2.3.1. Phương pháp thu thập mẫu bệnh
Trên một số cây Chanh day có biểu hiện điền hình của bệnh đồm nâu, các mẫu lá và quả bị bệnh được thu thập. Cuống lá và cuống quả được quan vào khăn
giấy âm đê giữ mẫu tuoi, bảo quản trong túi nilon. Các triệu chứng bệnh, địa điểm, thời gian và đánh dau kí hiệu cho các túi đựng mẫu được mô tả và ghi chú.
Các mau bệnh được vận chuyên vé phòng thí nghiệm, tránh tiếp xúc với nơi có nhiệt độ cao; khăn giấy quan mẫu bị khô được thay bằng khăn giấy âm. Các mẫu bệnh được chụp ảnh, bảo quản trong các hộp nhựa có lót giấy thắm và đậy nắp cần
thận.
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh tại vườn
2.3.2. Phương pháp phân lập chủng nắm Alternaria sp.
Phân lập mẫu: mẫu bệnh Chanh đây đã thu thập được rửa dưới dòng nước
chảy liên tục trong Š phút. Sau đó khử trùng 70° trong 30 giây và thám khô trên giấy
thâm đã khử trùng. Khử trùng dao bang nhiệt và cắt mẫu bệnh tại phan tiếp giáp giữa
mô khỏe và mô bệnh thành các mi¢ng mong 5 mm x 5 mm. Các miếng lá, quả bệnh
14
được cấy lên đĩa petri có môi trường PDA được bê sung Streptomycin đề ức chế sự phát triển của vi khuân. Sau khi cấy, úp ngược các đĩa petri nuôi cây đề tránh đọng hơi nước trên bê mặt, mẫu được ủ trong tủ định ôn 28°C. Cay truyền nam sang môi trường đinh đưỡng PDA sau khi sợi nam đã phát triển cách mô bệnh 1 - 2 em.
Làm thuần mẫu: Dùng que cấy đã khử trùng cạo nhẹ lấy một lượng nhỏ sợi nắm có lẫn bào tử tại rìa khuẩn lạc và cho vào ống nghiệm chứa nước cất vô trùng (3 ml/6ng). Lắc đều sau đó ding pipet chuyên | ml dich bảo tử vào một dia petri có chứa
môi trường (WA). Dựng dia petri trong 5 - 8 giờ đến khi bào tử nảy mam. Đĩa petri
chứa các bảo tử đã nảy mam sau đó được soi dưới kính lip soi nôi, dùng que cay đã
khử trùng cắt lẫy một bào tử nay mam và chuyên sang đĩa petri chứa môi trường PDA.
Bao quản nguồn nắm trong tủ định ôn ở 28°C (Burgess và cộng sự, 2009) [43].
Dựa trên một số đặc điềm hình thái của nam Alternaria sp. được mô tả, định danh sơ bộ các chủng vi nắm phân lập được có khả năng là Alfernaria sp..
Tiếp đó, mẫu nam được gửi đến Công ty Nam Khoa Biotek dé định danh bằng phương pháp sinh học phân tử. Dựa trên các trình tự DNA thu được, việc tìm kiểm trên cơ sở dit liệu Genbank bằng phần mém trực tuyến BLAST tại NCBI (the
National Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov//BLAST/) sé được thực hiện. Các trình tự DNA được
so sánh và lập cây pha hệ bằng chức năng dựng cây pha hệ của NCBI. Cuỗi cùng, so sánh trình tự DNA thu được với các loài gần gũi để xác định tên loài của mẫu.
2.3.3. Phương pháp tạo oligochitosan được cắt mạch từ chitin
Phương pháp tạo oligochitosan bằng HạO; theo mô tả của Bùi Phước Phúc (2018) có điều chỉnh [44].
Pha chế dung dịch cắt: Cho 10 g chitin vào 200 ml dung dich cắt chứa 3%
lactic acid và 1% H›O›; lắc đều mỗi 30 phút trong 9 giờ. Trung hoà dung dịch cắt bang NHsOH 5% cho đến khi độ pH đạt 6.5 - 7.5. Tua dung dịch bằng ethanol 96°
theo tỉ lệ dung dich cắt : ethanol = 1 : 5 (v/v). Lọc và rửa kết tủa 3 lần bằng ehtanol với cùng nòng độ trên. Mẫu được say khô trong tủ say ở 50°C, đảo trộn thường xuyên đến khi độ âm đạt < 10%.
