Khóa luận tốt nghiệp Sinh học: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn Lactic phân lập từ các thực phẩm lên men

Sự sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào nhiều yếulo: ® Nhiệt độ : ảnh hưởng rat lớn đến sinh lý tế bào, nói chung vi khuẩn lactic có biên độ nhiệt từ 10 — 30°C được p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM TP HỒ CHÍ MINH

LỜI CÁM ON

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thanh Thủy _ cán

bộ giảng dạy bộ môn vi sinh trường đại học Sư Phạm TP_ HCM đã tận

tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện để tài

Xin cảm ơn các thầy cô phòng thí nghiệm vi sinh_ sinh hóa _ sinh lí

thực đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt dé tài

Chân thành cảm ơn các bạn cùng lớp đã giúp đỡ và động viên tôi

trong quá trình học tập.

Sinh viên

Trần thị Hồng Vân

ÔNG VAN

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Lên men lactic được loài người biết đến từ rất lâu Khi mà vốn hiểu biết

còn rất sơ khai, con người đã làm được diéu mà chính họ không ngờ tới là ứng dung quá trình lên men lactic để chế biến và bảo quản thực phẩm cho chính mình Ngày nay trên thế giới các sản phẩm lên men của quá trình này đã có mặt

ở khắp mọi nơi Ngay từ năm 1908, ở các nước phương Tây người ta đã biết sản

xuất phomat, sữa chua bang lên men lactic Ở Ấn Độ người ta sử dụng hạt ngũ

cốc lên men lactic làm nguồn thức an chính trong ngày Longanisa( Philippines).

Muson (Thái Lan ) và tôm chua (Việt Nam ) là những sản phẩm được lên men từ

thịt Kim chi, món ăn truyền thong của người Hàn Quốc, Takuan Zuke (Nhật ).

dưa, cà, hành muối, món ăn qucn thuộc của người Việt Nam đều là những sản

phẩm muối chua từ các loại rau, củ, quả

Nhiều nghiên cứu cho thấy ring, lên men lactic ngoài tác dụng bảo quản thực phẩm còn làm tăng giá trị dinh dưỡng, cắm quan của sản phẩm, nâng cao sức

khỏe cho người dùng Không phải ngẫu nhiên mà Metchnikoff nhà bác học vĩ đại

người Nga đã cho rằng sữa chua có tác dụng trị bệnh đường ruột và kéo dài tuổi

tho

Việt Nam là một nước nông nghiệp nhiệt đới nên nguồn nông sản rất giàu

vẻ chủng loại và déi dao về số lượng, là tiền để thuận lợi cho sự phat triển của

công nghệ chế biến thực phẩm Thực tế, nhiều sản phẩm lên men còn sản xuất ở

qui mô nhỏ, thủ công nên chưa đáp ứng được nhu cẩu ngày càng cao của người

dùng vé chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm

Để góp phần cải tiến qui trình công nghệ nhằm nâng cao giá trị toàn diện của sản phẩm, việc tuyển chọn và nghiên cứu các chủng men giống là việc làm

hết sức cần thiết trong giai đoạn hiện nay Bởi lẽ hiệu suất của một qui trình công

nghệ nếu không kể đến trang thiết bị lên men thì giống vi sinh vật đóng một vai

trò quyết định Việc xác định chủng giống phù hợp với qui trình lên men sẽ thúc

đẩy hiệu quả lên men cao, chất lượng sản phẩm tốt, rút ngắn thời gian và cải

thiên chất lượng sản phẩm ban đầu Vì lẽ đó chúng tôi thực hiện đẻ tài : "Nghiên

cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ thực

phẩm lên men” Hy vọng kết quả thu được sẽ góp phần nhỏ bé của mình vào mục

tiều công nghiệp hóa các quá trình lên men truyền thống hiện nay.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HỒNG VAN

PHAN II: TONG QUAN TÀI LIEU

1 Sơ lược về vi khuẩn lactic :

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobateriaceae, Gồm các dang vikhuẩn hình cẩu và hình que Tuy hình thái khác nhau nhưng chúng cùng

thống nhất về các đặc điểm sinh lý sinh hoá.

Vi khuẩn lactic không chuyển động, không hình thành bào tử,tuyệt đại đa số là gram dương Trong tế bào không chứa xitocrom và

catalaza, tuy nhiên chúng có thể sinh trưởng được khi có mặt oxy không khí

nhờ có peroxydaza giúp phân giải HaO› thành Hạ và O; do đó người ta gọi

nhóm vi sinh vật này là những vi sinh vật ky khí không bắt buộc

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic rất phức tạp Không một loài nào có khả năng phát triển được trên môi trường thuần khiết chứa khoáng,

glucose, NHy Da số chúng cần hàng loạt vitamin: lactoflavin, thiamin, acid

pantothenic, acid niconitic, acid folic, biotin và các acid amin khác Vì vậy

chúng thường được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa mộtlượng tương đối lớn nấm men, nước chiết cà chua, thậm chí máu Một số

chủng vi khuẩn lactic khi sinh trưởng trên môi trường chứa máu có thé tạo thành các cytochrom, thậm chí tiến hành cả quá trình photphorin hóa chuỗi

hô hấp

Sự sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào nhiều yếulo:

® Nhiệt độ : ảnh hưởng rat lớn đến sinh lý tế bào, nói chung vi

khuẩn lactic có biên độ nhiệt từ 10 — 30°C được phân thành hai

nhóm là nhóm ưa ẩm và ưa nhiệt,

" pH: tùy từng loài vi khuẩn lactic mà pH có thể dao động trong

khoảng 4,5 -6,8.

® Chất ức chế : chất kháng sinh và nông độ muối cao ức chế sự sinh

trưởng của nhóm vi khuẩn lactic Nông độ muối cao nhất cho sự

sinh trưởng là 6,5%.

® Độ ẩm : nước là yếu tố rất cần thiết cho sự hoạt động của vi, khi

thiếu nước chúng sẽ không tổn tại.

