Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa, BA, NAA đến khả năng nhân chồi và sinh trưởng của lan hồ điệp thơm (Phalaenopsis violacea) trong điều kiện in vitro

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa, BA, NAA đến khảnăng nhân chdi và sinh trưởng của lan hồ điệp thom Phalaenopsis violacea trong điềukiện in vitro” đã được tiễ

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3 2 2k ok 2k ok

KHOA LUAN TOT NGHIEP

ANH HUONG CUA CAC NONG DO NUOC DUA, BA, NAA DEN KHA NANG NHAN CHOI VA SINH TRUONG CUA LAN HO DIEP THOM (Phalaenopsis violacea)

TRONG DIEU KIỆN JN VITRO

SINH VIEN THUC HIEN : NGUYEN AN KHANGNGANH : NONG HOC

KHOA : 2019 — 2023

ANH HUONG CUA CÁC NONG ĐỘ NƯỚC DUA, BA, NAA DEN KHA NANG NHAN CHOI VA SINH TRUONG

CUA LAN HO DIEP THOM (Phalaenopsis violacea)

TRONG DIEU KIEN JN VITRO

Con xin cảm ơn và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cha mẹ, người đã có

công sinh thành, nuôi dưỡng, quan tâm và tạo mọi điều kiện cho con hoàn thành khóaluận này.

Cô Th.S Nguyễn Thị Thanh Duyên, bộ môn Di truyền - Chọn giống cây trồng,khoa Nông học, Đại học Nông Lâm đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em thực hiện đề

tài này.

Các bạn Minh Kha, Nhật Hào, Tú Trinh, Thúy Vy, Anh Hào, Minh Đức,

Quyền Cước, An Lạc, Tuấn Kiệt, Duyên Thùy đã giúp đỡ tôi trong quá trình thựchiện đề tài này

Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 7 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Nguyễn An Khang

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa, BA, NAA đến khảnăng nhân chdi và sinh trưởng của lan hồ điệp thom (Phalaenopsis violacea) trong điềukiện in vitro” đã được tiễn hành tại phòng Nuôi cấy mô thực vật của bộ môn Di truyền

— Chọn giống cây trồng, khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí

Minh từ tháng 02/2023 đến tháng 07/2023 Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với mục tiêu của nghiên cứu là xác định được môi trườngdinh dưỡng phù hợp cho cây lan hồ điệp thơm trong các giai đoạn nhân nhanh chỗi vàtạo rễ Các kết quả đạt được như sau:

1 Môi trường bô sung nước dừa thích hợp nhất cho kha năng nhân chồi là môi

trường MS có bổ sung 120 ml/L nước dừa, cho tỉ lệ mẫu tạo chồi ở 40 ngày sau cấy là71,4% và hệ số nhân chi là 11,6 lần, trọng lượng cụm chéi là 132,1 mg và chiều caochỗi đạt 4,9 mm

2 Môi trường MS bồ sung 0,5 mg/L BA kết hợp với 0,5 mg/L NAA cho tỉ lệ

mẫu tạo chồi ở 60 ngày sau cay là 92,0%, hệ số nhân chdi là 16,7 lần, trọng lượng cụm

chéi là 181,7 mg và chiều cao chồi đạt 7,6 mm

3 Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA tốt nhất cho khả năng hình thành

rễ, chiều dài rễ đạt 8,7 mm, 3,2 ré/cay, chiéu cao cây đạt 8,7 mm với 3,0 lã/cây va

trọng lượng đạt 207,4 mg.

MỤC LỤC

Trang

I):7 9/6800 4 Error! Bookmark not defined.

Cc Bé he fli ie i le De iii ii

TH HT TẾ Thu eneeenbeetkectiipkkgt60:03646-60360300810318680ig33000106ã046130:GGE005152:00L7G810)G22:000207EĐ iii

MUG CU reeepecuntecsrennicoremmeenioes HEIDIESESDEDISDEGDIHLALSESEIIERSSEEIS201090194/81911438902300x80084i302n8 sai 1V

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT 222¿2222++222E++tttEEkrrrrrkrrrrrrirrrrre vii

Í 1 ] PHO 0 sinsins cassie wae nsec dance ewiienee and varonpcrs on iae i ae end Geers ooo cdioerm eae

1.1.2 Nguồn gốc và phân b6 oo cccccccccceessesseessesseessessessuessesseessessessneeseestessesiessesseeseesees 4

1.1.3 Đặc điểm thực vật học - + 2-52 s+SE+E2E£EEEE12E212112117111711211121111 111221 xcye 5

1.1.4 Diéu kién sim na 9

1.1.5 Giống lan hồ điệp thom (Phalaenopsis Violaced) -+ 2z©5z©5sz5s++cssss2 10

1.1.6 Vị trí của lan hồ điệp trên thị trường 2- 2+ 2+2E2E+£E+£E+£E2E2E2E.2Ezxezxee 11

ee Sỉ tết Le 12

1.2.2 Lịch sử nuôi cay mô tế bào thực Vato ecccecceceeseeseseseesesesesseseseeseeseteseetsseeseeeees 13

1.2.3 Các phương pháp nhân giống in vi/ro Error! Bookmark not defined

1.2.4 Quy trình thực hiện nuôi cấy mô i7? vi/rO 22©2222¿52+22++2S22+z2xzz+zzsez 17

1.2.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vifro -. - 17

1.2.6 Ung dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bao thực vật trong nghiên cứu va sản xuat 191.2.7 Những trường hợp thường gặp trong nuôi cay mô tế bào thực vật - 201.2.8 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (DHSTTV) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

¬ 22

1.2.9 Thành phần khoáng trong môi trường nuôi cấy - 2 2¿22222+z2zz+zz+z+2 261.2.10 Dịch chiết hữu cơ trong nuôi cấy mô tế bao thực vật -2 2 552¿ %7

1.2.11 Phương pháp nhân giống in vitro lan hồ điệp -2©22©5255225z25z2522 28

LS Tinh hìrh:nghiEnietn:yẽ lan hồ WIG annggaonobiootbBGiuogSROAikgGTGG01G02130.00360g0ug08805 30

1.3.1 Các hướng nghiên cứu trên lan hồ điệp 2-22 2 2222+22z+2E+2zxzzx+zzzsrxz 301.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thé giới 2+ 2 2+2222EE2EE+2E+2EE2EE+2E+z2Ezzzrzrxez 31

1.3.3 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 2 22 2222221223 121221 1512511211221 2 xe 33

Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 362.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 22 2 52222222Ez2Ezzxerszrrerszrssrsresccrrc- 36

2.2 Vat li@u thi nghi6m 1 36

| gauggtgiegrroototioirrgii g0 5000 HANTEraidaorgrauaoerageuraaaauoanii

2.2.3 Điều kiện nuôi cây in VifO caro.2.2.4 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm - 2 2 ©2222222E22E22E22E2222222222xze 362.2.5 Trang thiết bị thí nghiệm 2 2 SSS£SỆSE£EEEEEEE1E712121212112112121 2121 xe 38

2.3 Phuong phap thi nghiém ee eee 39

2.3.3 Phuong phap 0 ï0i i30 10 392.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 2- 2 22+2+EE+2E2EE22E2EE22E22EE2212222221 22222 46Chương 5 KET QUÁ VÀ THẢO TUẦN sissiscsssssssecessersnersnivarnoenranimenssasasinarasaouensins 473.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nên và liêu lượng nước dừa đên quá trình nhân

chổi của lan hồ điệp thom trong điều kiện i vifro -. -2-©22©22222222222++2szzzzzzx2 47

3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nền và liều lượng nước dừa đến hình thành và pháttriển chồi của lan hồ điệp thơm trong điều kiện in vi/r0 -2 225525522-: 47

3.1.2 Anh hưởng của các môi trường nên và liêu lượng nước dừa đên sự hình thành và

phát triển lá của lan hồ điệp thơm trong điều kiện i vi/ro - : :c55:z-: 53

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của cây lan hồ điệpThơm trai tl oe Det er HHỮNHhusssassosooeseiassgosulggQioGt0GidSSG0)380001000G0/0003900010231000.030600EG30) 56

3.2.1 Anh hưởng của nồng độ BA va NAA đến hình thành va phát triển chéi của cây lan

hồ điệp thơm trong điều kiện iw vifr -2-©52 22 SS+ScSrteckcrerkrrrrerkrrkerrrrree 563.2.2 Ảnh hưởng của các nồng độ BA và NAA đến sự hình thành và phát triển lá củalan hồ điệp thơm trong điều kiện ¿7 vi/rO 2 2-©2222222222222EE22EE2EE2E+2Exczxrerrees 65

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự hình thành và phát triển rễ của lan hồ điệp

tiơm C160 NAG VŨ NG tin ca ra ggtgiAHELIBDIEEEDIEBGSSEIIGEENUSG.SĐSSNEBESLSETED.SBEERSEHISERGSiSi2S Dee 68

