phụ đôi khi được đẻ xuất Tuy nhiên, chođến nay vẫn chưa có một phân loại chung về Alternaria nào được thừa nhận [26]

1.3 TONG QUAN VE BỆNH DOM NÂU DO NAM Alternaria sp GAY RATREN CAY CHANH DAY

Nhìn chung, các loài Alternaria là mam bệnh trên lá gây ra sự phá hủy tương

đối chậm các mô của vật chủ thông qua việc gây suy giảm chức năng quang hợp, gây

nhiễm trùng và dẫn đến các tôn thương hoại tử Nam phát triển ở trung tâm vết bệnh.

bệnh không ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển nước và chất dinh dudng trong cây

vì chúng không nhắm đến mục tiêu là rễ hoặc mạch [26], [29]

Ở Alternaria không ghi nhận sự xuất hiện của giai đoạn hữu tính hay bào tửngủ Đông nhưng nắm có thé tồn tại một thời gian đáng kẻ dưới dang sợi nắm hoặc

bào tử trên xác thực vật thôi rửa [29] Trong trường hợp khác, khi bào tử vô tính được

hình thành, chúng được phat tán cha yếu nhờ gió và lây lan trên be mặt thực vật sau

S|

Hình 1.3 Bệnh dém nâu trên quả, lá và thân cây Chanh day [30]

đó gây nhiễm nam [26].

A

Bệnh đốm nâu do Alternaria passiflorae Simmonds thường xuất hiện vào mùa

xuân và đầu mùa hè với nhiệt độ và độ am cao là điều kiện thích hợp cho nắm phát

triển Các dấu hiệu của bệnh thường xuất hiện trên cả qua, thân và lá Trên qua, dấu

hiệu đầu tiên của bệnh là các cham rất nhỏ bằng đầu mũi kim sau lớn dan, chuyênthành các đốm tròn lõm ở giữa và có tâm màu nâu Vỏ quả dan dần nhãn nheo, teo

nhỏ rồi rụng Trên lá, ban đầu xuất hiện những dom nhỏ mau nâu, sau đó lan rộng

thành đốm lớn hơn, hình dang không cố định, tâm màu sáng với đường kính khoảng

2 em Trên thân bệnh biéu hiện bằng những vệt thon đải màu nâu đen, vị trí gần nách

lá hoặc gần gân lá Một thời gian sau vết bệnh sẽ lan đần ra và bao quanh thân cây, phan ngọn bên trên sẽ bị héo và chết dan.

1.4 TONG QUAN VE CHITIN VA CHITOSAN

Theo Trang Sĩ Trung và cs., chitin là polyme hữu cơ phố biến trong tự nhiên

sau cellulose Chitin ít khi ở dang tự do mà luôn liên kết với protein đưới dạng phức

hợp, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, gây khó khăn cho việc tách chiết.Chitin là một polysaccharit được cấu tạo bởi các monosaccharit liên kết với nhau

bằng liên kết 1 — 4 glucosid, có công thức phân tử là (CsHOsN)p Chitin có cau trúc hoá học giống cellulose và có thể xem như một dẫn xuất của cellulose với nhóm acetanmido ở cacbon số 2 [31]

Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl (quá trình deacetyl hoá chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino.

Chitosan được phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859, Chitosan thường ởdang vay hoặc dạng bột có màu trắng ngà Công thức cau taho của chitosan gân giống

như chitin va cellulose, chi khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2 [31]

Không giống như chitin chi tan trong một số ít hệ dung môi chitosan tan tốt

trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, pKa của chitosan trong môi trường acid loãng luôn tạo thành keo dương Day la một

điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharit tự nhiên tích điện âm Chitosan tíchđiện dương sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm và có khả nặng tạo

phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polyme tích điện âm [31]

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Tran Thi Thanh Bình va cs (2019) đã nghiên cứu khả năng kiểm soát namAlternaria sp gây bệnh đốm nâu trên lá Chanh day bằng chế phẩm Trichoderma

atroviride T4 kết quả nghiên cứu cho thay Trichoderma atroviride T4 có kha nang

đối kháng rất cao với nam Alternaria sp., với tỉ lệ đối kháng cao lên đến 92,3% [32]