Hình 2.2. Chitin được sử dụng cho quá trình cắt mạch
2.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế của oligochitosan được cắt bằng hai phương pháp H202 và Co-60 với Alternaria macrospora
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của các tác giả (Harpreet và
Leena, 2010; Simi và es., 2015) có điều chỉnh.
Loài nam Alternaria macrospora gây bệnh dém nâu trên Chanh dây được phân lập và định danh từ kết quả thực hiện mục 2.3.2.
Môi trường PDA có bỗ sung dung dịch oligochitosan, gồm:
1. Oligochitosan được cắt bằng H2O› (thu được từ kết quả thực hiện mục 2.3.3);
2. Oligochitosan được cắt bằng Co-60 (cung cấp bởi Chi nhánh Viện Ứng dụng Công nghệ tại Thành pho Hồ Chí Minh).
Hai loại oligochitosan được pha loãng đến 10% trong nước cất vô trùng có bô sung acetic acid dé được pH 5,5. Sau đó, oligochitosan được thêm vào môi trường PDA, ở 45°C và có bỗ sung acetic acid (pH = 5,5) dé nuôi cấy Aternaria macrospora theo các tỉ lệ lần lượt là 0%, 0,2%, 0.4%, 0,6%, 0.8% và 1%.
Các giống nam Alternaria macrospora thu từ khuẩn lạc 7 ngày tuôi được chia thành các khoanh có đường kính 7 mm va cấy vao trung tâm đĩa thạch PDA (đã bé sung oligochitosan), nắm được nuôi trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng.
Các nghiệm thức (NT) được trình bày trong bảng sau:
16
Bảng 2.1. Các nghiệm thức khảo sát khả năng ức chế nắm Alternaria của oligochitosan cắt bằng phương pháp Co-60 và H;O;
Nghiệm thức Nong độ oligochitosan trong môi trường PDA
0%
0.2% oligochitosan cat bằng Co-60
0.4% oligochitosan cat bằng Co-60
0.6% oligochitosan cat bang Co-60 0.8% oligochitosan cất bằng Co-60
NT6 1% oligochitosan cat băng Co-60 NT? 0,2% oligochitosan cat băng H:O:
NT8 0,4% oligochitosan cat băng H2O02 NT9 0,6% oligochitosan cat băng H:O:
NTI0 0,8% oligochitosan cat băng HạO;
NTII 1% oligochitosan cat băng H202
Tuy nhiên, trong qua trình thực hiện các nghiệm thức, tôi nhận thay các nghiệm thức sử dụng oligochitosan với nông độ 0,44 gần như ức chế hoàn toàn sự phát triển của Alternaria macrospora. Trong khi đó nghiệm thức sử dụng oligochitosan cat bằng 2 phương pháp Co-60 và HaO› cũng đem lại hiệu quả ức chế cao (72,260% đôi với oligochitosan cắt bằng phương pháp Co-60 và 91,436% đối với oligochitosan cat bang phương pháp H202). Sử dụng oligochitosan ở liều quá cao sẽ gây ra sự lãng phí chế phẩm. Do đó tôi quyết định khảo sát khá năng ức chế của oligochitosan được cắt bang 2 phương pháp Co-60 và H:O: ở day nông độ thấp hơn,
cụ the là 0%; 0,05%; 0,1%; 0,15% và 0,2%. Các nghiệm thức bô sung được trình bày
Bảng 2.2. Các nghiệm thức bỗ sung
0,05% oligochitosan cất băng Co-60
17
0.1% oligochitosan cat băng Co-60 0,15% oligochitosan cat băng Co-60
0,05% oligochitosan cắt băng H20>
0,1% oligochitosan cat băng HO;
0,15% oligochitosan cat băng HạO;
Mỗi nghiệm thức được tiền hành trên 9 đĩa petri nuôi cây nắm Alternaria
macrospora, bỗ trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely randomized design —
CRD).