® Oxy: vi khuẩn lactic thuộc loài ky khí không bắt buộc nên có mat

của oxy không gây độc cho tế bào, tuy nhiên càng thiếu oxy thì sự

xinh trưởng sẽ thuận lợi

II Đặc điểm của quá trình lên men lactic;

Lên men lactic là một trong những quá trình sinh hóa đơn giản, trong

đó diễn ra sự chuyển hóa kị khí đường thành acid lactic dưới tác động của

mot cnzim, enzim này chỉ có trong tế bào vi khuẩn lactic

Tuy thuộc vào sản phẩm cuối cùng được hình thành, người ta chia quá

trình lên men lactic gồm hai kiểu

1 1 Lên men lactic đông hình :

Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic chiếm 90

-98%.

Sơ đồ tổng quát của quá trình lên men đồng hình :

C,H¡:O, — 2CH;CHOHCOOH + 75,6 KJ

Quá trình được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lên men latic đồng hình

thuộc giếng Streptococcus và Lactobactcrium, Các đại diện thường gặp [a

:Strcptococcus lactic, Streptococcus crcmoris, Streptococcus thermophilus,

Lactobacterium bulgaricum Lactobactcrium platarum, Lactobacterium

acidophilum, Lactobacterium casc1,

Các vi khuẩn lactic déng hình tiến hành phân giải glucose theo con

đường EMP, tạo sản phẩm chính là acid lactic trải qua hàng loạt giai đoạn

trung gian với sự tham gia của enzim tương ứng Trong tế bào của nhóm vi

khuẩn này chứa các men cẩn thiết cho sự phân giải kể cả adolaza Con

đường Fructozo 1,6 điphotphat được diễn ra tới puruvaL Nhờ

lactathydrogenaza mà pyruvat được khử thành acid lactic Khi đó NAOH;

sinh ra trong quá trình đường phân do sự tách hydro của glyrcrinaldchyt_ 3

photphat được chuyển trở lại thành NAD, Lactatdchydrogenaza xúc tác cho

môi sự khử pyruvat đặc hiệu lập thể

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN T NG VAN

qua các phan ứng mở đầu con đường pentozophotphat oxy hóa Tiếp sau đó

là phản ứng của photphoketolaza đặc trưng cho vi khuẩn lactic dị hình,phân giải pentoza thành glyccrinaldchyt_3 photphat và acetyl_ photphat,

Sự oxy hoá trioza tới axit lactic xảy ra như ở lên men lactic đồng hình qua

các phản ứng đường phân Sự phân hủy pentoza từ acetylphotphat sẽ tạo

Sơ đổ lên men lactic dị hình

LH Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

HHI.1:Thông khí :

Trong quá trình nuôi cấy các chủng vi sinh vật hiếu khí người ta tiến

hành cung cấp một lượng lớn các khí vô trùng Lên men công nghiệp

thường thường sử dụng thiết bị lên men có hệ thống khuấy đảo và sục khí

Còn trong điều kiện phòng thí nghiệm, tiến hành nuôi cấy lắc để cung cấp

oxy đầy đủ tùỳ theo nhu cầu của từng chúng

Vị khuẩn lactic là loài ki khí không bắt buộc do đó việc cung cấp oxy

cho quá trình lên men là không cần thiết

111.2 Niiệt độ :

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển

của vị sinh vật và hiệu quả lên men Quá trình lên men luôn có sự tỏa nhiệt

làm cho nhiệt độ trong thiết bị lên men có xu hướng gia tăng quá ngưỡng

nhiệt độ thích hợp Nhiệt xuất hiện trong thiết bị lên men liên quan đến sự

LUẬN VĂN TỐT NG TRAN T NG VA

đồng hóa các chất dinh dưỡng của chủng nuôi cấy Sự gia tăng nhiệt độ xảy

ra trước khi quá trình lên men đạt đến pha phát triển ổn định và sau đó sẽ idm xuống Do đó phải thường xuyên theo đối và điểu chỉnh nhiệt độ phù

hợp với quá trình lên men, Thông thường để điểu hòa nhiệt người ta trang

bị hệ thống làm nóng và làm nguội ở thiết bị lên men.

LH.3 pH:

Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một gid trị pH nhất định của môi

trường nuôi cấy Nhưng trong quá trình lên men chúng tạo ra các sản phẩmtrao đổi chất có tính acid hay kiểm khiến cho pH của môi trường không còn

thích hợp cho hoạt động của nhóm vi sinh vật này nữa Do đó việc chủ động

điều chỉnh pH của môi trường là điều rất cần thiết khi thực hiên quá trình

lên men.

HI.4 Ảnh lường của các chất ức chế :

Hiệu suất của quá trình lên men trước tiên phụ thuộc vào năng suất

hoạt động của vi sinh vật Trong quá trình lên men việc cung cấp các chất

dinh dưỡng là điểu cần thiết, tuy nhiên nếu lượng này lớn hơn so với nhu

cầu có thể làm ức chế sự hoạt động của nhóm vi sinh vật ức chế sự lên

men.

IV.Thành phần va đặc điểm của nhóm vi khuẩn lactic thường gặp

trong lên men thực phẩm :

Có nhiều loài vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình lên men thực

phẩm nhưng chủ yếu chúng thuộc các chi Streptococcus, Lactobacillus,

Peptidococcus.

® Streptococcus :

Tế bao hình cầu hoặc hình trứng, ít khi kéo dài thành hình que,

thường xếp thành chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài Ở một số loài, có thể thấy

được vỏ nhầy trong điều kiện đặc biệt nào đó Không di động ngoại trừ một

vài chủng thuộc nhóm Entercoccus Hydratcacbon và rượu đa chức cần thiết

cho sự phát triển của nhóm này trong môi trường nhân tạo Các chủng tạo

khuẩn lạc có bể mặt nhăn và nhỏ thường có khuynh hướng lắng nhanh

xuống đáy môi trường Ngược lại chủng có bể mặt khuẩn lạc phẳng khi pháttriển thường làm đục môi trường đồng đều, chỉ một ít lắng xuống đáy Bêmặt khuẩn lạc trong cùng một loại cũng thay đổi từ nhăn tới phẳng hoặc

nhay ướt Lên men các hydratcacbon tao sắn phẩm cuối cùng là acid lactic.

LUẬN VĂN TỐT NG TRAN ONG VAN

Catalaza âm tính, phát triển được trong môi trường có oxygen, Nhu cau

dinh dưỡng rất phức tạp đòi hỏi phải có nhiều vitamin và acid amin.