Phạm Đình Dũng va cs (2017) da sử dụng chế phẩm oligochitosan - nano

silica nghiên cứu kha năng kháng nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh than

thư trên cây Ot (Capsicum frutescens L.) cho thay có kha ức chế sự phát triển của tan

nam tương ứng 15,6 đến 67,2% và có khả năng gia tăng hàm lượng chlorophyll và

tăng khả năng kháng bệnh của cây Ot từ 37,8 lên 88,89% [31]

Lê Thanh Long và es (2015) đã sử dụng nanochitosan ở nông độ 1,6 g/L có

khả năng ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng, phát triển của C acutatum L2 trong điều kiện in vitro và ở nông độ 4 g/l có khả nang ức chế 76% sự phát triển của đường kính vết bệnh sau 10 ngày thử nghiệm ở điều kiện in vivo [33].

Theo Dang Van Phu và cs (2019), phức hợp oligochitosan-Zn** cho hiệu quả

khang nam của các phức chat đạt 75-100% so với khoảng 12% đối với oligochitosan

[34].

Nguyễn Duy Hang và cs (2018) đã báo cáo rằng chitosan chiều xạ kết hợp với nam Trichoderma có kha năng ức chế sự phát triển của Phytophthora spp trong

điều kiện in vitro và nhà kính [35]

Theo Đặng Xuân Dự (2015) khi nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng hiệu ứngđồng vận HO; va bức xa gama CobanTM dé ché tao oligochitosan, gốc hydroxyl tạo

ra trong quá trình phân ly bức xạ là tác nhân chính gây ra sự cắt mạch chitosan thông

qua cơ chế bắt hydro tạo thành gốc tự do, các gốc tự do sau quá trình chuyền vị vả táikết hợp tạo thành chitosan khối lượng phân tử thấp [37]

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Trên thé giới, các công trình nghiên cửu ứng dung chitosan trong nông nghiệp

đã được thực hiện từ rất lâu, đặc biệt trong lĩnh vực đối kháng nắm bệnh và tăng năngsuất cây trồng

Rodriguez va cs (2019) đã báo cáo răng khi xử lí cây Cà chua con với 0,01%

chitosan có thé lam giảm đáng ké phan trăm tồn thương lá, sự nảy mam của bảo tử

Alternaria sp., cảm ứng hydrogen peroxide và kích thích hoạt động của enzyme (peroxidase và polyphenoloxidase) trong cây Cà chua [38].

Svetlana và cs (2018) đã nghiên cứu chitosan và các dẫn xuất của nó kháng

lại nam mốc Alternaria và Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vitro,

kết quả cho thay dung dich chitosan 3 mg/ml trong nước đã ức chế hoàn toản sự nảy

mam của bào tử A Aliernata và C gloeosporioides [39].

Dalvi và cs (2015) đã đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng chitosan và

oligochitosan đối kháng Alternaria solani điều kiện in vitro, cho thay khi nồng độ

của chitosan thông thường va chitosan được chiều xạ (oligochitosan) tăng lên thì hoạt

tính kháng nam được tăng cường va sự tích lũy sinh khối khô của nắm giảm [40]

Jiaqi Yan và cs (2011) nghiên cứu sự ảnh hưởng của oligochitosan đối với

bệnh thối nhữn sau thu hoạch do nắm Alternaria alternata gây ra trên quả Táo tàu.Kết quả nghiên cứu cho thấy oligochitosan có kha năng ức chế mạnh sự phát trién

của A alternata Anh hưởng của oligochitosan cũng làm giảm đáng kẻ sự thôi rita tự

nhiên sau thu hoạch thúc đây độ cứng của quả, trì hoãn sự suy giảm chat rắn hòa tan

va mat ascorbic acid, tăng tông số hợp chat phenolic trong quá trình bảo quản ở 0°C

[41].

Meng và cs (2010) đã nghiên cứu chitosan (350 kDa) và oligochitosan (6 kDa)

ức chế sự phát triển của Alternaria kikuchiana Tanaka va Physalospora piricolaNose Két qua thi nghiém cho thay ca chitosan va oligochitosan déu tre ché manh su

nay mam của bao tử và sự phát triển của sợi nam Tuy nhiên, chitosan và oligochitosan

có tác dụng ức chế sự phát trién của sợi nam rõ rang hơn so với sự nảy mam của bảo

từ [42].