Đường kính khuan lac Alternaria macrospora trong 11 nghiệm thức nêu trên sẽ được theo đối va đo vào ngày 3, 5 và 7. Hoạt lực ức chế (H) của 2 loại oligochitosan ở các nghiệm thức sẽ được xác định dựa trên cơ sở mức độ phát triển so với đối chứng
(0%) như sau [45], [46], [47]:
Trong đó,
H: Hiệu quả/hoạt lực ức chế nắm bệnh trên đĩa Petri (%);
Di: Đường kính khuẩn lạc nắm bệnh trong nghiệm thức đối chứng (mm):
D2: Đường kính khuẩn lac nam bệnh trong các nghiệm thức bỗ sung
oligochitosan (mm).
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu ghi nhận được xử lí theo các thuật toán xác suất thông kê bằng phần mém Statgraphic 18.
Các số liệu trung bình được trình bày ở dạng ÿ + SD. Mức ý nghĩa thông kê được sử dụng dé kiêm định sai khác giữa các nghiệm thức là 0,05 (P < 0,05).
18
Chương 3. KET QUÁ VA BAN LUẬN
3.1. Kết qua phân lập chủng nam bệnh Alternaria sp. từ mẫu bệnh Chanh
dây
3.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh
Mẫu bệnh được lựa chọn thê hiện các triệu chứng của bệnh đốm nâu do
Alternaria sp. gay ra trên cây Chanh dây như;
+ Trên lá: có những vết bệnh dạng đốm, hình tròn hoặc gan tròn, màu nâu do, viên nâu sam hoặc nga vàng, đường kính khoảng 10 mm.
+ Trên quả: bệnh biêu hiện triệu chúng là các đốm tròn màu nâu đỏ, tuy theo mức độ bệnh có thé lõm từ cạn đến sâu. Kích thước lớn hơn trên lá, nhiều vết bệnh nam gan nhau có thê liên kết lại thành các vết bệnh lớn hơn. Quả bị bệnh ở mức độ nặng có thé teo tóp, rụng sớm.
Hình 3.1. Triệu chứng bệnh đóm nâu trên các mẫu lá và quả Chanh đây thu được Các triệu chứng nêu trên phù hợp với mô tả của Phan Thị Thu Hiền khi mô
ta các triệu chứng bệnh do Alfernaria sp. gây ra trên cây Chanh day [1]. Do đó, các
mẫu bệnh nay đã được lựa chon đề tiền hành phân lập chủng nắm Alternaria spp.
trong phong thi nghiém.
19
3.2. Kết qua phân lập mẫu bệnh và định danh chủng nam
Các chủng vi sinh vật từ những mẫu lá và quả Chanh đây bệnh được tiễn hành phân lập. Dựa vào đặc điểm hình thái của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, mép khuân lạc, cách mọc trên môi trường nuôi cay, các kiêu khuan lac được lựa chọn có biểu hiện giống với Alternaria sp. để quan sát cau tạo vi thé đưới kính hiện vi.
Qua quá trình phân lập trên môi trường PDA, chủng vi sinh vật có khuẩn lạc mọc chậm, khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường PDA sau 7 ngày đạt đường kính 45
mm; màu đen, mép đêu. màu xám; mặt trên phát triển nhô cao lên trên bẻ mặt đĩa
thạch, dạng sợi như bông gòn; mặt dưới khuẩn lạc màu đen xám, hệ sợi không có giọt
tiết, không tiết sắc tố, không ăn sâu xuống môi trường nghỉ là Alternaria sp. (mẫu
LVI) đã được thu nhận (Hình 3.1.).
Mẫu vi sinh vật LV1 được tiến hành quan sát cấu tạo vi thể dưới kính hiển vi
(Hinh 3.2.)