® Chi Lactobacillus :

Tế bào hình que thẳng hoặc cong, thường ở dạng đơn lẽ hoặc tạo

thành chuỗi Chúng không di động Gram dương Lên men hydratcacbon

tạo sản phẩm cuối cùng là acid lactic hoặc một số sản phẩm phụ như acid

formic, acid acetic, COx Vi hiếu khí đến ky khí không bắt buộc

® Chi Peptidococcus :

Tế bào hình câu thường ở dạng đơn, đôi, tcưa đôi khi xếp thành

chuỗi ngắn, có thể xếp thành chụm 8 tế bào nhưng hiếm thấy Vi hiếu khí,

phát triển kém trên bể mặt môi trường, Lên men hydratcacbon tạo sảnphẩm cuối cùng là acid lactic,

IV.I vị nm men sữa:

Streptococcus lactic ;

Tế bào hình bầu dục, kích thước (1 -l,5)x( 0,5 -l ) micromet tổn

tại thành từng đôi hay chuỗi ngắn Có khả năng lên men sữa, Nhiệt độ thích

hợp cho sự phát triển là 30 - 35C Làm đông tụ sửa sau 12 gid, Độ acid

đao động từ 110 - 120°T Lên men glucose, mantose, raffinose, lactose.

galactose, dextrin

Streptococcus cremoris :

Tế bao hình cầu hoặc hình trứng gần giống như S lactic nhưng kích

thước nhỏ hơn, kích thước trung bình 0,6 - 0,7 micromet Thường tìm thấy

trong sữa dưới dạng chuỗi dài hoặc gần đôi Gram dương Không di động

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 20 - 25°C, Làm đông tụ sữa sau 12 giờ Lam cho sữa có độ chua thấp hơn 110 -115°T, Không phát triển ở môi

trường chứa NaCl 4% Lên men các loại đường glucosc, mantose, lactose,

galactose

Streptococcus thermophilus :

Tế bao hình cau hoặc hình trứng Tn tại thành từng đôi hay chuỗi

dài Gram đương, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 40 - 45°C, phát

triển được ở 50°C nhưng không phát triển ở 53°C và dưới 20°C Không phát

triển được trong môi trường chứa NaCl 2%, Lên men các loại đường

glucose, fructose, lactose và succlose, Ít lên men pentose, raflïnose Không

LUẬN VĂN TỐT NGHI "RAN ¡ NG VẬN

lên men tetralose, mantose, inulin, glycerin, manitol, sorbitol Nhận biết

loài này dựa vào đặc tính phát triển ở nhiệt độ cao và nhạy cảm với NaCl,

Lactobacillus acidophicus:

Tế bào hình que, kích thước (0,6 - 0,9 ) x (l5 - 6 ) micromet,

Chúng thường đứng riêng rẽ, kết đôi hay tạo thành chuỗi ngắn Khi còn

non gram dương về già chuyển gram âm, có thể di động được Phát triển

tốt ở nhiệt độ 37 - 40°C Tích tụ 2 % acid lactic trong môi trường Lên men

các loại đường glucose, mantosc, saccharosc ,lactosc

Lactobacillus § _

Tế bao hình que dai, thường xếp thành chuỗi gram dương Nhiệt độ

thích hợp cho sự phát triển là 40 — 48°C Trong môi trường lên men tạo

3.5% acid lactic, độ acid tạo ra từ 300 -450°T Làm đông tụ sữa từ 3 - 6

giờ Lên men glucose, galactose ,lactosc Thường không lên men sucrose, mantos, fructose khi mới được phân lập

Lactobacillus casein :

Tế bao hình que kích thước không lớn (08 - 0,9) x (2- 6 )micromet, Nhiệt độ thích hợp cho sự phat triển là 30 — 35 °C, Có thể phát

triển ở 22 -55°C Chịu đựng được độ acid Lên men tốt các loại đường

glucose, lactosse, mantose Có thể phân hủy cazein đến acid amin,

IV.2 Các vi khuẩn trong lên men rau quả :

Lactobacillus plantarum:

Tế bao hình que , kích thước (0,7 -1, 0 ) x (3,0 - 8,5 ) micromet Tén

tại ở dạng đơn lẽ hay kết thành chuỗi ngắn, tế bào ở cuối chuỗi hơi tròn.

Gram dương Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30°C không phát triển

được ở nhiệt độ dưới 10°C và trên 40°C Phát triển được ở môi trường chứa

NaCl 5,5% Lên men tích tụ lượng acid lactic trong môi trường là 1,2%.

Lên men đồng hình các loại đường glucose, fructose, mantose, galactose,

lactose, mannose, Lên men đường mantose tạo acid lactic và acid acetic

Lên men yếu các loại đường sorbitol, manitol,dextrin, glycerol, xylose

Không lên men tinh bột va inulin,

Leuconostoc mensenteroides:

Tế bao hình cầu, đường kính 0,9 - 1,2 micromet, Tén tại thành đôi,

chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài Gram dương Nhiệt độ thích hợp cho sự phát

triển là 21- 25 °C Lên men được các loại đường glucosc,Írutosc.galactose.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HONG VẬN

manose, xylose, arabinose,sucrose ,lactose, raffinose, salicin , rhamnose và

glycerol Đặc điểm phân biệt của chủng này là sinh chất nhẩy trong môi

trường dịch thể sucrose Có khả năng tạo chất thơm, chịu được néng đô

đường và muối cao.

Tế bào hình que, hai đầu tròn Tổn tại thành từng đôi, chuỗi ngắn hay

chuỗi dài (thường gặp chúng ở dạng chuỗi), Lên men các loại đường tạo

thành acid lactic, acid acetic, rượu êtylic và CO Lên men đường

saccharose mạnh hơn đường lactose Acid lactic tích tụ trong môi trường

lên men tới 1,2% Ngoài ra chúng còn có khả năng tao chất thơm làm cho

san phẩm có mùi thơm để chịu.