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự hình thành và phát triển rễ của lan hồ điệpthơm trong điều kiện iw VifrO 5-5 ©5+ S2 SE 2x2 k22322122122121212121121121 112121 Le 68

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự phat triển thân và lá của lan hồ điệp thơmtrong điều kiện i7 vi/rO -2-©2-©2¿S22222SE22E22E2232211212121121121212121211212121 21 Xe WZ

KET LUẬN YÃ ĐỂ BIG sscessccmamemnacmancnmonmennmmanamennenamnnial TT

ee T1

070:14210) cố acc acc ca cac cac cac eee 77

TÀI LIEU THAM KHẢO 5< 5< 5< 5s£©S<+S£SS£E+£E£EEeEEeEeerverkersersersrssrre 78

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT

Hoàn toàn ngẫu nhiênHoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tôĐiều hòa sinh trưởng thực vật

indole - 3 - butyric acid

Lần lặp lại

Least Significant Difference Murashige va Skoog

1 - Naphthalene acetic acid

Ngày sau cay

Nghiệm thức Phalaenopsis Protocorm like body Protocorm like bodies

Thi nghiém

Ultra violet

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) và MS/2 37

Bang 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm | 5+ <2 S2**£+2EE++kE£zvEereerrerrree 40

Bang 2.3 Các nghiệm thức thí nghiệm Z -.- -2622225216012202216211221212266616 2e 43

Bảng 2.4 Các nghiệm thức thí nghiệm 3 cee 2 SE E22 *22E+2E£2 SE 45

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường nền và liều lượng nước dừa đến tỉ lệ tao chỗi (%)của lan hồ điệp thơm trong điều kiện in vitro tại thời điểm 20 - 40 NSC 48Bang 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nên và liều lượng nước dừa đến số chồi (chdi) câylan hồ điệp thơm trong điều kiện ¿7 wi/r0 - 2-2 52+22+2E22E+EE22E2ZE2ZE2EzE.zEzrze, 49

Bang 3.3 Anh hưởng cua môi trường nên va liêu lượng nước dừa đền chiêu cao choi

(mm) của lan hồ điệp thơm trong điều kiện i¡ vi/r0 2+©2¿55252222+2z22+>zz2522 51Bang 3.4 Anh hưởng của môi trường nên va liêu lượng nước dừa đên trọng lượng cumchổi (mg) của lan hỗ điệp thom trong điều kiện in vitro tại thời điểm 40 NSC 52Bảng 3.5 Ảnh hưởng của liều lượng nước dừa va môi trường nền đến số lá (lá/cây) củalan hồ điệp thơm trong điều kiện in vitro tại thời điểm 30 và 40 NSC 53

Bang 3.6 Anh hưởng của nông độ nước dừa va môi trường nên đên chiêu dai lá (mm)

và chiều rộng lá (mm) của lan hồ điệp thơm trong điều kiện in vitro tại thời điểm 40

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến tỉ lệ tạo chdi (%) của cây của lan hồđiệp thơm trong điều kiện ¿7 Vi/rO -2-©225222222E122E222122322212212211271221122122122 2e 57Bang 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến số chdi (chéi) cây lan hồ điệp thơmtrong điều kiện 70 vifrO 5-52 2c 22221 212211211211121121111211112112111111 11 re 60Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi (mm) của cây lan hồđiệp thơm trong điều kiện i7 Vi/rO -¿ 2+©2252222222222222212211221221211221211221 221.2 xe 62

Bang 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến trọng lượng cụm chồi (mg) cây lan

hồ điệp thơm trong điều kiện v/ro thời điểm 60 NSC 225225222222222522 64Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số lá (lá/cây) của cây lan hồ điệp

thơm trong điền kiện EM VỈMØ cuc cao 2x00 n4 0 n0 0010 0n00014010421006066600 06 600 65

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều dài lá (mm) và chiều rộng lá

(mm) của cây lan hồ điệp thơm trong điều kiện in vitro tai thời điểm 60 NSC 67

Bang 3.13 Ảnh hưởng của các nồng độ NAA đến tỉ lệ ra rễ của mẫu cấy (%) của câylan hồ điệp thơm i7 Vi/fO - ¿2222222222222 22222322232221222122122112212211211 21121 ce 68Bang 3.14 Ảnh hưởng của các nồng độ NAA đến sé rễ (rễ/cây) của cây lan hồ điệp thơmtrong Gidu s00 DpHẠHằ.HHH.Ả 69

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của các nồng độ NAA đến chiều dài rễ (mm) và trọng lương (mg)của cây lan hồ điệp thơm trong điều kiện in vitro tại thời điểm 60 NSC 71Bang 3.16 Anh hưởng của các nồng độ NAA đến chiều cao (mm) cây lan hồ điệp thom

¡0 01749 ERREEEEESS 73

Bảng 3 17 Ảnh hưởng của các nồng độ NAA đến số lá (lá/cây) của cây lan hồ điệpthơm trong điều kiện i170 Wi/rO -©2+-722222222212221221221122122112112211211211211211 212 c.e 74Bảng 3.18 Ảnh hưởng của các nồng độ NAA đến chiều dài lá (mm) và chiều rộng lá(mm) của cây lan hồ điệp thơm trong điều kiện in vitro tại thời điểm 60 NSC 76Bảng PL4.1 Số liệu chuyên đổi Arsin(%) tỉ lệ mẫu tạo chồi cây lan hồ điệp thơm, thi

nạn i0 84

Bảng PL4.2 Số liệu chuyên đổi Arsin(%) ti lệ mẫu tạo chồi cây lan hồ điệp thom, thi

301150110757 — 85

Hình 1.5 Cấu trúc của a - naphthalene acetic acid (œ - NÑAA) : -: 5: : 25

Hình 1.4 Cấu trúc của 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid (2,4 - D) .: 25

Hình 1.6 Cấu trúc của 3 - indole acetic acid - 2-2 s22s+2E+2E+zE+zEzEzzzxzzezxez 25

Hình 1.7 Cấu trúc của indole - 3 - butyric acid (IBA) -2 222222+2z+2zzzzz2se2 35

Hình 1.8 Cấu trúc của benzyl amino purine (BAP) -2-522522222222222zz2zzzzzsrxz 26Hình 2.1 Tiêu chuẩn chéi lan hồ điệp thơm ở thí nghiệm -2-25- 40Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm - 2 22©2222222E22EE2EE2EE2EE22E22EEEEzrrrrev Al

Hình 2.3 Tiêu chuẩn chồi lan hồ điệp thom cho thí nghiệm 2 - 42

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 - 2-22 ©222SS22222EE2EE2EE22122212212212221212222 2e 43

Hình 2.5 Cây đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 3 (chưa cắt rễ) - 2-2 55252z+552 44Hình 2.6 Sơ d6 bố trí thí nghiệm 3 - 2-2 2 522SE2EE2EE2EE2EE22E2ZE22E22E225222222222e2 45

Hinh 3.1 Anh hưởng của môi trường nên và liêu lượng nước dừa dén sô chôi của lan

hồ điệp thơm (Phalaenopsis violacea), thời điểm 40 NSC - 55

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến số chồi của lan hồ điệp thom

(Phalaenopsis Vi0laC€A) 0n 44AHĂH., 65

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến số rễ của lan hồ điệp thơm (Phalaenopsis

violacea), thời điểm 60 NSC - 5-52 21221 212212212112111121111111111112121 211 ye 76

Hinh PL 1 Toàn cảnh thí nghiệm 1 (TONS CC) co ceniiiodebiebisdgtlasiadgcsssbesla2sassis 83

Hình PL 3 Bé trí thí nghiệm 3 (10 NSC) -¿-222222ccc.rrEEeceea

Hình PL 4 Mẫu cấy tiết Phenol, thí nghiệm 2, NT 2, thời điểm 60 NSC

MỞ ĐẦU

Đặt vần đề

Hoa đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm vừamang giá trị tỉnh thần vừa mang giá trị kinh tế Hàng năm có nhiều giống hoa được laitạo và nhập nội, nhiều tiễn bộ kỹ thuật mới được nghiên cứu va áp dụng trong san xuất

nên diện tích trồng hoa ngày càng được nâng cao Sản xuất hoa lan thương mại đã và

dang phát trién mạnh ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thé trên thé giới (Khuất Thị Ngọc, 2007)

Lan hồ điệp thơm (Phalaenopsis violacea) có nguồn gốc từ bán đảo Malaysia và

có họ hàng gần với Phalaenopsis bellina của Borneo Phalaenopsis violacea là cácgiống bố mẹ quan trong dé tạo ra các giống Phalaenopsis lai mới với hương thơm đặc

biệt Hoa có hương thơm dễ chịu và có độ bền cao Hiện nay, lan hồ điệp thơm đang có

giá trị kinh tế cao

Phalaenopsis violacea có bản chất biêu sinh, hầu như không sinh sản sinh đưỡng(Koštr và ctv, 2004), hầu hết các cây con được tạo ra từ gieo hạt trong điều kiện in vitro

(Tokuhara và Mii, 1993).