Hình 3.2. Hình thái khuân lạc của mẫu Hình 3.3. Đặc điểm vi thể của mẫu
LVI sau 7 ngày nuôi cây LVI
Đặc điểm vi thé của mẫu vi sinh vật LV1: sợi nam phan nhánh hoặc không
phân nhánh, có vách ngăn day không mau, chiều rộng sợi nam khoảng 13 ym, một sợi nắm riêng lẻ có thé có đến 24 tế bào, mỗi tế bào dài 40 - 50 pm. Túi bào tử có dang hình chuỳ, đài khoảng 50 - 70 um và rộng khoảng 30 pm. Các đặc điểm vi thé
nay tương đôi giông với mô tả của Phan Thị Thu Hiện về 2 loài Alernaria tenuissima
20
(Nees & T. Nees: Fr.) Wiltshire, Trans. Brit. và Alfernaria passiflorae TH.
Simmonds, Proc. [1].
Hình 3.4. Sự phát triển của khuẩn lạc nắm LV1 qua các ngày 1, 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA
3.3. Kết quả định danh phân tử mẫu nắm LVI
Mẫu LV1 nuôi cay được gửi đến Công ty Nam Khoa Biotek dé định danh bằng phương pháp sinh học phần tử, kết quả thu được sau khi giải trình tự gene như
Sau:
TGAGGCCTTCGGACTGGCTCGAGGAGGTTGGCAACGACCACCTCAAGCCGGAAAG
TTGGTCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACC TGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTT
GCTGAATTATTCCACCCGTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGCTCGCCCACC ACAAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGTCAGTAACAATGTAATAAT TACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA
21
TAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCT TTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTG TTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCAGCCGG CCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCTAGCATCC AACAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGC ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCG
GCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGG
Trinh tự gen của chủng LV1 được so sánh với trình tự gene của các loài khác
trên Ngân hàng gen NCBI (Hình 3.6.). Kết quả trình bay trong Hình 3.6. cho thấy, trình tự gene của chủng LV1 có sự tương đồng với nhiêu loài khác nhau ở các mức độ khác nhau. Trong số đó, mức độ tương đồng trình tự gene cao nhất với loài
Alternaria macrespora.
DD an... -¢o 4 ae
2 . ~ ~ ` ae - .. -
~e Quy X6”
Contact | Copyright | O2 | fXivacg | ko GSád2 22
Hình 3.6. Kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự vùng ITS của chủng LVI và các kết quả blast trên NCBI
Tiếp theo, chức năng của NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) được sử dụng đẻ tiễn hành xây dựng cây phát sinh chủng loại nhằm xác định mối quan hệ họ hàng gần của chủng nam L.VI và các loài có trình tự gene tương đồng. Kết quả (Hình 3.7.) cho thay chủng LVI có quan hệ họ hàng gần nhất với loài Alternaria macrospora
và Alternaria zinniae.
@ Alternana aÌternata
| Altemaria macrospora
Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại của chủng LV1 và các kết qua blast
trên NCBI
Do đó, trình tự nucleotide của 3 loài vi nắm nêu trên được tiếp tục so sánh chỉ tiết. Kết quả được trình bày ở Hình 3.8. và Hình 3.9. Kết quá cho thấy trình tự
gene của chủng LV1 với loài Alrernaria macrospora khác nhau 2 nucleotide, trình tự gene của chúng LVI với loài Alternaria zinniae khác nhau 3 nucleotide.
Khi so sánh các đặc điểm đại thé khuan lạc và đặc diém vi thé, chủng LV1 có nhiều điểm tương đồng với loài Alternaria macrospora được ghi nhận trong nghiên cứu của Kaur va Aggarwal như khuan lạc mau đen, mép đều, mau hơi xám,
túi bao tử có dạng hình chu}, màu vàng nâu. [48] Mặt khác. các nghiên cứu mô tả
đặc điểm khuân lạc và đặc điểm vi thé của loài Alternaria zinniae vẫn còn rất ít, chưa day đủ và thiếu minh chứng, do đó chúng tôi không thé tiến hành so sánh với
chủng LVI,
Vì vậy. trong nghiên cứu này chủng nắm LV1 tạm thời được xem như thuộc
loài Alternaria macrospora.