Qua tông quan tài liệu cho thay, oligochitosan có tác dụng tốt đôi với câytrồng Oligochitosan vừa có tác dụng trực tiếp phòng trị vi sinh vật gây hại cây trồng,vừa là một trong những elicitor có khả năng kích thích hệ thống phòng vệ của câytrồng giúp nâng cao kha năng miễn dich của cây với các yếu tô stress sinh học và phi

sinh học Nhưng nhìn chung, các công trình nghiên cứu về ứng dụng oligochitosan

dé phòng trị Alternaria spp gây bệnh dém nâu trên cây Chanh dây vẫn con rat hạn

chê.

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN, DIA DIEM VÀ TƯ LIEU NGHIÊN CUU

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiền hành thực hiện từ tháng 10/2021 đến tháng 5/2022 Bao gồm

thời gian thu thập mẫu bệnh, phần lập nắm Alternaria §p., chế tạo oligochitosan và

thực hiện khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên chủng nam Alternaria sp phân

lập được.

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Lá quả bệnh bị bệnh đốm nâu của Chanh dây được thu thập trong các vườn

Chanh day tại xã Da K nàng, huyện Dam Rong, tính Lam Dong.

Phân lập nam bệnh, nuôi cay, mô tả va đánh giá kha năng ức chế của

oligochitosan với nắm Alternaria spp được thực hiện tại Phòng thí nghiệm thuộc Chi

nhánh Viện Ứng dụng Công nghệ tại Thành phó Hỗ Chí Minh.

Chủng nắm Alternaria sp phân lập được định danh bằng phương pháp sinh

học phân tử tại Công ty Nam Khoa Biotek.

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu

Thiết bị nghiên cứu: Kính hiện vi Olympus CX31 (Japan), nồi hap (Japan), kính soi

nôi (Japan), tủ sấy (Germany), dia petri và các dụng cụ khác.

Vật liệu nghiên cứu:

Mẫu bệnh đốm nâu ở Chanh dây: lá, qua bị bệnh của cây.

- Môi trường dinh đưỡng nhân tạo: PDA (potato dextrose agar), WA (water

agar).

- Nguyén liệu chitosan và oligochitosan phan cắt bằng Co-60 được cung cap bởi

Chi nhánh Viện Ung dụng Công nghệ tại Thanh phố Hỗ Chi Minh.

- Các dung dich: lactic acid 3%; H202 50%; NHsOH 2.5%; ethanol 70° và

ethanol 96°

2.2 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh

Trên một số cây Chanh day có biểu hiện điền hình của bệnh đồm nâu, các

mẫu lá và quả bị bệnh được thu thập Cuống lá và cuống quả được quan vào khăn

giấy âm đê giữ mẫu tuoi, bảo quản trong túi nilon Các triệu chứng bệnh, địa điểm,

thời gian và đánh dau kí hiệu cho các túi đựng mẫu được mô tả và ghi chú.

Các mau bệnh được vận chuyên vé phòng thí nghiệm, tránh tiếp xúc với nơi

có nhiệt độ cao; khăn giấy quan mẫu bị khô được thay bằng khăn giấy âm Các mẫu

bệnh được chụp ảnh, bảo quản trong các hộp nhựa có lót giấy thắm và đậy nắp cần

thận.

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh tại vườn

2.3.2 Phương pháp phân lập chủng nắm Alternaria sp.

Phân lập mẫu: mẫu bệnh Chanh đây đã thu thập được rửa dưới dòng nước

chảy liên tục trong Š phút Sau đó khử trùng 70° trong 30 giây và thám khô trên giấy

thâm đã khử trùng Khử trùng dao bang nhiệt và cắt mẫu bệnh tại phan tiếp giáp giữa

mô khỏe và mô bệnh thành các mi¢ng mong 5 mm x 5 mm Các miếng lá, quả bệnh

được cấy lên đĩa petri có môi trường PDA được bê sung Streptomycin đề ức chế sự

phát triển của vi khuân Sau khi cấy, úp ngược các đĩa petri nuôi cây đề tránh đọng