Trong quy trình nhân giống lan hồ điệp thơm (Phalaenopsis violacea) từ hat,

ngoài cơ sở đầu tiên là sự nảy mầm của hạt thì nhân nhanh chdi, tạo rễ đóng vai trò quantrọng để có thé tạo ra số lượng lớn và tạo thành một cây con hoàn chỉnh từ những hạt

ban đầu Tuy nhiên, nghiên cứu về các giai đoạn sau gieo hạt của loài này chưa đượcquan tâm, phát triển

Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng là nhu cầu tat yêu trong quy trình nuôi cấy mô

tế bào nhằm tăng hiệu quả nhân giống, tiết kiệm thời gian và chỉ phí BA, NAA là cácchất điều hòa sinh trưởng phô biến, an toàn cho người sử dụng Ngoài các chất điều hòasinh trưởng tông hợp thi dung dịch hữu cơ như nước dừa cũng được sử dụng phổ biến

vì gần gũi, tiết kiệm chi phí nhưng cũng mang lại hiệu quả đáng kể Tuy nhiên, liềulượng, nồng độ các chất này khi sử dụng trên những đối tượng khác nhau còn phụ thuộcvào hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh từng loài, nên cần tiến hành các thí

Xuất phát từ thực tiễn nêu trên nên đề tài: “Ảnh hưởng của các nồng độ nướcdừa, BA, NAA đến khả năng nhân chồi và sinh trưởng của lan hồ điệp thơm(Phalaenopsis violcea) trong điều kiện in vitro” đã được tiến hành.

Mục tiêu

- Xác định được môi trường nên và liêu lượng nước dừa, nông độ BA và NAA

thích hợp đối với sự nhân chồi lan hồ điệp thơm trong điều kiện in vitro

- Nông độ NAA thích hợp cho sự hình thành và phát triển rễ cây lan hồ điệp thom

trong điều kiện in vitro

Yêu cầu

Bồ trí thí nghiệm theo quy phạm và thu thập đầy đủ số liệu của sự sinh trưởng,phát triển cây lan hồ điệp thom in vitro thông qua chỉ tiêu số chồi, chiều cao chi, chiều

cao cây, số rễ và chiều dài rễ

Thí nghiệm có so sánh, thống kê phân hạng giữa các nghiệm thức

Giới hạn của đề tài

Các nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống in vitro cây lan hồ điệp thom(Phalaenopsis violacea) được tiễn hành trong phòng thí nghiệm ở các giai đoạn: nhânchỗi và tạo rễ trong thời gian từ tháng 02/2023 đến tháng 07/2023

Chương 1

TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Tổng quan về cây lan hồ điệp (Phalaenopsis sp.)

1.1.1 Phân loại

Theo Trần Hợp (1998), theo hệ thống thực vật học mới nhất về cây hoa lan được

phân loại như sau:

Giới (Kingdom): Plantae (thực vật)

Ngành (Division): Magnoliophyta (Ngọc lan) “ea

y

Lớp (Class): Liliopsida (Hanh) rs

Bộ (Order): Orchidales

Ho (Family): Orchidaceae

Ho phu (subfamily): Epidendroideae

Tong (Tribe): Vandae

Tông phụ (subtribe): Aeriadae

Nhom (Alliance): Phalaenopsis

„ Hình 1.1 Phalaenopsis amabilis (L.) Blume

Giông (Genus): Phalaenopsis

Nguồn: Peggy Alrich, Wesley Higgins (2014)

Loài: Phalaenopsis sp.

Tén tiéng việt: lan hồ điệp, tiểu hồ điệp

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Các họ lan được đánh giá là các loài hoa cao cấp trong giới thực vật, bao gồm

hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng

năm Do đó chúng được phân bố vùng rộng lớn, trải từ xích đạo đến bắc cực, từ đồng

bằng tới các vùng núi băng tuyết, các loài lan rất khác nhau Các loài lan chủ yếu sốngtrên cây cao sống biéu sinh lâu năm chúng được gọi chung là phong lan Các loài mọc

trong đất gọi là địa lan và một số loài mọc trên núi đá gọi là thạch lan (Tran Hop, 1998)

Lan hồ điệp là một trong những loại phong lan được trồng phổ biến trên thé giới

Hồ điệp, được mệnh danh là hoàng hậu của các loài phong lan, được phát hiện đầu tiênnăm 1750, đến năm 1852 dùng từ Blume dé định danh Đến nay đã phát hiện đượchơn 70 loài Lan hồ điệp trồng thương phẩm đều là giống lai (Đào Thanh Vân và

Đặng Tố Nga, 2007)

Hồ điệp Phalaenopsis sp có tên từ chữ Hy Lap Phalaim - bướm và Opsis - giỗng,

đa số loài của chỉ có hoa giống như con bướm Lan hồ điệp có tên khoa học là Phalaenopsissp., là loại lan có hoa lớn, đẹp, bền Lan hồ điệp có màu sắc phong phú, không thua kémgiống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại lan hồ điệp có sọc nam

ngang hoặc thang đứng hoặc có đốm to hay nhỏ Giống Phalaenopsis có khoảng 70 loài

trong đó có 44 chủng loại, mọc từ dãy Hymalaya đến châu Á có hơn 20 loài lan ưa nóng

có ở các nước Đông Nam Á như bán đảo Mã Lai, Indonesia, Philippine, đông Ấn

Độ (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Lan hồ điệp là những cây sống biểu sinh, trên những cây cao trong rừng dày có

am độ cao hoặc rat gần dat, trên những cây nhỡ (arbuter), hay sống bám trên những hốc

đá, hay trên những đám rêu dày, một vài loài sống ở vùng ven biển Lan hồ điệpPhalaenopsis sp ít thích hợp với nắng hơn so với những loại phong lan có giả hành.Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển là 15 - 38°C và giống này thường

sống ở cao độ 200 m - 400 m (Tran Hop, 1998)

Hiện nay có nhiều chi lan khác nhau được lai với Phalaenopsis và lai ngay trong

cùng một chi, tạo ra 40.000 loài lai (Nguyễn Thiện Tịch và ctv, 2006), chi lan hồ điệp

có thê chia ra thanh 5 nhóm trong đó có 2 nhóm quan trọng đó là:

- Nhóm Euphalaenopsis: nhóm này có đặc điểm nổi bật là cánh hoa dài và rộng

hơn lá đài, cánh môi rộng và có hai phụ bộ riêng rẽ ở phía trước, bộ lá thường có màu

lục đậm hơn ở mặt trên sam ở mặt dưới, hoa nhiều và mảnh mai, một vài loài tiêu biểu:Phalaenopsis amabilis, P philippinensis, P schilleriana.

- Nhóm Stauroglottis: nhóm này có đặc điểm khác biệt như sau: lá dài và cánh

hoa cùng một cỡ, cánh môi hẹp và không có bộ phụ ở phía trước, bộ lá có màu xanh lục

nhạt ở cả hai mặt trên và dưới lá, hoa nhỏ hơn và cánh dày hơn thường có màu hoa văn,

một vài loài tiêu biểu là Phalenopsis giganatea theo Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam có 7

loài Phalaenopsis: P amabilis (L), P cornucervi, P lobbi, P gibbosa, P mannii Reichbf, P petelotii Mansf, P fuscata Reichhf.

Theo Tran Hợp (1998), ở Việt Nam, đã ghi nhận có 6 loài hồ điệp rừng tự nhiên:

1 Phalaenopsis mannii Rchob F (lan hồ điệp An) xuất hiện dọc từ Quảng Trị

lên tới Tây Nguyên.

2 Phalaenopsis gibbosa Sweet (lan hồ điệp Trung) xuất hiện ở Hòa Bình, Hà

Giang, Tuyên Quang, Hà Tây và Đà Lạt.

3 Phalaenopsis lobbii Rchob F (lan hồ điệp Cúc Phương) có ở rừng Cúc Phương

chân của trụ và không có cựa ở đáy, ba thùy với phụ bộ hay cục u ở đáy thùy giữa, hay

thùy bên, một trong những bộ phận ấy là hai sợi râu của môi hay phiến nhỏ dựng đứng

ở thùy môi Trụ tương đối dài và nhỏ, hai khối phan tròn hay hình trứng, vĩ phan kéo

dai và rộng ở phần trên và hẹp ở phần dưới, gót đẹp, nhiều loài thường cho cây con trêncọng phát hoa và nhiều loài cho vân màu trên lá (Đinh Thị Giang, 201 1).

