Đề cương chẩn đoán bệnh động vật

Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học  là dựa trên sự đặc hiệu giữa phản ứng kháng nguyên và kháng thể 7.. PP hóa mô miễn dịch IHC: kết hợp giữa phản ứng miễn dịch với hóa chất enzy

ĐỀ CƯƠNG CHẨN ĐOÁN

Để cương ôn tập Chẩn đoán bệnh thú y bằng SHPT (đây là những điểm chính, không có nghĩa là đề thi chỉ bao gồm những điểm này nhưng sẽ xoay quanh những vấn đề này là chính)

1   Cách làm primer khuếch đại nguyên gen (nguyên ORF), cặp primer có kèm thêm vị trí bám cho enzyme cắt, giới thiệu tag (Flag, HA)… như đã học

2   Nguyên lý của TA-cloning

 Mỗi chuỗi có dư 1 thymidine (T) tại đầu 3’

 Dùng clone sản phẩm PCR của những Taq polymerase thiếu hoạt tính 3’ exonuclease Những Taq này sẽ thêm Adenosine tại đầu 3’ của sản phẩm mà không phụ thuộc vào DNA khuôn (trong slide bài giảng thực hành)

3   Cách clone bằng enzyme cắt, nguyên lý và các bước

1.Thiết kế mồi với enzyme cắt phù hợp

2.PCR

3.Phân tích sản phẩm trên gel agarose

4.Ly trích DNA từ gel (Phenol – Cloroform)

5.Cắt với enzyme cắt đã định

6.Phân tích sản phẩm trên gel agarose

7.Ly trích DNA từ gel (Phenol – Cloroform)

8.Kiểm tra nồng độ DNA trong mẫu (ng/ul)

9.Phản ứng gắn (ligation – SL)

10 Chuyển nạp vào E.coli (DH5alpha)

11 Bắt khuẩn lạc

12 Miniprep (1.5 ml/khuẩn lạc)

13 Cắt thử nghiệm

14 Midiprep (50-200ml)

4   Cách tính toán Vector/Insert

 V>I :8, tỉ lệ V/I = 1/3  => 1ng phân tử Insert có 8 lần phân tử Vector, số phân tử

vector bằng 1/3 phân tử Insert trong this phản ứng

 1ngV  tương đương 1ngI/8 x 3

 20ngV => I = 20*8/3 = 7.5ng

5   Mục đích của việc phân lập virus, vi trùng

# Virus :

 Định danh

 Vacxin tự sinh

 Tạo clone gây nhiễm

  Nghiên cứu tạo vacxin mới

# Vi khuẩn

 Định danh

 Kháng sinh đồ

 Vacxin tự sinh

6   Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học

 là dựa trên sự đặc hiệu giữa phản ứng kháng nguyên và kháng thể

7   Tên và nguyên lý một số phương pháp huyết thanh học, nhất là ELISA

A.   Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF): KT bám lên KN trên bề mặt tế bào hoặc KT phải đi vào trong tế bào để bám lên KN tồn tại bên trong tế bào chất hoặc nhân

B.   PP ngưng kết hồng cầu (HA): haemagglutinin của virus bám lên thụ thể sialic axit trên màng tế bào hồng cầu gây ngưng kết

C.   PP hóa mô miễn dịch (IHC): kết hợp giữa phản ứng miễn dịch với hóa chất (enzyme + cơ chất) làm hiện rõ các kháng nguyên trong TB (perosidase là enzyme thường dc sử dụng)

D.   ELISA: dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa KN-KT, phát hiện bằng kháng thể đánh dấu

E Phản ứng ngưng kết:

#Nguồn : tài liệu thầy

8   Cách phân tích kết quả xét nghiệm HTH (chủ yếu là ELISA): khi kết quả dương tính, khi kết quả âm tính thì kết luận được gì?