V Vai trò của vi khuẩn lactic:

V, fri

V.1.1 Công nghiệp sản suất acid lactic:

Công nghiệp sản suất acid lactic đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 19,

với vi khuẩn lactic là đối tượng được sử dụng để lên men thu nhận acid

lactic Loài Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus leichmanii,

Lactobacillus delbrucki ưu tiên được sử dụng Đó là những loài vi khuẩn

Lactic đồng hình có nhiệt độ tối ưu vào khoảng 45- 48°C, có ưu thế trong

phòng ngừa lây nhiễm trong lên men

Nguyên liệu dùng trong sản suất acid lactic là đường, ri đường củ cải,

dịch thủy phân bột, dich thủy phân inulin Cũng có thé sử dụng những

nguyên liệu thô chứa tính bột nhưng phải qua giai đoạn xử lý bằng enzim

thủy phân tinh bột.

Quá trình lên men thưởng được thực hiện ở các điều kiện:

= Nông độ đường trong môi trường: 10-15%

" Lượng CaCO; được sử dụng: 10%

" Mam đại mach : 0.375%

* Photphat amon: (),25%

Acid lactic được sử dung nhiều trong công nghiệp thuộc da, công

nghiệp dệt và công nghiệp đổ nhựa Nhu cẩu vé acid lactic trên phạm vitoàn thế giới đạt 30000 tấn/năm Khoảng 30% nhu cầu này được đáp ứng

nhờ acid lactic racemic sản xuất bằng con đường tổng hợp.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HÔNG VẬN

® Ché biến và bảo quản rau quả:

Người ta phối hợp cả qúa trình lên men lactic đồng hình và dị hình

vào trong qúa trình chế biến và bảo quản rau quả, Trong môi trường có

nồng độ mối, đường thích hợp vi khuẩn lactic phát triển mạnh sinh ra một

lương lớn acid lactic, làm pH môi trường ngã vé acid ức chế các vi khuẩn

gây thối rau quả Sản phẩm tạo thành sẽ có vị mặn, chua, thơm, kích thích

ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa đồng thời bảo quản được lên men rau quả trong

tự nhiên.

Trong sản suất công nghiệp người ta sử dụng chủng giống thuần

khiết Nhân giống trong môi trường nước ép rau cải sau đó cho lên men,cho hiệu quả lên men cao, chất lượng sắn phẩm tốt, nâng cao năng suất qui

mô công nghiệp.

* Lén men lactic trong ngành sữa:

Vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vat quan trọng nhất đối với sữa

Chúng có tác dụng lớn trong việc bảo quản cũng như chế biến các sản

phẩm từ sữa (sữa chua, phomat)

Sữa chua là sản phẩm của sự lên men sữa lỏng dưới tác động của

nhiều vi khuẩn lactic khác nhau Trong quá trình lên men, glucose trong

môi trường được chuyển hóa thành acid lactic Lượng acid được tạo ra cao

nên protein sữa tiếp tục được phân giải tạo pepton, acid amin Một số sản

phẩm phụ như diacetin, các acid bay hơi khác hoặc estc được hình thành

Nâng cao giá trị dinh dưỡng của sữa, tạo hương vị thơm ngon kích thích tiêu

hóa đồng thời bảo quản sữa khỏi bị hư hỏng

Phomat là sản phẩm thu được từ sữa đông bằng cách loại bỏ dịchđường sữa và làm chín cục vón khi có mặt hệ vi sinh vật đặc biệt là vi

khuẩn lactic tham gia đắc lực vào quá trình lên men tạo sản phẩm này.

Người ta chế biến và bảo quản các sản phẩm từ sữa bằng phương

pháp tự nhiên hoặc phương pháp cấy giống thuần khiết Sữa đựoc lên men

tự nhiên nhờ vào hệ vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên (từ không khí, từ tay

người, từ dụng cụ vắt sữa ) Vi khuẩn sẽ nhanh chóng phát triển Đầu tiên

vị khuẩn gây thối phân giải một ít protein tạo điểu kiện cho nhóm vi khuẩn

lactic phát triển, Khi phát triển, chúng tích lũy dẫn acid lactic ngăn can sự

phát triển của nhóm vi khuẩn có hại và ngăn cắn cả sự phát triển của chúngkhi lượng acid lactic được tạo ra khá nhiều

LÔ

LUẬN VAN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HỒNG VAN

Trong điều kiện sản suất lớn: các giống vi khuẩn thuần khiết có khả

năng lên men lactic mạnh được cấy vào sau khi đã khử trùng môi trường

Để tạo hương vị thơm ngon cho sữa người ta cấy những vi khuẩn có khả

năng tổng hợp diacetin vào

Ngoài việc ứng dụng vi khuẩn lactic trong việc chế biến bảo quảnrau quả và sữa chúng còn được sử dụng phổ biến cho việc lên men sản suất

nem chua, tôm chua chế biến các loại thủy hải sản Một số chủng được

ứng dụng lên men sản suất nước uống,

Cơ cấu lý hoá của đất ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến năng

xuất và chất lượng mùa mang Hệ thống đất hữu hiệu nhất đó là kết qủa của

việc tăng cường thành phần vi sinh vật lên men và vi sinh vật tổng hợp ở

trong đất Nhóm vi khuẩn lactic trong hệ vi sinh vật lên men đã góp phan

vào việc duy trì, cải tạo chất lượng và khả năng sản xuất của đất.

Trong đất vi khuẩn lactic sử dụng đường và các nguồn hyđratcacbon

được tạo ra bởi các nhóm vi sinh vật khác để tiến hành lên men tạo acid

lactic, Lượng acic sinh ra tạo pH thích hợp cho sự hoạt động của nhóm sinh

vật có lợi trong đất đặc biệt là hệ vi sinh vật lên men đường Tăng cường

nhanh sự phân giải các chất hữu cơ Tham gia vào quá trình chuyển hoá các

chất khó phân giải như polisaccharit (tinh bột), hemicellulose (xylan).

Vị khuẩn lactic góp phan vào việc tiêu diệt các sinh vật gây hai cho

cây trồng Chúng có thể ức chế sự phát triển của nấm Fusaricum_ một loại

nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Tham gia vào việc cải thiện

môi trường đất bằng cách lên men tạo ra mùi thơm dễ chịu cho đất.