Re

Hệ rễ của lan hồ điệp không phân chia thành rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh, lông hút

rõ ràng mà rễ của lan hồ điệp thường có dang hình tròn, to, mập, có nhánh hoặc khôngphân nhánh Rễ thường có màu trắng, đầu rễ có màu xanh, màu vàng trắng hoặc màu đỏ

tối Rễ của lan hồ điệp thường mọc tràn ra ngoài chậu, buông lơ lửng ra không khí, cólợi cho việc hút O2 và nước Có những nghiên cứu cho thấy rễ cây thuộc nhóm phonglan cũng có khả năng quang hợp (Đào Thanh Vân và Đặng Tổ Nga, 2007)

Phần rễ trên thường sống cộng sinh với nắm, do hạt của hoa lan nói chung đềukhông có nội nhũ, không được cung cấp đủ dinh dưỡng khi nảy mầm, trong điều kiện

nảy mam tự nhiên, cần dựa vào các mầm sống cộng sinh để hút chất dinh dưỡng Trongquá trình sinh trưởng của cây, các loài nắm này sống cộng sinh tại rễ lan để tương trợcho nhau, vì thế rễ của hoa lan còn gọi là rễ nắm Việc tưới và bón phân cho hoa lan hồ

điệp phải yêu cầu bón phân thật loãng, chính là vì trên rễ cây có nắm cộng sinh (Đào Thanh

Vân và Đặng Tố Nga, 2007)

Thân

Lan hồ điệp thuộc loại lan đơn thân, tức là thân của chúng rất ngắn không hề cógiả hành, cũng không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt Lan đơn thân sinh trưởng rất chậm

chạp, thân chính của nó trong môi trường thuận lợi hàng năm lại mọc ra các lá mới,

chúng mọc theo hướng cao hơn theo phương thắng đứng còn cành hoa thì mọc ở rìa thân

hoặc nảy ra từ nách lá, lá mọc xếp thành hai hàng, xen kẽ nhau Theo sự sinh trưởng của

cây, các lá già ở đưới gốc dần dần già héo và rụng đi, đến khi có chồi nách mọc ra nhưngthường không mọc đài ra được Vì cây lan rất khó ra chồi nhánh nên không dùng phươngpháp tách cây dé nhân giống Thân của lan hồ điệp, ngoài tác dụng giữ cho cây thangđứng, còn có chức năng tích trữ chất dinh dưỡng và nước cho cây (Đào Thanh Vân vàĐặng Tố Nga, 2007; Dinh Thị Giang, 2011)

Lá

Lá của lan hồ điệp to dày, đầy đặn, lá mọc đối xứng, ôm lấy thân cây Số lá trênthân cây thường không nhiều, thông thường một cây lan trưởng thành có từ bốn lá trởlên Trong nách lá có hai chéi phu, chéi phụ trên to hơn là chồi hoa sơ cấp, bên dưới làchỗồi dinh dưỡng sơ cấp Các chdi sơ cấp này sinh trưởng đến một mức độ nào đó thì bắtđầu đi vào giai đoạn ngủ nghỉ Màu sắc của lá gồm 3 loại: lá màu xanh; mặt trên lá vàmặt đưới lá màu đỏ; mặt trên của lá đốm và mặt dưới lá màu đỏ Căn cứ vào mau sắc lá

có thé phân biệt được màu sắc hoa của chính nó, lá màu xanh thường ra hoa mau trang

hoặc hoa nhạt mau, còn các lá màu khác thường cho hoa màu đỏ (Dinh Thị Giang, 2011).

Lan hồ điệp dé thích nghỉ với điều kiện sinh thái nguyên sinh, thông thường bềmặt trên của lá không có khí khổng, chỉ có mặt dưới của lá mới có khí không Lan hồ

điệp là loại thực vật CAM, giống như các thực vật CAM khác khí khong mo ra vao ban

đêm dé thu nhận CO> dé tạo ra axit “Malic” dự trữ trong cơ thể, vào ban ngày CO2 đượcgiải phóng, tham gia vào quá trình quang hợp Ưu điểm của loại thực vật này là khíkhổng không mở ra vào ban ngày nên cây không bị mat nước, thoát hơi nước Điều kiệnnày đối với những cây không được cung cấp nước đầy đủ thường xuyên là rất có lợi.Khi cây có đủ nước thì khí không cũng có thé mở ra vào ban ngày hút khí CO2 dé tiếnhành quang hợp bình thường Nếu gặp phải điều kiện khô hạn nghiêm trọng thì khíkhông sẽ đóng lai, quá trình quang hợp diễn ra chỉ vừa đủ cho lượng CO2 tạo ra trongchu trình hô hấp Đây chính là nguyên nhân khiến cho lan hồ điệp mặc dù không có giảhành nhưng lại có khả năng chịu hạn tốt (Đinh Thị Giang, 2011)

Hoa

Canh hoa của lan hồ điệp mọc ra từ nách lá, thông thường đếm theo thứ tự từ trên

xuống thì cành hoa bắt đầu mọc ra từ lá thứ 3 hoặc thứ 4 Các cành hoa có thể phân

nhánh hoặc không phân nhánh Hoa lan to thường ít phân nhánh còn lan hoa nhỏ phân

nhánh rất rõ thậm chí một số giống hoa lan nhỏ có thé nở đến 200 bông hoa Cành hoakhi chưa phân hoá các đốt hoa thường ở dạng tiền chdi nách hoặc tiền chỗồi hoa, ở nhiệt

độ dưới 15°C và bi bam ngọn có nay thành chéi hoa, nhưng nếu nhiệt độ cao qua 28°Cthì chỉ có thé nảy thành chdi nách (Đào Thanh Vân và Đặng Tố Nga, 2007)

Đa sô các giông hoa đơn cây chỉ ra một cành hoa, có một sô giông khác hoặc

được lan có bông hoa to đẹp, cần phải khống chế số bông trên một cành hoặc cắt bớt đimột số cành nhánh (Đào Thanh Vân và Đặng Tổ Nga, 2007).

Quả

Hoa lan hồ điệp chỉ tạo quả qua thụ phan nhân tao hoặc thu phan nhờ côn trùng

Vỏ quả có hình que, phát triển chậm thường qua 4 tháng mới chín và tách vỏ (Đào Thanh

Vân va Đặng Tố Nga, 2007)

Hạt

Số lượng hạt trong một quả là rất nhiều, hạt nhỏ li ti và nhẹ Hầu hết là không cóchất nuôi dưỡng như các loại hạt khác Có thê bị gió cuốn bay đi khắp nơi nên khả năngphát tán rộng Khối lượng toàn bộ hat ở trong quả chi bằng 1/10 - 1/1000 mg, trong khikhông khí chiếm khoảng 76 - 79% thể tích hạt (Đào Thanh Vân và Đặng Tố Nga, 2007)

Số lượng hạt trong một quả khác nhau do sự khác nhau về cây bố, mẹ đem thuphấn Những hạt của chúng thường rất nhỏ, có dạng bột, không có phôi nhũ, trong điềukiện tự nhiên rất khó tự nảy mầm thành cây con, thường phải gieo hạt trong môi trường

vô trùng thích hợp mới có thể thu được cây con với số lượng lớn Khi gieo hạt trong

điều kiện vô trùng, thường dé thể tiền chồi (protcorm) nảy mầm thành cây (ĐàoThanh Vân và Đặng Tổ Nga, 2007)

Hạt cấu tạo bởi một khối chưa phân hoá Sau 2 - 18 tháng hạt mới chín tùytừng loài, phần lớn hạt đều chết vì không chứa chất dinh dưỡng, chúng chỉ sinh sôi

nảy nở khi gặp được loài nam cộng sinh hỗ trợ chất dinh dưỡng Vì vậy, khả năng

hạt nảy mầm thành cây là rất hiếm, chỉ có thé trong điều kiện rừng âm ướt nhiệt đới

(Hoàng Ngọc Thuận, 2015).

1.1.4 Điều kiện sinh thái

Ánh sáng

Lan hồ điệp rất ky ánh sáng chiếu thang trực tiếp, do đó cần phải có biện phápche sáng đồng thời tuỳ thuộc vào tuôi cây lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sángtrồng cho thích hợp Thời kỳ ươm cây con nhu cầu về ánh sáng có cường độ là 1000 -

1200 lux, giai đoạn bánh tẻ là 1200 - 2000 lux, giai đoạn thúc ra hoa là 2000 - 3000 lux.

Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và thu phải che đi 75 - 85% ánh sáng, cầnphải có 2 lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đông xuân thì ánh sáng yếu hơn, chỉ cầnche 40 - 50% ánh sáng là đủ (Đào Thanh Vân và Đặng Tố Nga, 2007)

Nước tưới

Các mùa khác nhau, lượng nước tưới cũng khác nhau Các giá thé trồng khácnhau thì lượng nước tưới cũng khác nhau Do lá của lan hồ điệp khá dày, lượng nướcchứa trong lá khá nhiều nên lan hồ điệp chịu hạn tốt Mùa xuân độ âm không khí caonên cách 3 - 7 ngày tưới nước một lần: mùa hè, thu, nhiệt độ không khí cao, lượng nướcbốc hơi mạnh, thông thường cách 1 - 2 ngày tưới dam nước một lần; còn mùa đông,nhiệt độ thấp, âm độ không khí cũng thấp, để đảm bảo những điều kiện nhất định về âm

độ đồng thời tránh cho lá tích nước, nếu lá tích nước sẽ làm cho lá bị lạnh hại Vì thế

thông thường vào lúc sau 10 giờ sáng và trước 15 giờ chiều thì tưới nước Nếu điều kiện

cho phép sau khi tưới nước nên đề cho cây được thoáng khí thông gió, để cho nước đọngtrên mặt lá bị bay hơi hết sẽ giảm sự phát sinh của bệnh hại (Đinh Thị Giang, 201 1)

Dinh dưỡng

Lan hồ điệp yêu cầu được cung cấp dinh dưỡng quanh năm vì hồ điệp không có

hồ điệp vừa chịu được khí hậu nóng âm lại vừa chịu được khí hậu mát nên Việt Nam

được xem là địa điểm lý tưởng để nuôi trồng lan hồ điệp Khi gặp điều kiện thuận lợi và

chăm sóc tốt hoa sẽ ra quanh năm (Đào Thanh Vân và Đặng Tố Nga, 2007)

1.1.5 Giống lan hồ điệp thom (Phalaenopsis violacea)

Phân loại

Theo Witte H và Amn (1861), Phalaenopsis violacea được phân loại như sau:

Giới (Kingdom): Plantae

Ngành (Division): Magnoliophyta

Lop (Class): Liliopsida

Bộ (Order): Orchidales

Ho (Family): Orchidaceae

Ho phu (subfamily): Epidendroideae

Tông (Tribe): Vandae

Tông phụ (subtribe): Aeriadae

Nhóm (Alliance): Phalaenopsis

Giống (Genus): Phalaenopsis

Loai: Phalaenopsis violacea Nguồn: Motohiro Sunouchi (2006)

Nguồn goc và phân bố

Phalaenopsis violacea có nguồn gốc từ đảo Borneo, là một loài lan đặc

hữu của quần đảo Andaman, quần đảo Nicobar và tây bắc Sumatra (Pavallekoodi

Gnasekaran và ctv, 2010).

Đặc điểm thực vật học

Rễ: như các loài lan hồ điệp thông thường, rễ của cây Phalaenopsis violacea thích

ứng với việc lưu trữ nước và hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường xung quanh

Thân: Phalaenopsis violacea có thân ngắn và phình lên tạo thành một cụm thân

Hình 1.2 Phalaenopsis violacea Witte H (1861)

Lá: thường là dạng lá dài, hẹp và mỏng, có mau xanh nhạt hoặc xanh sam Lámọc thành từng cụm dày đặc và gắn chặt vào thân cây.

Hoa: thường có hình phướn và kích thước từ 5 - 8 cm Màu sắc của hoa có thé từ

tím nhạt đến tím đậm, thường có các đốm nhỏ màu tối trên cánh hoa Hoa có hươngthơm dễ chịu và có thể tồn tại trong thời gian dài Khác với các loài hồ điệp thông

thường, Phalaenopsis violcea, phát hoa có khả năng phân hóa vô han, mỗi lần phân hóa

cho từ 3 đên 5 hoa, hoa có thê xuât hiện quanh năm, tuy nhiên rộ nhât vào mùa xuân.

Phalaenopsis violacea là giỗng bỗ mẹ quan trọng dé tạo ra các giống hồ điệp laimới với hương thơm đặc biệt Do Phalaenopsis violacea có bản chất biéu sinh nên chúngkhông phù hop dé nhân giống sinh dưỡng (Košïr và ctv, 2004), với hầu hết các con laitạo ra từ hạt nuôi cay in vitro (Tokuhara va Mu, 1993)

Hình 1.3 Một số hình anh về hoa lan hồ điệp thom Phalaenopsis violcea sp.Nguồn: Hoa lan Trần Hiếu (2022)

1.1.6 Vị trí của lan hồ điệp trên thị trường

Trên thế giới

So với các loại lan trên thị trường hiện nay, thì hồ điệp nồi bật hơn bởi các đặc

tính của hoa đa dang, màu sắc phong phú, hoa lâu tàn, trung bình hoa tươi trên cành có

thé kéo dài 3 - 4 tháng (Broly, 1982) Truc phát hoa dài, đường kính lớn, mang nhiềuhoa, có 7 - 15 hoa, do đó rất thuận lợi cho việc trang trí và có thể cắt cành xuất khâu,

hơn một số giống lan khác Nếu biết dùng biện pháp kỹ thuật dé thúc day việc ra hoa

sớm thì sẽ có lợi nhiêu trong việc kinh doanh.

Trong những năm gan đây, lan hồ điệp đã trở thành lan trồng chậu được ưa

chuộng nhất Sản lượng chiếm trên 75% trong các loại lan được trồng trên thế giới

(Griesbash, 2002) Tại Hà Lan, hồ điệp là loại được trồng trong chậu và có giá trị kinh

tế nhất trong ngành trồng hoa Tại Mỹ, hồ điệp được nhập vào dé trồng trong chậu trang

trí hoặc dưới dạng quà tặng cao cấp

Hiện nay, lan hồ điệp được trồng khắp nơi trên thế gidi, hầu hết là ở Đức, NhậtBan, Đài Loan, Thái Lan, Trung Quốc Cây con được nuôi cây mô phô biến ở các nướcnhư Thái Lan, Dai Loan Sau đó, xuất khâu đến các nước khác dé thương mại, lợi nhuậnđem về từ việc xuất khâu cây con hay cây có hoa đều lớn

Ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu thích hợp và có nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho hoalan hồ điệp sinh trưởng và phát triển, nhiều tiềm năng trở thành một nước sản xuất hoalan hồ điệp lớn trong khu vực Theo số liệu thống kê tính đến năm 2004, diện m tíchtrồng hoa của cả nước xấp xi 9.000 ha (Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thi Kim Lý,2005) Néu duoc dau tu khai thac hợp lý mang lai lợi nhuận lớn cho người trồng hoa nóiriêng và sự phát triển nông nghiệp nói chung

Năm 2009, quy mô diện tích sản xuất hoa lan hồ điệp ở miền Bắc đạt khoảng4.400 m2, cung cap cho thị trường khoảng 131.000 cây, đáp ứng được 21% nhu cầu củathị trường Hiệu quả kinh tế đem lại từ sản xuất hoa lan hồ điệp là rất cao Qua tính toán

cho thấy, lãi thu được từ sản xuất lan hỗ điệp đạt trung bình từ 280 - 540 triệu đồng/1000

m như mô hình tại Viện Nghiên cứu rau quả Đặc biệt như một số mô hình cho lãi từ

700 triệu - 1 tỷ đồng/1000 m? ở tỉnh Lâm Đồng như vườn lan Minh Huệ

1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô

1.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Khái niệm

Nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả phương thức

kiện vô trùng Trong môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,

vitamin, các hormones tăng trưởng và đường.

1.2.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trên thế giới

Năm 1838, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tếbảo và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ các tế bào hợpthành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin đi truyền có trong các tế bào đầutiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng toàn bộ

cơ thé

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden vàSchwann vào thực nghiệm dé chứng minh tính toàn năng của tế bao thực vật Ông viết:

“Dé kết luận, tôi tin tưởng rằng tôi đã không đưa ra một tiên đoán quá táo bạo nêu cho

rằng bằng cách nuôi cấy, người ta có khả năng tạo thành công các phôi nhân tạo từ các

tế bào soma” Nhưng ông đã thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá

một số cây một lá mầm Ngày nay, chúng ta đã biết được nguyên nhân thất bại là vì câymột lá mam là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa, ông lại dùng các tế bào đã mat hết

khả năng tái sinh.

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong nuôi cay mô tế bào thực vật, khi White(người Mỹ), nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicumesculenfum) Cũng trong thời gian này, ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy mô tế bào tượngtầng một số cây gỗ và xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô seo của acid - B -

Indolacetic acid (IAA) và nhóm ba vitamin B do White đề nghị: Thiamin (Bì), Pyridoxin(Be), Nicotinic acid Việc phát hiện IAA, NAA, 2,4 - D và Kinetin cùng với phát hiện

vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong gian đoạn thứ hai của nuôi

cây mô thực vật.

Năm 1954, Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ

lệ Cytokinin/Auxin Nếu tỷ lệ Cytokinin/Auxin thấp ảnh hưởng đến rễ và ngược lại nếu

tỷ lệ này cao sẽ kích thích tạo chồi ở mô sẹo Thành công của Skoog và Miller dẫn đến

những phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba cho lịch sử nuôi cây mô tế

bao thực vật.