1 Kết quả dương tính (đã loại bỏ dương tính giả)

- Thú đã tiếp xúc với kháng nguyên: đã lâu, mới đây, do tiêm phòng, do kháng thể mẹ truyền

- Như vậy, dương tính không có nghĩa là đàn thú đang bị VSV gây bệnh cần có thông tin

về dịch tễ, quy trình chăn nuôi

2 Kết quả âm tính (đã loại bỏ âm tính giả)

- Đàn thú chưa từng tiếp xúc KN

- Đàn thú mới tiếp xúc gần đây (nội trong 5 ngày, chưa có kháng thể)

- Đàn thú đã tiếp xúc KN quá lâu, và là loại KN có độ bảo hộ ngắn nên KT đã hết (IgM: mau hủy; IgG: lâu hủy)

9   Ứng dụng của mỗi phương pháp chẩn đoán đã học: ELISA, PCR, IF, IHC, ISH, WB,

HI, HA, SN, Sequencing, Flow cytometry, phân lập

PP

ch

uẩ

n

đo

án

Ứng dụng

ELI

SA Tìm kháng thể, kháng nguyên

Đánh giá hiệu quà tiêm phòng

Xác định thú nhiễm bệnh hay chưa

PC

R,

IS

H

Tìm gen

Xác định các loại mRNA nhất định trong từng tế bào của các mẫu mô, tìm hiểu quá trình phst1 inh bệnh (ISH)

IF,

SN

Tìm kháng thể

IH

C,

HI,

HA

Tìm kháng nguyên

Đo hàm lượng k/t trung hòa virus (HI)

Xác định k/n trong mẫu huyết thanh (HA)

W

B Tim  protein chuyên biệt trên các mẫu mô hoặc dịch chiết mô

Se

qu

en

cin

g

Giải trình tự (định danh)

w

cyt

om

etr

y

Tế bào (số lượng, kích thước, hàm lượng đại phân tử, nhận dạng di truyền,…)

Phát hiện k/n màng

Ph

ân

lập

Định danh,

10   S o sánh một số cặp PP: PCR vs ISH; PCR-ELISA vs phân lập; ELISA vs SN-HI;

ELISA vs HA…

PCR - ISH:

 Giống nhau: tìm gen mục tiêu

 Khác nhau: PCR dựa trên DNA, ISH dựa trên RNA (ISH tính xác thực cao hơn

PCR)

PCR - ELISA với phân lập:

 Giống nhau: xác định sự hiện diện của tác nhân gây bệnh

 Khác nhau:

 PCR (tìm gen mục tiêu), ELISA (KN-KT), phân lập (dựa trên sự phát triển của VSV trên mt đặc trưng)

 ELISA và PCR: mẫu có thể chết hoặc sống

ELISA với HA:

 Giống nhau: xác định kháng nguyên trong mẫu huyết thanh

 Khác nhau: ELISA (KN-KT), HA (ngưng kết hông cầu)

11   Để có kết quả chẩn đoán tốt cần các yếu tố nào?

 Cách lựa chọn mẫu mô và loại test

 Thu thập mẫu

 Bảo quản

 Sự nổ lực và hợp tác: BSTY, người vận chuyển, kỹ thuật viên, người chăn nuôi

và chuyên gia chuẩn đoán

12 Các lưu ý khi thiết kế primer

 Độ dài 16 – 20 nt Nhưng nếu có phần không bắt cặp thì phần bắt cặp ít nhất là 20 nt

 Nên kết thúc ở C hoặc G tại đầu 3’

 Nhiệt độ Tm nên cách nhau càng ít càng tốt (không dc quá 5)

 Chỉ tính Tm cho phần bắt cặp của primer

 5’ và 3’ không nên cùng lúc có G và C (tránh primer dimer hoặc kẹp tóc)

13   Cách lựa chọn enzyme để thực hiện cloning bằng enzyme cắt

Lựa chọn enzyme cắt trên vector nhưng không được cắt trên đoạn DNA chuyển vào

14   Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn thường dùng trong chẩn đoán bệnh thú y và chức năng (hay cách sử dụng) của chúng