Score
1437 bits(778)
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Sbjct
Query Sbjct
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Query Sbjct Query Sbjct
Query
z
247 61
307 121 367 181 427 241 487 301 547 361 607
421
667 481
727
541
787
601
847
661 987 721 967
781
23
Expect Identities Gaps Strand
0.0 782/784(99%) 0/784(0%) Plus/Plus
Imuitlimilrdfinmmnllrmrimnilimnnrmillll
TUNHHDU LH DI LEU li
CGGACTGGCTC CTCAAGCCGGAAAGTTGGT
CASACTCGGTCATTTAGAGGAAGTASAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCG
0110000111110
CARACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCG GAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCT
JIIIIIIIITIIIIIHIITIIIIIIIITIIIIIIIEIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH
GAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCT GAATTATTCCACCCGTGTCTTT TGCGTACTTCTTGTTTCCT TGGTGGGCTCGCCCACCAC
QHÀH4QHAI6tCHHAd01ÁCHCntHdhálelllull
AAGGACCAACCCATASACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGT CAGTAACAATGTAATAATT
JIIITIIIITIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIITIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
AAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGTCAGTAACAATGTAATAATT ACAÁCTTTCAACÀÁCGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA
JEHTHIIIHTIHIIIITIIIIIIIIIIIIITIIIIIIIIIIIDITITIIIITIITIIII
ACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA TAAGTAGTGTGAATTGCAGAAT TCAGTGAATCATCGAATCTT TGAACGCACATTGCGCCC
JIHIIIIIIIIIIIIITETTITITIIITIHIIIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIII|
TAAGTAGTGTGAATTGCAGAAT TCAGTGAATCATCGAATCTT TGAACGCACATTGCGCCC TTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGG
HH¿HHHlMGINHHGHGlALGLHHAACLLAICHHACHSA
TGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCAGC
TEU TIIIIIITIIITIIIITITIIIIIHIIIIIIITTIIII
TGTTGGGCGTCT TTT TGTCCCCCCCCT TGCGGGGAGAC TCGCCT TAAAGTCATTGGCAGC
CGGCCTACTGGT TT CGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCT TCCAGCCCCAAGGTCTAGC
[IIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIIIIIIEIITIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
CGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCTAGC ATCCAACAAGCC EEE EEE ECAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT
[TITHIHIITIIIIIIIEHEIIIIIIIIIIIIIIITIEITIIIIIIITIIIIIEIIIII
ATCCAACAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGAT CAGGTAGGGATACCCGCTGAACT
TAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGT
LH NUHNHHHIIH
TAAGCATATCAATAAGC CAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGT
GAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGSAGTCCGAGTTGTAATTTGCA
JIIIIIIIIIIIIIIITHIIIIIIIIIIIIIIIIII 1111111111111111111111
GAÁGCGGCAÁCAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTTAGAGTCCGÁGTTGTAATTTGCA GAGG 784
[II]
Sbjct 1027 GAGG 1030
6ô
129
§ Bể2
ee
b>22
Š §
726
786
846 6698
906
728
966 780 1926
Hình 3.8. Kết quả so sánh vùng trình tự ITS của chủng LVI và Alernaria
macrospora
24
Score Expect Identities Gaps Strand
1243 bits(673) 0.0 680/683(99%) 2/683(0%) Plus/Plus
Query 1 TGAGGCCTTCGGACTGGCTCGAGGAGGTTGGCAACGACCACCTCAAGCCGGAAAGTTGGT 60
[HIIIITTHTIIIITIIITTITIHTIIIIITIIIIIHTIIIIEITIIITTTTILIIII
Sbjct 6@ TGAGGCCTTCGGACTGGCTCGAGGAGGTTGGCAACGACCACCTCAAGCCGGAAAGTTGGT 119
Query 61 CAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCG 129
JIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITIIIITIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
Sbjct 120 CÁAÁCTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCG 179 Query 121 GAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCT 182
; [IIIHIIHHTIITITIITIITIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIII
Sbjct 180 GAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCT 239