Trong thời gian từ năm 1945 đến 1954, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn (các

tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác) đã được phát triển Nuir, Hildebrandt

và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách

lac trên máy lac.

Năm 1956, Nickell nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu

(Phaseolus vulgaris).

Năm 1959, Melchers va Beckman đã nuôi liên tục các tế bao đơn trong bình códung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung

dịch dinh dưỡng mới.

Năm 1960, Morel đã nhận thấy các đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan(Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các Protocorm Khi chia cắt các Protocorm

va nuôi cấy tiếp thì được các Protocorm mới Khi để trong các điều kiện nhất định thì

Protocorm có thê phát triển thành cây lan con Morel có thể phục tráng tạo các dòng vôtính không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá tri đối với khoai tây, dâu tây,cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác

Cũng trong năm 1960, Bergman công bồ có thé sử dụng phương pháp lọc đơngiản để thu được huyền phù không có các tế bào dính cụm Cùng với kỹ thuật gieo tếbào của Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từmột tế bào, chứng minh dược tính toàn năng của tế bào thực vật

Sau đó, Cooking ở trường đại học Nottingham (Anh) công bố có thé dùng men

cellulose dé phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn,

không có vỏ bọc gọi là Protoplast.

Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của Protoplast vào đầu những năm 1970,khi tác giả Nhật Nagata và Takebe thành công trong việc làm cho các Protoplast tách từ

mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một quần thé tế bào trong môi

trường lỏng, các Protolast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định

và hap thu các phân tử bên ngoài, các nhà nuôi cây mô đặt hy vọng vào kỹ thuật này dénhân giống có kết quả hơn.

Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xứớng việc biến tính của tế bào thực vật

Ông cho rằng các tế bào, thậm chí các hạt giống thực vật, đều có khả năng hấp thu DNAngoại lai vao trong tê bao.

Năm 1966, Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cay

túi phan cây cà độc dược (Datura inoxia) Từ đó người ta bắt đầu chú ý đến kỹ thuậtnuôi cấy túi phan

Năm 1967, nhóm Bourgin và Nisch tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây

thuốc lá Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thànhcông ở nhiêu loại cây trông.

Từ năm 1980 đến 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ

gene thực vật được công bố Nhờ các plasmid, phân tử DNA vòng thường có trong các

tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một genexác định và đã thực hiện thành công.

Ngoài phương pháp chuyền gene thông qua vi khuẩn, còn có các phương phápchuyền gene khác như: kỹ thuật sử dụng xung điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm(micro injection), sử đụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), súng bắn gene (gene gun)đang được các phòng thí nghiệm trên thé giới phát triển mạnh và đạt kết quả tốt

Chúng ta đang bắt đầu giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó là

giai đoạn nuôi cay mô tế bào thực vat được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống,

nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận ditruyền bậc cao Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô, tế bào đơn độc trong môitrường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn carbon củachúng Các kỹ thuật đề tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các biện pháp khác củachương trình là tiền đề được chuẩn bị trong các giai đoạn trước

Ở Việt Nam

Sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cây mô thực vật

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, ViệnKhoa Học Việt Nam khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phươngpháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy môsẹo và Protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao phan lúa và thuốc lá được công bóvào năm 1978 (Lê Thi Muội va ctv, 1978; Lê Thị Xuân va ctv, 1980) Tiếp đó là thànhcông nuôi cấy Protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thanh, 1978; NguyễnĐức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981) Tiếp theo là phân viện Khoa Học Việt Nam ởThành phố Hồ Chí Minh, sau đó Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học KỹThuật Nông Nghiệp Việt Nam và các phòng thí nghiệp nuôi cấy mô tế bào cũng đượcthành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay chúng ta đã có rấtnhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện DiTruyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung Ương ), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sởsản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ )

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vậtphát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giốngkhoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm

Nghiệp) Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào

kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Định

Thị Tòng và ctv, 1994) Các kết quả về dung hợp tế bao trần, chuyên gen lục lạp cũng

thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành va ctv, 1997) Nuôi cấy bao phan dé tạodòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống

Nông Nghiệp Nuôi cay các cây được liệu quí dé bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế

bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo

như Paulownia, đó bầu, Neem Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống,tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh Nghiên cứu cải thiện 7 điều kiệnnuôi cấy in vitro, bioreactor cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy dau, hoa lan,

cây cảnh Lần đầu tiên trong nước, các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công mô phôi

vô tinh (soma), mô chổi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi

trường lỏng tạo điều kiện rất thuận lợi cho việc nhân sinh khối quy mô lớn tạo sản phẩm

có khả năng thương mại hóa Tạo và nuôi nhân rễ bất định sâm Ngoc Linh và bước đầughi nhận được sự hình thành rễ tơ (hairy root) sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩnAgrobacterium rhizogenes, tạo điều kiện cho việc nuôi nhân quy mô lớn sinh khối nhằmthu hoạt chất phục vụ ngành mỹ phẩm và y được Đến năm 2015, ứng dụng và công đãtập trung vào công nghệ nuôi cấy mô các với đề tài “Nghiên cứu một số giải pháp kỹthuật Công nghệ cao nhằm nâng cao hiệu quả trong nuôi cay mô”, sau thời gian nghiên

cứu đã thu được như kết quả như: đã chế tạo hệ thống chiếu sáng thông minh sử dụng

đèn LED trong nhân giống cây Đảng sâm (Codonopsis Javanica) bằng phương phápnuôi cay mô quy mô thí nghiệm Hoàn chỉnh Quy trình công nghệ sản xuất cây giốngĐảng sâm (Codonopsis Javanica) bằng phương pháp nuôi cấy mô công nghệ cao quy

mô thí nghiệm (Cục thông tin Khoa học và Công nghệ quốc gia, 2020)

1.2.3 Quy trình thực hiện nuôi cấy mô in vitro

Theo Nguyễn Văn Ây (2019) nuôi cấy mô gồm 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chuan bị cây làm vật liệu gốc chọn cây me dé lay mẫu thường làcây ưu việt, khỏe mạnh, đảm bảo sạch bệnh và có giá trị kinh tế cao Chọn cơ quan délay mẫu thường là chéi non, đoạn thân, đoạn thân có chéi ngủ, hoa non, lá non Mô đượcchọn dé nuôi cay mô là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặctính sinh học quý của cây mẹ và ôn định

Tùy vào điều kiện mà giai đoạn này có thé kéo dai từ 3 — 6 tháng

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu (nuôi cấy khởi động): Là giai đoạn khử trùng đưamẫu vao nuôi cấy in vifro Trong nuôi cây mô, khử trùng mẫu cấy là rat quan trọng nhằm

dam bao mẫu cay không bị nhiễm khuẩn, tỷ lệ sống cao, mẫu tồn tại và sinh trưởng tốt

Thông thường sử dụng phương pháp nhiệt, lọc, hóa chất và một số phương pháp khác

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chéi

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi

cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi

cấy là các thé chéi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thé chồi, đôi khinồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điềukiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Đây là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có đầy đủ

lá, thân, rễ dé chuẩn bị chuyền ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh dé năng cao sứcsống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thayvào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy khác với điều kiện tựnhiên bên ngoài, đây là một bước làm thích nghỉ trước khi tach ra khỏi điều kiện in vitro

Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, hàm lượng Auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự

trẻ hóa của mau, kiểu di truyền

Giai đoạn 5: Thich ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Dé đưa cây từ ốngnghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu

về tiêu chuẩn hình thái nhất định như số lá, số rễ, chiều cao cây Cây con đã ra rễ đượclây khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ am cao,

cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện

bên ngoài, lúc nay có thé tăng cường độ chiếu sáng và hạ âm độ

1.2.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Theo Nickell (1973) phương pháp nhân giống in vitro có kha năng khắc phục

được nhiều trở ngại mà phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những ưuđiểm chính:

- Có hệ số nhân rất cao, rút ngắn thời gian đưa 1 giống mới vào sản xuất đại trà;

- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiêm năng sinh trưởng, phát triên

và năng suât cao;

- Tạo được dòng thuần của cây tạp hóa;

- Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội);

- Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen;

- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhấtđịnh hoặc hạt nảy mam kém.

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt

tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quá đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân

giống bằng phương pháp khác Ngoài ra, phương pháp này còn có những bat lợi sau:

- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thẻ rất cao nhưng cây con có kích thướcnhỏ, doi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm;

- Cây có thể có những đặc tính không mong muốn;

- Khả năng tạo đột biến tăng;

- Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào

nhiều lần;

- Cây giống có thé bị nhiễm bệnh đồng loạt;

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốcghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ;

- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

- Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giaophan trong ngân hàng gen

1.2.6 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nghiên cứu và sản xuất

Dưới các điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào thực vật có thể nhân lên, hình thành

cơ quan và thậm chí có thê tái sinh cây hoàn chỉnh Sự tái sinh cây hoàn chỉnh từ một

nhóm tế bào bằng phương pháp nuối cây mô thé hiện một bước quan trọng trong nôngnghiệp hiện đại.