1 Môi trường

Macconkey

Sử dụng để phân lập hầu hết

các vi khuẩn gram (-) đặc biệt

là học Enterobacteriaceae

Môi trường thường dùng để phân lập ecoli

E.coli khuẩn lạc từ hồng đến tím nhạt, kishc thước 2-3mm, dạng tròn đều, L(+),, có vùng tủa muối xung quanh, bề mặt nhày và lồi hơn trên mặt thạch ( ecoli mucoid) mucoid : chất nhầy

2 Môi trường

CAN

Sử dụng để phân lập các vi

khuẩn gram (+) như

Streptococcus spp, Staphylococcus spp,

Streptococcus spp : kishc thước 0.5-1.5mm, khuẩn lạc tròn, có 3 dạng phân giải máu

Γα-streptococcus vòng phân giải

mờ xung quanh khuẩn lạc

:β: vòng phân giản rộng có vòng tan máu trong suốt, đôi khi có 2 vòng, vòng 1 bên trong và vòng 2

mờ hơn Γ-str : khuản lạc màu trắng đục, không phân giải máu

3 Môi trường

COS

Sử dụng để nuôi cấy hầu hết

các vi khuẩn gram (-) và (+)

trừ 1 số vi khuẩn khó nuôi cấy : HPS, APP

Đối với nuôi clostridium cần nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí

Ecoli màu trắng đục, kích thước 2-3mm, khuẩn lạc tròn bóng, nhẵn, bờ đều

Haemolytic-E.coli : khuẩn lạc có màu trắng đục, xung quanh có vùng phân giải máu lớn

4 Môi trường

PVX Máu được phân giải để tạo cácyếu tố cần thiết cho sự phát

triển của một số chủng vi sinh vật nhạy cảm

Sử dụng để phân lập , nhận biết HPS và APP ủ trong điều kiện vi hiếu khí

Sử dụng làm kháng sinh đồ cho HPS và APP

Haemophilus parasuis : khuẩn lạc nhỏ, tròn trơn kích thước 0.5mm trong như giọt nước

APP: Actinobacillus pleuropneumonia : khuẩn lạc màu trắng, kishc thước 2mm, có độ dai, mọc sát bề mặt thạch, khuẩn lạc dinh , dùng tăm lấy lên khó  

5 Môi trường

MHI

Môi trường sử dụng làm kháng sinh đồ cho vi khuẩn

Với thành phần :

1- Peptones : cung cấp các axit amin

2- Starch soluble : hút chất độc trong môi trường đồng thời thủy phân ra dextrose để cung cấp năng  lượng 3- Agar ; môi trường đặc lại

4- 5% máu cừu : thử khả năng phân giải máu haowjc do vi khuẩn cần hồng cầu trong quá trình để phát triển

 

6 Môi trường

XLD

Môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonela spp

Ecoli : khuẩn lạc kích thước 2-3mm, màu vàng

Salmonella: khuẩn lạc màu đỏ hồng, tâm đen, lồi lên trên ề mặt thạch, có màng nhày, kích thước 2mm

Proteus: khuẩn lạc kích thước 2mm, tâm đen, xung quanh có vòng vàng nhạt

 

-       Thê slide : xác ddnhj loại môi trường cần dùng

15   Các chỉ số (độ) để đánh giá chất lượng của kit chẩn đoán

- Độ nhạy

- Độ đặc hiệu

- Độ chính xác

- Độ lặp lại

16 Các phương pháp PCR; nguyên lý của Realtime (probe hoặc chất chèn vào DNA) làm lại

Nguồn : http://dulieu.tailieuhoctap.vn/books/khoa-hoc-ky-thuat/cong-nghe-sinh-hoc/ file_goc_779762.pdf

Có loại PCR gồm : PCR truyền thống, RT PCR, Realtime PCR, Nested PCR, multiplex PCr