hơi nước trên bê mặt, mẫu được ủ trong tủ định ôn 28°C Cay truyền nam sang môi

trường đinh đưỡng PDA sau khi sợi nam đã phát triển cách mô bệnh 1 - 2 em

Làm thuần mẫu: Dùng que cấy đã khử trùng cạo nhẹ lấy một lượng nhỏ sợi

nắm có lẫn bào tử tại rìa khuẩn lạc và cho vào ống nghiệm chứa nước cất vô trùng (3ml/6ng) Lắc đều sau đó ding pipet chuyên | ml dich bảo tử vào một dia petri có chứa

môi trường (WA) Dựng dia petri trong 5 - 8 giờ đến khi bào tử nảy mam Đĩa petri

chứa các bảo tử đã nảy mam sau đó được soi dưới kính lip soi nôi, dùng que cay đã

khử trùng cắt lẫy một bào tử nay mam và chuyên sang đĩa petri chứa môi trường PDA.

Bao quản nguồn nắm trong tủ định ôn ở 28°C (Burgess và cộng sự, 2009) [43]

Dựa trên một số đặc điềm hình thái của nam Alternaria sp được mô tả, định

danh sơ bộ các chủng vi nắm phân lập được có khả năng là Alfernaria sp

Tiếp đó, mẫu nam được gửi đến Công ty Nam Khoa Biotek dé định danh bằng phương pháp sinh học phân tử Dựa trên các trình tự DNA thu được, việc tìm kiểm trên cơ sở dit liệu Genbank bằng phần mém trực tuyến BLAST tại NCBI (the

National Center for Biotechnology Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov//BLAST/) sé được thực hiện Các trình tự DNA được

so sánh và lập cây pha hệ bằng chức năng dựng cây pha hệ của NCBI Cuỗi cùng, so

sánh trình tự DNA thu được với các loài gần gũi để xác định tên loài của mẫu.

2.3.3 Phương pháp tạo oligochitosan được cắt mạch từ chitin

Phương pháp tạo oligochitosan bằng HạO; theo mô tả của Bùi Phước Phúc (2018) có điều chỉnh [44].

Pha chế dung dịch cắt: Cho 10 g chitin vào 200 ml dung dich cắt chứa 3%lactic acid và 1% H›O›; lắc đều mỗi 30 phút trong 9 giờ Trung hoà dung dịch cắt

bang NHsOH 5% cho đến khi độ pH đạt 6.5 - 7.5 Tua dung dịch bằng ethanol 96° theo tỉ lệ dung dich cắt : ethanol = 1 : 5 (v/v) Lọc và rửa kết tủa 3 lần bằng ehtanol với cùng nòng độ trên Mẫu được say khô trong tủ say ở 50°C, đảo trộn thường xuyên đến khi độ âm đạt < 10%.

Hình 2.2 Chitin được sử dụng cho quá trình cắt mạch

2.3.4 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế của oligochitosan được cắt

bằng hai phương pháp H202 và Co-60 với Alternaria macrospora

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của các tác giả (Harpreet và

Leena, 2010; Simi và es., 2015) có điều chỉnh.

Loài nam Alternaria macrospora gây bệnh dém nâu trên Chanh dây được

phân lập và định danh từ kết quả thực hiện mục 2.3.2.

Môi trường PDA có bỗ sung dung dịch oligochitosan, gồm:

1 Oligochitosan được cắt bằng H2O› (thu được từ kết quả thực hiện mục 2.3.3);

2 Oligochitosan được cắt bằng Co-60 (cung cấp bởi Chi nhánh Viện Ứng dụng

Công nghệ tại Thành pho Hồ Chí Minh)

Hai loại oligochitosan được pha loãng đến 10% trong nước cất vô trùng có

bô sung acetic acid dé được pH 5,5 Sau đó, oligochitosan được thêm vào môi trường

PDA, ở 45°C và có bỗ sung acetic acid (pH = 5,5) dé nuôi cấy Aternaria macrospora

theo các tỉ lệ lần lượt là 0%, 0,2%, 0.4%, 0,6%, 0.8% và 1%

Các giống nam Alternaria macrospora thu từ khuẩn lạc 7 ngày tuôi được chiathành các khoanh có đường kính 7 mm va cấy vao trung tâm đĩa thạch PDA (đã bé

sung oligochitosan), nắm được nuôi trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng

Các nghiệm thức (NT) được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.1 Các nghiệm thức khảo sát khả năng ức chế nắm Alternaria của

oligochitosan cắt bằng phương pháp Co-60 và H;O;