Một số ứng dụng quan trọng của phương pháp nuối cây mô trong nghiên cứu và

sản xuất:

- Bằng phương pháp nuôi cây mô người ta có thể tạo ra nguồn cung cấp một

lượng lớn giống cây trồng thương phẩm trong thời gian ngắn và có đặc tính giống hệt

cây mẹ Đồng thời có thé nhân giống nhanh chóng với số lượng lớn các dòng thực vật

vô tính có đặc tính di truyền có giá trị

- Rút ngắn thời gian sinh trưởng một số cây trồng có thời gian sinh trưởng dài,

trong nuôi cây thường được lay từ cây trưởng thành, nên tuy cây tái sinh còn nhỏ nhưngtuôi té bao đã trưởng thành, do đó khi đưa vào mỗi trường nuối cây thi thời gian trưởngthành, ra hoa của chúng được rút ngắn (Nguyễn Đức Thành, 2000).

- Thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo giống cây trồng bằng các phương pháp sinhhọc hiện đại như: xử lý bằng phóng xa, hóa chất gây đột biến, chuyên gen bằng phương

pháp sử dụng nuôi cấy mô, các yếu tô ngoại cảnh có thể được kiểm soát tốt hơn trong

môi trường chọn lọc Việc gây biến đổi di truyền và chọn lọc có thé tiến hành ở mức tếbào Cây tái sinh mang tính trạng di truyền mới, ít xuất hiện thê khảm (Bùi Chí Bửu và

Nguyễn Thị Lang, 2007)

1.2.7 Những trường hợp thường gặp trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tính bắt định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục dich tạo quan thé cây trồng đồng

nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua

nuôi cay mô sẹo Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện

giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến đị có lợi được báo cáo Tần số biến dị thìhoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen và Karp 1985) Nuôi cấy mô sẹo chobiến di nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh Cây trồng bị biến di tế bao soma qua nuôi cấythường là biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất và những biến dị này không di

truyền Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là

do thay đổi vị trí DNA Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền Số

lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến di cao Biến di nhiễm sắc thé nhiều hơn khi

nuôi cấy kéo dai (Phillips va ctv, 1988) Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần

cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị

Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinhtrưởng Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Tần số biến dị xảy ra phụthuộc vào các yếu tố: kiểu di truyền hay giống cây trồng, loại mô cấy và số lần cấychuyền nhiều hay ít

Sự nhiễm mẫu

Nhiễm là van dé rất được quan tâm và dé xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây

cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ côn trùng như ve bét, môi trường, dụng cụ và cácmáy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy.

Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây được xem làgiai đoạn khó nhất trong vi nhân giống Điều kiện trồng cây me và vị trí lay mẫu từ cây

me là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch Cây trồng trong nhà kính ít

nhiém vi sinh vật hơn ngoài đông ruộng.

Môi trường không khí phòng sáng, phòng cay gây nhiễm nghiêm trọng nếu khôngđược xử lý kịp thời, nắm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này.Nắm thường tôn tại dang bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người

ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều Nếu màng lọc tủ cây không tốt sẽgây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cay Ngoài ra, bào tử nắm còn tan công

gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3

tháng Các loài nam thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium

và Phialophra.

Ngoài ra côn trùng cũng là tác nhân gây nhiễm không kém gì nắm Đồng thời khi

xâm nhập chúng còn mang theo nam vào lúc này mẫu cấy bị nhiễm đồng thời cả côn

trùng và nắm

Hiện tượng thủy tỉnh thể

Hiện tượng thủy tinh thé là một dạng bệnh lý của cây, thân lá cây trong suốt vàchứa nhiều nước, khó nhân giống Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trườnglỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đồi khí thấp, quá trình thoát hơi nước

tập trung trong cây.

Đề hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể, phương pháp được nhiều người ủng hộ

nhất là làm giảm ảnh hưởng của nước trong môi trường nuôi cây bằng cách tăng nồng

độ đường hoặc giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy, tạo thông gió, tăng ánhsáng hay giảm nhiệt độ phòng nuôi cấy

Sự hóa nâu

Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm cho sự sinhtrưởng và của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có

chứa các hợp chất Tanin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non

Phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:

- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,

đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với nồng

độ thường dùng 0,1 - 0,3% Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triểncủa mô đo hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác

- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol quavòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau

- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường

ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic

acid, citric acid, L - cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione va mecaptoethanol.

Để han chế anh hưởng phenol và tanin các nhà khoa hoc đưa ra vài kỹ thuật khithao tác trên mẫu:

- Sử dụng mẫu nuôi cay nhỏ từ mô non;

- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng;

- Ngâm mẫu vào dung dich ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy;

- Nuôi cay mẫu trong môi trường long, oxy thấp, không có đèn 1 - 2 tuần

1.2.8 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Các chất ĐHSTTV đã được quan tâm và nghiên cứu từ cách đây hơn một thế kỷ

Các nhà sinh lý thực vật thừa nhận có 5 nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật chính

là auxin, gibberelin, cytokinin, acid abscisis và etylen (Nguyễn Văn Uyên, 1989)

Năm 1980, Sachs cho rằng các chất trong cây có tác dụng điều khiến sự sinh

trưởng các co quan khác nhau của cây Cùng năm Chares và Darwin nghiên cứu của ánh

sáng trên sự cong điệp tiêu Avena Năm 1910, Jensen thay rằng nếu loại bỏ diệp tiêu thì

không xảy ra sự uốn cong Năm 1919, Paal cho thấy nếu cắt bỏ diệp tiêu rồi đặt khôngđều hay lệch một bên lên chỗ thân bị cắt thì bao lá mầm vẫn uốn cong cach xa vi trí lệch

một bên của đỉnh Năm 1928, Went phát hiện vai trò kích thích sự kéo dài tế bào củaauxin Năm 1934, Kogl đã tách riêng auxin từ nước tiểu người và xác định đó là AIA.Năm 1940, Smit va ctv, cho rang, AIA là một thành phần ton tại tự nhiên của thực vậtbậc cao Các chất điều hoa sinh trưởng thực vật khác lần lượt được được khám phá sau đó.

Năm 1892, Wiesner cho rằng trong cây tồn tại nhân tố phân chia tế bào

Năm 1913, Haberland nhận thấy dịch chiết của mô cả rất có thể làm nhu môphân chia.

Năm 1926, Kurosawa phát hiện loài nam Gibberella fujikuroi ký sinh trên cây

lúa đã làm thân cây lúa kéo dài Năm 1934, Yabuta và ctv, đã kết tỉnh được acidgibberellic và loại hoạt chất này được sử dụng rộng rãi sau đó

Năm 1934, Gane nhận thấy khi quả chín tạo ra khi etylen Mãi đến năm 1960etylen mới được công nhận là một chất sinh trưởng ton tại tự nhiên

Năm 1953, Osbme khám phá hoạt chất có hoạt tính kích thích sự rụng lá Addicott

và ctv (1968) đặt tên là acid abscisis.

Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong nhữngứng dụng của nuôi cấy mô thực vật Morel (1960), đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng củacác loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cay sẽ hình thành các protocorm Khi chiacắt các protocorm và nuôi cay tiếp thì thu được các protocorm mới Khi để trong cácđiều kiện thích hợp nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con Do đó,

có thể phục trắng, tạo ra các dòng vô tính không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt có

giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả, và nhiều cây nhân giống vô tính khác

Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ protocorm chi cần sử dụng các

môi trường khoáng có bô sung nước đừa, khoai tây mà không sử dụng bat kỳ chất điềuhòa tăng trưởng nào Tanaka và Sakanishi (1985) và Tanaka (1987) đã sử dụng môitrường Knudson C cải tiến, còn Schmude (1983, 1985) sử dụng môi trường MS trongviệc tái sinh cây con từ protocorm Griesbach (1983), sử dụng môi trường Murushige

và Skoog cho việc tái sinh cây con từ protocorm trong khi Lin (1986), sử dụng môi

trường Knudson C cải tiến có bổ sung BA 1 mg/L dé chuyên protocorm thành cây con

Hiện nay, chúng ta đang bước vào giai đoạn nuôi cây mô thực vật được ứng dụng

và phát triển mạnh mẽ trong việc nhân giống, chon tạo giống, vào việc sản xuất các chấtthứ cấp có hoạt tính sinh học vào nghiên cứu lý luận di truyền bậc cao Nuôi cấy môthực vật hiện nay được đưa vào các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại(Nguyễn Văn Uyên, 1989)

Sinh trưởng và phát triển không phải là một chức năng sinh lý riêng biệt mà làkết quả hoạt động tổng hợp của nhiều chức năng, quá trình sinh lý trong cây

Sinh trưởng là quá trình tạo mới các yêu tô câu trúc của cây (các thành phân mới của tê bao, tê bào mới, cơ quan mới) thường dân đền sự tăng về kích thước và sinh chat của cây.