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong việc ủ chua thức ăn

dùng trong chan nuôi gia súc Nhờ ủ chua mà thức ăn có thể giữ được khá

lâu ở trạng thái tươi, không những sẵn phẩm không bị hao hụt mà còn được

tăng cường hàm lượng dinh dưỡng Bởi lẽ trong quá trình lên men ngoài

lượng acid lactic được tao thang chúng còn tạo ra một số sản phẩm khác có

giá trị như vitamin, chất thơm, chất kháng sinh (nizin, dilocaxen ) TY đó

góp phan nâng cao hiệu quả trong chan nuôi.

V.3 Trong y học:

Acid lactic sản phẩm của quá trình lên men lactic được sử dụng rộngrãi trong việc điều chế một số loại thuốc sát trùng, một số loại thuốc dưới

dạng muối canxi,

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HONG VAN

Trong thực phẩm, một số chủng được sử dụng ở dạng sống trong

thuốc giúp cho sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột như L.acidophillus

trong “ men tiêu hóa sống" Chúng có thể tiết ra một số chất kháng ngăn

can sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột chẳng hạn Ecoli,

Samonella, Clostridium như tiết ra chất kháng với enterotoxin_ độc tố gây

bệnh của những vi khuẩn trên,

Vi khuẩn lactic chúng còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của cơ thé

hằng cách:

® Kích thích sản suất inteferon.

* Hoạt hoá lympho bào B,

* Lam thay đổi B-gluconidase Azreductase là các enzim xúc tác qua

trình chuyển hoá procarcinogen thành carcinogen vì thế làm chậm và

ngăn chặn sự tạo bướu carcinoma ở ruột già.

VI Một số phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic:

Có nhiều phương pháp bảo quản giống Tùy vào điều kiện cụ thể mà

người ta tiến hành những phương pháp khác nhau

VII Phương ph trên !

_ Đây là phương pháp thường được dùng nhất trong phòng thí nghiệm.

Giống được nuôi cấy trong tủ ấm, chọn những ống giống mọc tốt tiến hành

kiểm tra các đặc tính của chúng Sau đó bảo quản giống ở nhiệt độ 3-5°C

hoặc thấp hơn Cay truyền sau | đến 2 tháng

VỊ.2 Phương pháp bảo quản giống trên môi trưởng thạch có lớp

dau khoáng:

Phương pháp này phổ biến và tiện lợi nhắm khắc phục tình trạng khô

khoáng của môi trường, làm ngăn cách mặt thạch với lớp không khí bằng

dầu khoáng( parafin, vazdlin ).

Chủng được bảo quản được nuôi cấy cho phát triển tốt trên môi

trường thạch có chất dinh dưỡng thích hợp Đổ một lớp mỏng parafin đã

tiệt trùng và làm nguội lên mặt thạch (dày 1-2 cm) Gắn kín nút bông bằng

parafin Giữ giống ở nhiệt độ phòng hoặc 4-7°C.

Kawono đã thử bảo quản vi khuẩn lactic trên môi trường thạch

nghiêng trong parafin lỏng Ong đã thành công trong việv giữ 53 trong 62

ching trong 2 năm, 35 trong 47 chủng trong 4 năm.

12

LUẬN VĂN TỐT NG ‘RAN THỊ HONG VAN

Hạt ngũ cốc ( lúa, bobo) được rửa sạch, nấu cho hat vừa nứt và để ráo

nước Cho chúng vào ống nghiệm phủ bằng một lớp bông thấm nước Cấy

chủng vi sinh vật lên lớp bông cho mọc thật dày Giữ mẫu ở nhiệt độ

15-30C.

Hunt và các cộng sự đã thử bảo quai vi khuẩn L acidophillus trên

hạt gốm các nhà nghiên cứu đã bảo quản giống được trong 10 tháng.

VI 4.Phuong pháp lạnh: đông:

Vị sinh vật cần bảo quản được trộn với chất nhũ hoá Chất nhũ hoá

có thể là glycerin, huyết thanh ngựa hình thường không có chất bảo quản, dung dịch saccharose 10% Cho 1-2% nhũ dịch giống vào mỗi ống Đặt các ống giống vào làm lạnh từ từ đến -20°C hoặc thấp hơn nhưng giữ tốc đô

làm lạnh không lớn hơn 1-2 phút Cần qui định thời gian cấy truyền.

Bằng phương pháp lạnh đông ở -20°% có thể giữ giống L

acidophillus ít nhất một năm vẫn còn khả năng sống là 71,86%, vẫn còn

khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường MRS và làm đông tụ sữa sau 12

giờ.

VLS Phương pháp đông khô:

Bảo quản vi khuẩn lactic tốt nhất là ở nhiệt độ đông khô (-80°C

hoặc

-120C) tuy nhiên chế độ bảo quản này khó được áp dụng rộng rãi bởi

điều kiện trang thiết bị kỹ thuật Thời gian bảo quản đến hàng chục năm.

Người ta tiến hành nuôi cấy chủng bảo quản đến pha logarit sau đó

trộn với chất bảo vệ Cấp các dịch huyén phù chứa vi sinh vật vào các ống

đông khô Đặt các ống giống vào làm lạnh đông trong chậu tuyết cabonic +

cồn ctylic trong 1-15 phút Đưa các ống giống này vào thiết bị đông khô.

Anthenissc đã dùng phương pháp này dé giữ Lactobacillus , công bố

giữ được trong 6 năm Bằng phương pháp này người ta cũng giữ được một

xố chủng trong thời gian dài với tỷ lệ sống sót là 92% ( Streptococcus).

13

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRẬN THỊ HÔNG VẬN

PHẦN III :VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu:

I 1:Nguồn phân lập:

* Yaourt hăng Vinamilk va foremost.

® Nước dưa cải va dưa giá muối chua

® Nước trái cây: dứa ,nho, cà chua, mang cầu, sữa chua lên men

Môi trường thử khả năng lên men đường:

Môi trường MRS nhưng thay thế glucose bằng các loại đường

khác:Eructose, Lactose Galactose Shacharose,Sorbitol,Manitol,Maltose

Môi trường khảo sát khả năng sống trong diéu kiện nồng độ

Bổ sung NaCl tạo nỗng độ muối khảo sát là 2%, 4%, 6,5%

© Môi trường nhân giống vi khuẩn lactic:

Môi trường MRS dịch thể : môi trường MRS nhưng không có agar

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ÔNG VẬN

“Cách pha:

Dùng đũa thủy tinh khuấy tan hết getian violet trong rượu

Tron dung dịch (1) và(2) rồi lọc trong.