Còn các loại khác : q-RT PCR, s-PCR, Duplex PCR ,

ST

T

1 PCR truyền

thống

2 RT-PCR RT- PCR (reverse transcriptase polymerase

chain reaction) là một phương pháp dùng để khuyếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược

Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗi oligonucleotide:

enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase)

và DNA polymerase

cDNA từ RNA và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA Do enzyme reverse Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 10 transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngược để tạo ra cDNA phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-450 C) Điều này gây ra những trở ngại: - Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp không đặc hiệu của các primers - Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai Tuy nhiên những trở ngại này có thể được giải quyết nhờ vào việc sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus Enzyme này trong những điều kiện nhất định, có đặc tính sinh học đặc biệt là có thể thực hiện cùng lúc 2 chức năng: chức năng của reverse transcriptase và chức năng của DNA polymerase.

RT- PCR thường được

sử dụng để tạo

ra thư viện cDNA (complementar

y DNA) lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ phân

tử của gene

Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa

đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh

do virus RNA

3 Realtime

PCR

Định nghĩa : Kỹ thuật Real time PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu Phương pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị

đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại

Ntắc: Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR

và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành

Chất huỳnh quang: màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA  và ái lực này làm cho sợi đôi phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Do

đó, máy sẽ xác định được cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng.

Đầu dò phát huỳnh quang (Probe): là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích Đầu dò oligonucleotide này được gắn các phân tử có thể phát huỳnh quang Sự phát quang này thông thường xuất hiện khi có mặt sự kết cặp của đầu dò (probe) với phân

tử ADN đích Vì vậy cường độ phát quang sẽ thay đổi sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR Qua đó máy Realtime giúp định lượng được số bản sao được nhân lên tại mỗi thời điểm Ngoài ra còn nhiều cơ chế phát quang được các nhà nghiên cứu phát triển nữa Nhưng nhìn chung đều dựa vào sự thay đổi cường độ huỳnh quang sau mỗi chu kỳ phản ứng, do phân tử ADN đích được tạo ra nhiều hơn.

https://www.sinhhocphantu.org/2017/12/realtime-pcr-la-gi.html

 

 

4 MultiplexPC

R Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc

hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng

 

5 Nested PCR Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR

thường, trong đó hai cặp mồi PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNA Phản ứng nested PCR phải được thực hiện hai lần Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần 1 Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2, cặp mồi thứ 2

sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1

và khuếch đại đoạn gen cần xác định

 

6 RT-q PCR là kỹ thuật PCR định lượng với khuôn ban đầu là

ARN.

ARN được phiên mã ngược thành ADNc và sử dụng làm khuôn cho phản ứng qPCR

    Nguồn : https://biomedia.vn/review/rt-qpcr-cac-nguyen-ly-co-ban.html

Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm phân tích biểu hiện gen, xác nhận iARN (RNAi validation), xác nhận

microarray (microarray validation), phát hiện sinh vật gây bệnh, thử nghiệm di truyền và nghiên cứu bệnh

 

17   Tên một số tác nhân gây bệnh đường hô hấp, tiêu hóa, sinh dục trên heo.

A vi khuẩn

HÔ HẤP

Actinobacillus pleuropneumonia (-) Viêm phổi màng phổi

Pasteurella multocida

+/-Mycoplasma

Tụ huyết trùng

Haemophilus parasuis (+) Viêm phổi địa phương/ viêm đa

xoang TIÊU HÓA

Clostridium perfringens type C Viêm ruột hoại tử

E.coli (độc tố Shiga, Stx2e (độc tố

TK))

Phù thủng, tiêu chảy

Salmonella cholerasuis Thương hàn

Brachuspira (Serpulina)

NIỆU DỤC

Actinobaculum suis (Actinomyces

suis)

Viêm thận

Leptospira (có ở chuột hoang) Bệnh do Leptospira

B virus

HÔ HẤP

PRRSV; Arterivirus; Arteriviridae Tai xanh (PRRS)

Asfivirus; Asfarviridae Dịch tả heo châu phi

Influenza A; Orthomyxoviridae Cúm heo

Herpesvirus 1; Herpesviridae;