Nghiệm thức Nong độ oligochitosan trong môi trường PDA

0%

0.2% oligochitosan cat bằng Co-60

0.4% oligochitosan cat bằng Co-60

0.6% oligochitosan cat bang Co-60

NTI0 0,8% oligochitosan cat băng HạO;

NTII 1% oligochitosan cat băng H202

Tuy nhiên, trong qua trình thực hiện các nghiệm thức, tôi nhận thay các

nghiệm thức sử dụng oligochitosan với nông độ 0,44 gần như ức chế hoàn toàn sự phát triển của Alternaria macrospora Trong khi đó nghiệm thức sử dụng oligochitosan cat bằng 2 phương pháp Co-60 và HaO› cũng đem lại hiệu quả ức chế

cao (72,260% đôi với oligochitosan cắt bằng phương pháp Co-60 và 91,436% đối vớioligochitosan cat bang phương pháp H202) Sử dụng oligochitosan ở liều quá cao sẽ

gây ra sự lãng phí chế phẩm Do đó tôi quyết định khảo sát khá năng ức chế của

oligochitosan được cắt bang 2 phương pháp Co-60 và H:O: ở day nông độ thấp hơn,

cụ the là 0%; 0,05%; 0,1%; 0,15% và 0,2% Các nghiệm thức bô sung được trình bày

Bảng 2.2 Các nghiệm thức bỗ sung

0,05% oligochitosan cất băng Co-60

0.1% oligochitosan cat băng Co-60

0,15% oligochitosan cat băng Co-60

0,05% oligochitosan cắt băng H20>

0,1% oligochitosan cat băng HO;

0,15% oligochitosan cat băng HạO;

Mỗi nghiệm thức được tiền hành trên 9 đĩa petri nuôi cây nắm Alternaria

macrospora, bỗ trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely randomized design —

CRD).

Đường kính khuan lac Alternaria macrospora trong 11 nghiệm thức nêu trên

sẽ được theo đối va đo vào ngày 3, 5 và 7 Hoạt lực ức chế (H) của 2 loại oligochitosan

ở các nghiệm thức sẽ được xác định dựa trên cơ sở mức độ phát triển so với đối chứng

(0%) như sau [45], [46], [47]:

Trong đó,

H: Hiệu quả/hoạt lực ức chế nắm bệnh trên đĩa Petri (%);

Di: Đường kính khuẩn lạc nắm bệnh trong nghiệm thức đối chứng (mm):

D2: Đường kính khuẩn lac nam bệnh trong các nghiệm thức bỗ sung

oligochitosan (mm).

2.3.5 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu ghi nhận được xử lí theo các thuật toán xác suất thông kê bằng

phần mém Statgraphic 18.

Các số liệu trung bình được trình bày ở dạng ÿ + SD Mức ý nghĩa thông kê

được sử dụng dé kiêm định sai khác giữa các nghiệm thức là 0,05 (P < 0,05).

Chương 3 KET QUÁ VA BAN LUẬN3.1 Kết qua phân lập chủng nam bệnh Alternaria sp từ mẫu bệnh Chanh

dây

3.1.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh

Mẫu bệnh được lựa chọn thê hiện các triệu chứng của bệnh đốm nâu do

Alternaria sp gay ra trên cây Chanh dây như;

+ Trên lá: có những vết bệnh dạng đốm, hình tròn hoặc gan tròn, màu nâu do, viên nâu sam hoặc nga vàng, đường kính khoảng 10 mm.

+ Trên quả: bệnh biêu hiện triệu chúng là các đốm tròn màu nâu đỏ, tuy theo mức độ bệnh có thé lõm từ cạn đến sâu Kích thước lớn hơn trên lá, nhiều vết bệnh

nam gan nhau có thê liên kết lại thành các vết bệnh lớn hơn Quả bị bệnh ở mức độ

nặng có thé teo tóp, rụng sớm.

Hình 3.1 Triệu chứng bệnh đóm nâu trên các mẫu lá và quả Chanh đây thu được

Các triệu chứng nêu trên phù hợp với mô tả của Phan Thị Thu Hiền khi mô

ta các triệu chứng bệnh do Alfernaria sp gây ra trên cây Chanh day [1] Do đó, các

mẫu bệnh nay đã được lựa chon đề tiền hành phân lập chủng nắm Alternaria spp

trong phong thi nghiém.