Hóa KI trong 5 ml nước cất cho tan hết rồi cho lốt tinh thể

Bổ sung cho đủ 300 ml nước sau khi lốt tan hết

Mau phân lập là cơ chất dạng đặc ,rắn (nem chua):

Thực hiện cân một gram mẫu nghién nhỏ bằng cối sứ vô trùng rồi

chuyển toàn bộ mẫu vào ông nghiệm chứa 9 mi nươợc cất vô trùng Lắc thật

ky để mẫu được tan đều và ta có độ pha loãng của dịch huyền phù là 10°.

16

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 7, GY.

Dùng pipet vô trùng hút 1 mi dịch huyền phù này hòa vào ông nghiệm chứa

9ml nước cất vô trùng tiếp theo ta có nồng độ pha loãng của dịch huyền phù

là 10° Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến khi đạt được độ pha loãng cẩn

thiết và thích hợp để sau khi cấy khuẩn lạc mọc lên không quá mau.

Mẫu phân lập là cơ chất dạng lỏng hay dạng sệt (tôm chua, yaourt,

nước dưa chua, nước trái cây lên men):

Dùng ống hút vô trùng hút | ml dịch mẫu chuyển sang ống nghiệm

chứa 9 ml nước cất vô trùng ta có độ pha loãng 10”, Lắc thật kỳ để mẫu tan

đều rồi tiếp tục pha loãng mẫu tương tự như trên cho đến khi đạt được độ

pha loãng cần thiết (10°, 10°, 107.)

11.1.2 Gieo cấy trên thạc Ít đĩa:

Chuẩn bị các dia petri chứa sin môi trường phân lập đã vô trùng

Dùng pipét vô trùng lấy 0,1 ml mẫu ở độ pha loãng thích hợp nhỏ vào bé

mặt đĩa.

Dùng que gat vô rùng dàn đểu lượng mẫu lên khắp bể mặt môi trường Mỗi mẫu cấy ba đĩa Cấy xong bao gói các đĩa petri lại, để tủ ấm

30'C tưong 2-3 ngày Sau đó quan sát trên môi trường và phân biệt các

khuẩn lạc khác nhau vé màu sắc, hình dạng, kích thước, tính chất bể mặt.

Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ cấy sang môi trường cacbonat_agar.

11.1.3 Sơ chọn giống căn cứ vào khả năng sinh acid của các chúng:

* Nguyên tắc :

Dựa vào khả năng làm tan CaCO, của acid, người ta xác định khả

năng sinh acid của các chủng mới phân lập bằng sự xuất hiện các vòng

phân giải (trong suốt) xung quanh khuẩn lạc khi cấy chúng trên môi trường

cacbonal_agar

* Phuon

Chuẩn bị dia petri có môi trường cacbonat_agar đã vô trùng Chon

các khuẩn lạc khác biệt và tách rời nhau nói trên để cấy sang môi trường đã

chuẩn bị Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày Sau đó lấy ra

quan sát sự xuất hiện của các vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn

lạc của một số chủng Kích thước vòng phân giải càng lớn chứng tỏ khả

năng sinh acid của các chủng càng nhiều Dùng thước đo đường kính vòng

phân giải của các chủng làm căn cứ để sơ tuyển.

17

‘RAN THỊ HONG VẬN

Từ các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO, vừa chọn , dùng que cấy

trích ly các khuẩn lạc nay vào ống nghiệm chứa 3-5 ml nước cất vô trùng.

Lắc thật kỹ để tế bào được tách ra riêng rẽ

Hút 0,1 ml dung dịch này nhỏ vào dia petri chứa môi trường MRS đặc

Dùng que gạt vô rùng dàn déu lượng dịch khắp mat thạch từ đĩa thứ nhất

sang đĩa thứ ba mà không bổ sung thêm dịch giống Nuôi trong tủ ấm ở

nhiệt độ 30°C trong 3 ngày.

Chọn các khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào riêng rẽ và đồng

nhất cấy chuyển sang thạch nghiêng

Tiếp tục kiểm tra sự thuần khiết của khuẩn lạc bằng cách làm tiêu

bản giọt ép ,nhuôm đơn, nhuộm gram để xác định hình dang, cách sắp xếp

tế bào và sự bắt màu gram.

1.1.5, Thử khả năng sinh acid lactic của các chiing:

Nguyén tắc:

Phenol có trong thốc thử uphenment khi phan ứng với acid lactic sẽ

làm thuốc thử đổi màu từ xanh dương đậm sang màu vàng Sự đổi màu

vàng càng đậm chứng tỏ lượng acid lactic sinh ra càng nhiều

Phương pháp:

_ Các chủng vi khuẩn đã được thuần khiết, dùng que cấy trích ly các

chủng này vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thé, nuôi cấy tinh ở nhiệt độ 30°C trong 3 ngày Sau đó đem ly tâm để tách tế bào vi

khuẩn, thu dich trong rồi thử với thuốc thử uphenment

Chuyển 3 ml dịch trong vào ống nghiệm đã chứa 2 mi thuốc thử

uphcnment Tiến hành đồng thời hai ống đối chứng :

Đốt chứng dương: 3ml acid lactic nguyên chất + 2 ml thuốc thử

Đối chứng âm :3ml môi trường MRS dịch thể không cấy vi khuẩn +2

ml thuốc thử,

VY oy cầu:

Quan sát sự đổi màu của thuốc thử và mức độ đổi màu đối với từng

chủng để chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng lên men lactic tốt nhất.

(8

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HỒNG VAN

Vị sinh vật khi phát triển trên bể mặt các môi trường đặc khác nhau

sẽ hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó.

Phượng pháp:

Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường MRS — agar vô trùng Dùng

que cấy đầu nhọn, thực hiện cấy ria chủng vi khuẩn phân lập được trên bể

mặt môi trường sao cho tạo được những khuẩn lạc tách rời nhau Nuôi ở

nhiệt độ 30°C trong 3 ngày.