Query 181 rififlfãrhufilllUA0nunihiitilliltrtrnlinrrmmi 248
Sbjct 240 GAATATICCACECGIGICHTIGUTACITCTTOH TECH GOTeGRCTEGECACCAL 299
Query 241 AAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGTCAGTAACAATGTAATAATT 300
[ITHTHIHIHIHIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITIIIIIIIIIIIIITIIIIIIIII
Sbjct 300 AAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGTCAGTAACAATGTAATAATT 359
Query 301 ACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA 360
JIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHEHIII
Sbjct 360 ACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA 419 Query 361 TAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCC 420
; [TIHIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIILIHIHIIII
Sbjct 420 TAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCC 479 Query 421 TTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGG 489
sujet aso THẢG!.HCUÀÁle&káCATêC(1UHCGÀ6LGLC4H1ETLCCTCAACLTHCCHAC $39
Query 481 TGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCG--CTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCA 538
THIHHIIIIIIIIIIIIIIIIE 111111111111111111111111111111111
Sbjct 548 TGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCCCCCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCA 599 Query 539 GCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCTA 598
THIHTHTTHTTTTIIIITIITITTIHTTITITIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIIIIII
Sbjct 608 GCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCTA 659 Query 599 GCATCCAACAAGCCtttttttCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAA 658
JTITIHTITIHIIIIIIIIIIEEIIIIIIIIIIITIIITIITIIEIIIIIIIIHIIIIIH
Sbjct 668 GCATCCAACAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAA 719 Query 659 CTTAAGCATATCAATAAGCGGAG 681
LUTTE
Sbjct 720 CTTAAGCATATCAATAAGCGGAG 742
Hình 3.9. Kết quả so sánh vùng trình tự ITS của chủng LV1 và Alernaria
zinniae
3.4. Kết quả chế tạo oligochitosan cắt mach tir chitin bằng phương pháp
H202
Với mục tiêu chế tao sản phẩm chitin cat có khối lượng phân tử thấp làm chat ức chế sự phát trién của nam Alternaria macrospora, việc cit mạch đã làm giảm độ nhớt của chitin và gia tăng nồng độ oligochitosan trong dung dịch cắt. Theo nghiên cứu của Qin va cs, H2O> là tác nhân cắt mach chitosan hiệu quả vả ít làm thay đỏi cấu
25
trúc của sản phẩm nếu tiễn hành ở nông độ thấp [49]. Trong nghiên cứu này, để hạn chế sự biến đôi cau trúc của oligochitosan, nông độ H:O: được lựa chọn là 2%. Sau 9 giờ theo đối, ghi nhận được sự suy giảm độ nhớt của dung dịch, đồng thời dung địch sau khi cắt quan sát được trong suốt hơn.
Hình 3.10. Dung dich chitin ban đâu — Hình 3.11. Dung dich chitin sau 9 giờ
cat băng HạO;
Sản phẩm kết tủa thu được sau đó là oligochitosan khối lượng phân tử thấp, có dạng bột mịn, màu vàng. Sự khác biệt về màu sắc của chitosan trước và sau khi
cắt mạch cho thấy chitosan có khối lượng phân tử càng thấp thì màu sắc càng đậm, từ trắng chuyên sang vàng hay vàng nâu. Sự thay đổi màu sắc đặc trưng cho sự tạo
thành vòng glucopyranose chưa bão hoà (chứa nhóm carbonyl hay nhóm carboxyl!)
khi các gốc tự đo tái kết hợp với nhau. Ngoài ra, sự thay đôi mau sắc của chitosan cắt mach còn do sự hình thành của liên kết đôi N=C từ phan ứng Maillard giữa nhóm — CHO (nhóm cuối của 2, 5 — anhydro — D — mannose) và nhóm —NH; của chitosan
[50]
26
Chitin sau khi cắt (oligochitosan) được sấy ở 50°C cho đến khi độ am đạt 10% (Hình 3.13). Tiếp đó, mẫu oligochitosan sau say được hoà tan lại vào dung môi là nước cất (có bỏ sung acetic acid dé dat pH = 5,5) tao thanh hén hợp dung dịch có nông độ oligochitosan đạt 10%, màu nâu đậm, dạng sánh đặc (Hình 3.14.).