Theo Sabinin (1963), phát triển là sự biến đổi chất trong quá trình tạo mới các

yêu tô câu trúc của cơ thê làm cho nó có thê trải qua được chu kỳ sông của mình.

Sinh trưởng dinh dưỡng của cây là chuỗi các sự kiện cực kỳ phức tạp, nhưng phối

trí rất tinh vi Sinh trưởng bắt đầu bằng quá trình phân chia kéo dài và phân hóa tế bảo(Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989) Khi tiến hành các quá trình trên thì xảy ra quá trình phátsinh hình thái các bộ phận cơ bản của cây Tất cả các sự kiện đó được phối hợp nhờthông tin đã định sẵn trong ADN và nhờ chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong cây

Sự phát triển và phối hợp này đều chịu ảnh hưởng của môi trường mà trong đó cây pháttriển cũng như thành phần các chất dinh dưỡng cung cấp cho cây (Vũ Văn Vụ và ctv, 1993)

Chat sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là cáchợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phâm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng

hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi

một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp Chúng không phải làcác chất dinh dưỡng hay các nguyên tố dùng trong thực vật

= OH

ro 6X)

ct

Hình 1.5 Cấu trúc của 2,4 Hình 1.4 Cau trúc của ơ

-dichlorophenoxy acetic acid (2,4 - D) naphthalene acetic acid (a - NAA)

Hình 1.6 Cấu trúc của 3 Hình 1.7 Cấu trúc của indole 3

-indole acetic acid butyric acid (IBA)

Auxin là một nhóm các chat được tong hop chu yeu ở đầu than, đầu rễ, được vận

chuyền đến các bộ phận khác nhau của cơ thé dé kích thích sự tăng trưởng của tế bao.Các phản ứng auxin và sự sinh trưởng có liên quan đến vô số quá trình sinh lý và trao

đổi chất khác với mối quan hệ nhân quả giữa các auxin ARN và chuyển hóa proteinkhông phải hoàn toàn rõ ràng Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử

lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử

lý Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào có một vị trí quan trọng chịu sự tác độngcủa các chất ĐHSTTV (Torry và ctv, 1981) Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài

xuất proto H”, pH thấp hoạt hóa các enzim tác động nới lỏng vách tế bao và enzime tônghợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình dan nở tế bào (Roger Prat, 1993) Auxin

hoạt hóa sự tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản

sự phân giải chúng (Grodzinxki và Grodzinxki, 1981).

onic: eae:

N N H

Hình 1.8 Cấu trúc của benzyl amino purine (BAP)

Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và ctv, 1969; Mai Trần

Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyền hóa acid nucleic và protein (Vũ

Văn Vụ và ctv, 1993).

Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nởhoa, Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinhtrưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu năm

(Nester và ctv, 1985; Taiz và ctv, 1991).

Cytokinin kích thích sự tổng hop mới enzyme (Ribulozo - 1,5 - biphosphat

cacboxylase/oxygenase) hoặc ở mức sao chép (làm tang hoạt tinh ARN - polymerase)

hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) Ảnh hưởng của cytokinin, thấy rõ khi

phối hợp sử dụng voi auxin Skoog va ctv (1948) ghi nhận lượng cytokinin cao có tácdụng kích thích sự tạo chéi, đồng thời ức chế sự phân hóa tạo re.

Cytokinin còn tác dụng lên một số khâu trong cơ chế điều hòa sinh tổng hợpprotein trong tế bảo Về mặt này thì cytokinin vừa có tác dụng kích thích việc tong hợpARN, vừa có tác dụng hoạt hóa ARNm Từ đó mà ảnh hưởng đến sự tông hợp protein

cần thiết cho sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976)

1.2.9 Thành phần khoáng trong môi trường nuôi cấy

Một số tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần muối khoáng trong môi

trường trên sự phát triển của những chdi va cho phép kết luận như sau:

Theo Flamme và Boesman (1977) “Môi trường MS (1962) thích hợp cho sự phát

triển của chồi hơn môi trường Knudson C (1946)”

Theo Reisiger và ctv (1976) “Môi trường Knop tốt hơn môi trường Knudson C”.Tuy nhiên rất khó so sánh các môi trường vì sự sử dung chất hữu cơ rất đa dang

- Ảnh hưởng trực tiếp của pH:

Sự thay đôi pH khỏi giới hạn trung tính thường làm thay đổi mạnh quá trình ngậmnước của keo nguyên sinh cũng như khả năng hấp thu và phản hấp thu của các ion.Trong một số trường hợp, pH thay đổi có ảnh hưởng tới tốc độ xâm nhập của các ionvào cây Ví dụ khi pH giảm thấp thường làm tăng cường sự xâm nhập của các anion và

ngược lại khi pH tăng thì sự xâm nhập của các cation lại tăng lên.

Trong môi trường acid yếu, thi khả năng phân ly gốc cacboxyl bị ức chế và

protein tích điện dương (+), do đó mà khả năng hút anion tăng lên Ngược lại, trong môi

trường kiểm yếu khả năng phân ly của gốc amin bị ức chế, protein tích điện âm (-), trong

trường hợp này thì khả năng hút cation lại tăng lên.

- Ảnh hưởng gián tiếp của pH:

Ảnh hưởng gián tiếp của pH đến hoạt động hấp thụ chất khoảng của cây chủ yếu

là thông qua môi trường Ví dụ pH có ảnh hưởng rất lớn tới độ hòa tan của nhiều chất

trong môi trường Ở pH thấp thì Al được giải phóng nhiều sẽ gây độc cho cây, hiệu lựccủa phospho cũng bi giảm thấp, mặt khác độ hòa tan của Ca, Mg, Mn, Cu và Zn lại kémlàm ảnh hưởng đến hoạt động hấp thu của cây

Tác dụng của pH còn phụ thuộc khá nhiều vào sự có mặt của các ion khác trongdung dịch mà chủ yếu là ion Ca?” đây là một con đối kháng mạnh của H” va của một sốkim loại nặng khác Thường có Ca”” thì cây chịu được pH tương đối thấp

1.2.10 Nước dừa trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Công bồ đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek

và ctv (Van Overbeek và ctv, 1942) Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi

trường nuôi cây mô, tê bảo thực vật đã được nhiêu tác giả ghi nhận.

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất

kích thích sinh trưởng (George, 1996) Nước đừa đã được sử dụng dé kích thích phan

hóa và nhân nhanh choi ở nhiêu loai cây.

Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng

Một lít nước dừa có 40 g glucid, 2 - 3 g acid amin, 4 g chất khoáng (48 meqkalium, 2 meq natrium, 45 meq clor, 7 meq calcium, 6 meq magie và các yếu tố vilượng như sat, mangan, lithium), vitamin, hau như không có lipid và có rat ít sinh tố.

Nước dừa thường được lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc dé sử dụng tươi

hoặc sau bảo quản Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chaisau chế biến và bảo quản Thông thường nước dừa được xử lý đề loại trừ các protein,sau đó được lọc qua màng lọc dé khử trùng trước khi bảo quản lạnh

Tôn dư protein trong nước đừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của môhoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thé dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chatcặn có thé được lọc bỏ hoặc dé lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn Nước dừa thườngđược sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20%

1.2.11 Phương pháp nhân giống in vitro lan hồ điệp

Nhân giống in vitro bằng nuôi cấy đỉnh sinh trướng

Công cụ chủ lực của nhân giống hiện nay là tạo dòng từ “đỉnh sinh trưởng” hay

“điểm tăng trưởng” Cây giống tao ra theo phương pháp này gọi là cây tạo dong(cloning) Quá trình tạo dòng làm giảm các đột biến bat lợi của phương pháp nhân giốngtruyền thống Do đó tạo nên được những quan thé cây con đồng tính trạng, có sự tăng

trưởng và chất lượng hoa đồng đều Quy trình tạo dòng cũng đảm bảo sự ổn định về

màu sắc và sự pha trộn trên các cánh hoa Tuy nhiên đối với lan hồ điệp phương phápnày thực hiện rất khó thành công, đỉnh sinh trưởng quá nhỏ bé nên rất khó lấy, khôngthê tái sinh hoặc chết đi qua khử trùng

Nhân giống in vitro bằng nuôi cấy phát hoa

Phalaenopsis là loại lan đơn thân, thân ngắn và mỗi cây cho một đỉnh sinh trưởngnên dé có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban dau làm tăng chi phí quá trình

nuôi cấy Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới thường

dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa lan hồ điệp có chứa các mắt ngủ chưaphân hóa, có bề mặt nhẫn bóng dé khử trùng, tỷ lệ thành công cao mà vẫn tạo được dòng

cây ôn định về di truyén.