Yêu cấu :

Quan sát và mô tả các đặc điểm của khuẩn lạc :

Hình dạng chung của khuẩn lạc : lớn ( kích thước ), nhỏ(kích thước),

nhỏ li ti , đồng đều

Màu sắc khuẩn lạc

11.2.2Déc điểm hinh thái tế bào trên môi MRS dich thể :

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể Cay

các chủng vi khuẩn vào các ống nghiệm Nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 18-24giờ Tiến hành làm các thí nghiệm sau :

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRẬN THỊ HÔNG VẬN

'Tiêu bản giọt treo :

* Dùng một lamen sạch và một phiến kính đặc biệt có phần lõm hình

tròn ở giữa

* Bôi vazơlin quanh phan löm của phiến kính

* Dùng que cấy lấy một giot dịch vi khuẩn đặt vào giữa lamen

* Thận trong úp ngược lamen lên phan lõm của phiến kính, sao cho

giọt dich vi khuẩn được treo lơ lửng trong phan lõm của phiến kính

* Bat tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi,Yêu cầu:

* Quan sát hình thái vi khuẩn

* Xác định sự chuyển động của vi khuẩn (có hay không chuyển

động).

Nhuộm đơn:

Phương pháp:

Tiến hành làm và cố định vết bôi các chủng vi khuẩn ri tiến hành

nhuộm thco trình tự sau:

* Đại tiêu bản lên cầu thủy tinh

® Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin, để yên từ 1-2 phút,

® Dùng hình xjt cho dòng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến khi nước chảy

Dựa trên klhả năng bắt màu của tế hào chất và màng tế bào với thuốc

nhudm tím kết tỉnh hình thành nên hai loại phức chất khác nhau:

20

LUẬN V, N P TRAN THỊ HONG VAN

* Loại phức chất thứ nhất :vẫn giữ nguyên màu sắc của thuốc nhuộm

nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn Vi sinh vật có phức chất này

thuộc loại gram dương.

“ Loại phức chất thứ hai: không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất

màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung.

Phượng pháp:

Làm tiêu bản và cố định vết bôi, sau đó tiến hành nhuộm như sau :

* Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi, Nhỏ thuốc nhuộm tím getian

lên trên trong | phút,

* Nhudm lugol trong | phút

* Nhỏ lên vết bôi rượu êtylic 95” trong 30 giây

* Rửa nước.

* Nhuộm bổ sung Fuchsin

* Rửa nước, dùng giấy thấm lau khô phía dưới lam kính, quan sát

® Vi sinh vật kj khí bắt bude chỉ phát triển ở đáy môi trường.

® Visinh vật hiếu khí chỉ phát triển ở lớp gần bể mặt môi trường.

® Vi sinh vật ki khí không bắt buộc sẽ phát triển doc theo độ day

môi trường.

2I

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HÔNG VẬN

Phương pháp:

Chuẩn bị các ống nghiệm thạch đứng chứa 10 ml môi trường MRS dịch

thể Cấy từng chủng vi khuẩn vào ống nghiệm bằng que cấy đầu nhọn theo

kiểu trích sâu Nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 3 ngày.

Nhận xét sự sinh trưởng của từng chủng vi khuẩn trong môi trường, Từ đó

xác định quan hệ của từng chủng vi khuẩn đối với Oxygen.

11.3.2: Thi nghiệm thử hogt tinh catalaza:

Nguyén tắc :

Vị khuẩn lactic là loài vi hiếu khí hoặc kj khí nên hệ enzim không có

catalaza là enzim oxy hóa HạO: thành HaO và O; để giải độc cho tế bào,

Do đó khi thử bằng HạO; sẽ không có khí bay ra Ngược lại đối với nhữngloài ví khuẩn hiếu khí trong tế bào có sự hiện diện của enzim catalaza do

đó sẽ tạo ra khí O; khi thử bằng H;Oz.

Phươn áp :

Chuẩn bị dung dịch muối sinh lý 0,85% trong ống nghiệm Cay từng

chủng vi khuẩn lactic vào và nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ Sau đó nhỏ

một lượng như nhau HO; vào ống nghiệm và ghi nhận kết quả

H.3.3, Quan hệ với nhiệt độ :

Nguyên tắc :

Mỗi nhóm vi sinh vật có một giới hạn nhiệt độ thích hợp cho sự sinh

trưởng phát triển Chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ thích hợp và bị ức chế không phát triển được ở nhiệt độ không thích hợp.

Phương pháp :

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể Cay

từng chủng vi khuẩn vào các ống nghiệm Nuôi ở các nhiệt độ : 20C 25

"Cc 30°, 35°C, 40°C, 45°, 50°C trong 4 ngày.

Yêu câu :

Quan sát mức độ sinh trưởng dựa vào khả năng làm đục, thay đổi

màu môi trường của từng chủng vị khuẩn ứng với mỗi nhiệt độ Dựa trên

các mức độ sau:

2

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRẬN THỊ HÔNG VẬN

- Không sinh trưởng ++ Sinh trửơng khá

+ Sinh trưởng yếu +++ Sinh trưởng tt.

11.3.4: Quan hệ với pH:

Nguyén tắc h

Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất của mỗi loại vi

sinh vật trong diéu kiện môi trường có pH thích hợp.

Phuong pháp:

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể,

Điều chỉnh môi trường bằng CH;COOH IN hoặc NaOH IN về các giá trị

pH sau:4,0 ; 50 ; 60 ; 70 ; 80 ; 9,2 ; 9,6 ; 10 (chỉnh pH

sau khi hấp khử trùng ) Cay từng chủng vi klhuẩn vào các ống nghiệm

chứa môi trường ứng với từng giá trị pH Nuôi cấy tinh ở nhiệt độ 30°C

trong 4 ngày.

Yêu cau:

Quan sát sự sinh trưởng phát triển của từng chủng vi khuẩn ứng với

mỗi giá trị pH dựa vào mức độ đục của môi trường

11.3.5; Khả năng lên men các loại đường :

Nguyên tắc :

Căn cứ vào khả năng lên men một số loại đường tạo thành acid

lactic của vi khuẩn lactic Sự có mặt của acid lactic sẽ làm thuốc thử phenol

trong môi trường từ màu đỏ chuyển thành màu vàng

Phương pháp:

Pha chế các môi trường lên men chứa các nguồn hyđtratcacbon khácnhau:glucose, saccharose, fructose, mantose, sorbitol, manitol,galactose Diéu chỉnh môi trường hơi ngả vé kiểm, dùng chất chi thị mau

đỏ phenol Cấy từng chủng vi khuẩn vào môi trường với những nguồn

hydratcachon khác nhau Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày.