Hình 3.14. Dung dich oligochitosan 10% (cắt bằng phương pháp H202) 3.5. Kết quả khảo sát khả năng ức chế của oligochitosan được cắt bằng 2 phương pháp H;O; và Co-60 với Alternaria macrospora trong điều kiện in
vitro
Kết qua khảo sát kha năng ức chế của oligochitosan được cắt bằng 2 phương pháp H›O› và Co-60 lên đối tượng Alternaria macrospora trong điều kiện in vitro với
nông độ 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1% được trình bay trong Bang 3.1,
Bang 3.1. Hiệu qua ức chế nắm bệnh (%) của oligochitosan cắt bằng 2 phương
pháp H:O; và Co-60 lên Alternaria macrospora sau 7 ngày nuôi cấy
Hiệu quả ức chế nắm bệnh sau
Nghiệm thức
7 ngày nuôi cấy (%)
NTI: 0% oligochitosan 0
NT2: 0,2% oligochitosan cit bing Co-60 74,745 + 1,886"
28
NT6: 1% oligochitosan cat bằng Co-16 97.340 + 0,151°
NT9: 0.6% oligochitosan cat bang H›O› 97,516 + 0,183°
NTI0: 0,8% oligochitosan cắt băng HạO; 97,505 + 0,159°
NTII: 1% oligochitosan cắt bằng H202 97,575 + 0,311°
Ghi chú: a < b < € citing một cột khác biệt có ¥ nghĩa với độ tin cay 95%
NT2: 0.2% NT3: 0,4%
NTI: 0% oligochitosan — oligochitosan cit bing oligochitosan cắt băng
Co-60 Co-60
NT4: 0,6% oligochitosan jis bin NT6; 1% oligochitosan
cat bing Co-60 ° ` š cat băng Co-60
Co-60
NT7: 0,2% oligochitosan cất bang H2O2
NT10: 0.5% oligochitosan vụ geiiiorrncii ban
cat băng H:O› ° HạO› °
Hình 3.15. Anh hưởng của các mức nòng độ oligochitosan cắt bằng phương pháp
Co-60 và HạO; đối với sự phát triển của khuân lạc A. macrospora sau 7 ngày nuôi
cay.
Kết quả được trình bày trong Bang 3.1 và minh chứng qua Hình 3.15 cho thay đối với cả 2 loại oligochitosan cắt bằng phương pháp Co-60 hoặc H2O>, néu sử dụng nòng độ từ 0.4% trở lên đã gan như hoàn toàn ức chế sự phát triển của nam Alternaria macrospora trong điều kiện in vitro, khác biệt về hiệu quả ức chế giữa các nghiệm thức sử dụng oligochitosan với nông độ từ 0.4% trở lên (trong các NT3 -
NT11; ngoại trừ NT7: 0,2% oligochitosan cắt bằng Co-60) là không có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, nghiệm thức NT2 (0,2% oligochitosan cắt băng Co-60) có hiệu quả ức chế thấp hơn so với NT7 (0.2% oligochitosan cắt bằng H;O;) và với các nghiệm thức sử dung oligochitosan với nông độ từ 0,4% trở lên - sự sai khác có ý nghĩa thong kê. Cụ thé, nghiệm thức NT2 sử dụng oligochitosan cắt bằng phương pháp Co-60 có
hiệu quả ức chế 74,745 + 1,886% sự phát triển khuẩn lạc nam A. macrospora, thấp
hơn so với nghiệm thức NT7 sử dụng oligochitosan cắt bằng phương pháp H20>
(91,377 + 0.217%).
Mặc dù nghiệm thức NT7 cho thấy hiệu quả ức chế nắm bệnh thấp hơn có ý nghĩa thong kê so với các nghiệm thức sử dung oligochitosan với nông độ cao hơn 0.4%; tuy nhiên, nghiệm thức này vẫn đạt hiệu quả ức chế cao, lên đến 91,377 + 0,217%. Hơn nữa, việc sử dụng oligochitosan với liều lượng quá cao sẽ gây ra lãng
phi; vì vậy, tiếp theo sau thí nghiệm trước đó (với các nghiệm thức NTI - NTI1) khả năng ức chế của oligochitosan được cắt bằng 2 phương pháp Co-60 và HạO; đối với nam A. macrospora ở các day nồng độ thấp hơn đã được tiền hành khảo sát với các
mức nông độ 0.05%; 0,1%; 0.15% (NT12 - NT17).