TIÊU HÓA

Asfivirus; Asfarviridae Dịch tả heo châu phi

Pestivirus; Flaviviridae Dịch tả heo cổ điển

Alphacoronavirus; Coronaviridae Dịch tiêu chảy trên heo (PED)

Circovirus; Circoviridae Hội chứng còi cọc (PMWS)

NIỆU DỤC

Pestivirus; Flaviviridae Dịch tả heo cổ điển

PRRSV; Arterivirus; Arteriviridae Tai xanh (PRRS)

Parvovirus; Parvoviridae Bệnh Parvo

Asfivirus; Asfarviridae Dịch tả heo châu phi

Herpesvirus 1; Herpesviridae;

Porcine herpesvirus 2; Herpesviridae Viêm mũi thể vùi (Inclusion body

rhinitis)

18   Thành phần và chu kỳ nhiệt của PCR

 Thành phần : dung dịch đệm, Taq, dNTP, mồi xuôi- ngược, mẫu template, nước 

# Chu trình nhiệt Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ có 3 bước chính gồm : biến tính-, bắt cặp, tổng hợp

0-Tiền biến tính :

1- Biến tính : 94-95 trong 30s-1'

2- bắt cặp : 55- 65 trong 30-60s

3 - Kéo dài: 72 từ 30s- vài phút

4-  Hậu Kéo dài

19   Quy trình (các bước chính) để tạo ra một plasmid chứa gen mong muốn để biểu hiện gen trên môi trường tế bào ( coi lại thêm câu 3)

20   Các yếu tố quyết định số lượng mẫu cần thu thập trong chẩn đoán

- Tổng số đầu con trong khu khảo sát

- Giới hạn tìm thấy thấp nhất ( mức phổ biến của kháng nguyên mục tiêu = tỷ lệ thú nhieemxm bệnh): 5,10, 20%

- Độ tin cậy của kết quả chuẩn đoán : 80-90%

- Chi phí

21   Tên một số bệnh gây xuất huyết trên da (và cả phủ tạng) trên heo, gồm: Tai xanh, dịch tả heo cổ điển, dịch tả heo châu phi, tụ huyết trùng, dấu son, thương hàn

22   Bệnh tích xuất huyết trên da và mô cơ quan có thể được thấy trên heo khi bệnh: Tai xanh, dịch tả heo cổ điển, dịch tả heo châu phi, tụ huyết trùng, dấu son, thương hàn Còn những bệnh khác như: Viêm hồi tràng Lawsonia, lỵ heo Brachyspira,   viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens, PED, E.coli thường không gây ra bệnh tích trên da.

23   Một số bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn trên gia cầm: thương hàn, tụ huyết trùng, Sổ mũi truyền nhiễm, CRD, ORT

24   Bệnh tích nhục hóa phổi (hóa thịt) trên heo có triệu chứng ho từng cơn, nhất là khi

bị rượt đuổi thường liên quan đến bệnh: viêm phổi địa phương do Mycoplasma hyopneumoniae.

25   Bệnh tích nhồi máu rìa lách thường được thấy trên heo khi bệnh: dịch tả heo (cổ điển)

26   Mẫu bệnh phẩm dùng để thực hiện hóa mô miễn dịch cần được bảo quản trực tiếp trong dung dịch formalin 3.7%

27.  Lưu ý khái niệm:

- ‘Kháng thể bắt’ (capture antibody) trong ELISA kẹp chả (sandwich): là kháng thể phủ dưới đáy giếng nhằm bắt giữ kháng nguyên

- Kháng thể dò tìm: bám trực tiếp lên kháng nguyên, đây là primary antibody (kháng thể thứ nhất) Không gắn enzyme trong ELISA gián tiếp, có gắn enzyme trong ELISA trực tiếp

- Kháng thể phát hiện trong ElISA: là kháng thể gắn enzyme Đây là secondary antibody (kháng thể thứ hai)