Yêu cầu :

Quan sát khả năng sinh trưởng phát triển của từng chủng vi khuẩn

ứng với mỗi loại hyđratcacbon dựa trên sự thay đổi màu sắc của môi

trường Nếu môi trường chuyển sang màu vàng tức pH môi trường là acid

chứng tỏ có sự lên men của vi khuẩn lactic

2â

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HỒNG VAN

11.3.6: Quan hệ với nông độ mudi:

Nguyên tắc:

Khả năng sống trong điểu kiện môi trường có nỗng độ muối cao là

những đặc trưng của vi khuafi lactic, những đặc trưng đó có ý nghĩa về mặt

phân loại

Phượng pháp :

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường khảo sát với ndng

đô muối là 2%, 4%, 6,5% Cấy từng chủng vi khuẩn vào môi trừong ứng

với mỗi nồng độ Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày

Yêu cầu:

Quan sát khả năng sinh trưởng phát triển của từng chủng vi khuẩn

dựa trên mức độ làm đục môi trường

11.4 Xác định động thái sinh trưởng , ảnh lưởng của nhiệt độ và

pH đến động thái sinh trưởng của các chủng

11.4.1 Xác định động thái tăng trưởng của các chủng :

Sau khi hoạt hóa giống, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lactic vào môi

trường MRS dịch thể.

Điều kiện lên men :

" Nhiệt độ: 30°C

" pH 6,0

® Tilé giống là 5% với số lượng tế bao trên 1 ml bằng nhau

Xác định sự biến động số lượng tế bào tại các thời điểm: 0, 2, 4, 6, 8.

10,12 giờ nuôi cấy (triệu tế bào /1 mi ) Từ đó xây dựng đỗ thi sinh trưởng

của mỗi chủng.

Để xác định số lượng tế bào trong quá trình lên men, tiến hành đếm số

tế bào trong dich nuôi cấy bằng khung démGoriaep_Thoma

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HỒNG VẬN

* Bat đầu đếm khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút để các tế bào có thời

gian lắng xuống và nằm trên cùng một mặt phẳng

"=_ Đếm số tế bào ít nhất trong 5 ô vuông lớn

Chú ý:nồng độ dịch huyén phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi 6 nhỏ không quá 10 tế bao.

Cách tính :

* Tính số lượng trung bình tế bào trong một ô lớn (a)

® Mật độ tế bào : N/ml = 0,25 a x I0” tế bào / ml

11.4.2, Anh hưởng của nhiệt độ đến động thái sink trưởng :

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ 20°C, 25°C, 30°C,

35°C 40°C 45C 50°C.trên môi trường MRS dịch thể Số lượng tế bào

nuôi cấy ban đầu bằng nhau pH = 6,0 Xác định số lượng tế bào ở các thời

điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10, giờ Từ đó xác định nhiệt độ sinh trưởng phát triển

thích hợp của từng chủng.

11.4.3, Anh hưởng của pH đến động thái sinh trưởng :

Dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị ức chế ở nhiệt độ lạnh

sâu.

Đây là phương pháp được sử dụng khá rộng rãi để bảo quản vi sinh

vật Uu điểm của phương pháp này là dễ bảo quản và thời gian giữ được

lâu.

Phương pháp:

Để bảo vệ vi sinh vật không chết ở nhiệt độ lạnh sâu do các tỉnh thể

nước gây ra, người ta thường trộn vi sinh vật với một trong những chất bảo

VỆ sau:

25

l V iT NGHIỆP TRAN THỊ HONG VAN

* Glycerin 15%

* Huyết thanh ngựa

* Dung dịch saccharose 10% + gelatin 1%, pH = 6.8 - 7 Dung dịch

glucose hoặc lactose 10%,

Sau khi đã trộn đều vi sinh vật với chất bảo vệ, cho vào các ống

nghiệm đậy nút lại và làm lạnh từ từ, Khi độ lạnh đạt -20°C _ -25°C giữ

tốc độ làm lạmh trong 2 phút.

Thực hiện bảo quản các chủng đã tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành dùng glyccrin làm chất bảo vệ để giữ giống vì

phương pháp này cho kết quả tương đối tốt và phù hợp với trang thiết bị

phòng thí nghiệm.

26

LUẬN VĂN TỐT N P TRAN THỊ HONG V.

PHAN II: KET QUA - BIỆN LUẬN

1 Phân lập va chon giống:

Tiến hành phân lập theo phương pháp Koch ở độ pha loãng thích

hợp, đã thu được 13 chủng vi khuẩn tương ứng với từng nguồn phân lập như

sau:

Nguồn phân lập : Kí hiệu các chủng được phân lập :

Nước đứa lên men Dị ,D› ,Dị,D;

Nước cà chua lên men C

Nước dưa cải muối chua DC; DC)

Nước dưa giá G Nem chua Na, Na, No Sữa chua S

Men bánh mi (Mori LaNgà) M

1.2 Sơ chọn giống :

Các chủng đã phân lập, được tiến hành nuôi cấy trên môi trường

thạch đĩa cacbonat-agar ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày Chúng tôi nhận thấy

rằng, tất cả các chủng đều xuất hiện vòng trong suốt xung quanh mỗi khuẩn

lạc Diéu này chứng tỏ trong quá trình sinh trưởng phát triển chúng đã tao

ra acid Tuy nhiên mức độ sinh acid của mỗi chủng là khác nhau Chủng

nào có kích thước vòng trong càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra cang

nhiều Các kết quả thu nhận, được biểu diễn qua các hình sau :

27

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HONG VAN

Hình | : Khả năng tạo vòng tan trên môi trường

cacbonat agar của các chủng Dạ, Do, Dạ, Dy

cacbonat agar của các chủng Na, Na, Nụ, S

28

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HỒNG VAN

Hình 3 : Khả năng tạo vòng tan trên môi trường cacbonat agar của các chủng DC;, DC, G, €

29