Sử dụng PCR để chuẩn đoán bệnh sán lá gan ở cừu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINHSử dụng PCR để chuẩn đoán bệnh sán lá gan ở cừu.Môn học: Thiết bị và kỹ thuật CNSH.1... Mẫu và phương pháp thực hiện.1.. Fasciola hepatica có một vò

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG

LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

Sử dụng PCR để chuẩn đoán

bệnh sán lá gan ở cừu.

Môn học: Thiết bị và kỹ thuật CNSH.

1

Thành viên nhóm:

• Nguyễn Phúc Thiện 21126514

• Trần Văn Phúc 21126473

• Bàng Đức Quân 21126476

2

Nội dung

2 Đối tượng nghiên.

3 Mẫu và phương pháp thực hiện.

1 Tổng quan

đề tài

3

1 Tổng quan đề tài

Fasciola hepatica có một vòng đời phức tạp, qua đó nó yêu cầu sự tồn

tại của vật chủ trung gian và vật chủ cuối cùng để phát triển và trưởng

thành qua nhiều giai đoạn ấu trùng

Nhiễm trùng bởi sán lá gan Fasciola spp trong gia súc gặp thiệt hại kinh

tế ước tính lên tới 3 tỷ USD hàng năm gây ảnh hưởng đáng kể đến phúc

lợi của động vật và chất lượng thực phẩm xuất phát từ động vật, nó

cũng có tác động quan trọng đến sức khỏe của cộng đồng

=> Mục tiêu: từ sự ảnh hưởng trên của sán lá gan chúng tôi muốn áp

dụng kỹ thuật PCR để nhận biết sớm việc nhiễm sán lá gan ở động vật

để có biện pháp phòng nhanh chóng

4

2.Đối tượng nghiên

cứu

Sán lá gan gây bệnh ở nhiều

phần của cơ thể (ví dụ như

mạch máu, đường tiêu hóa,

phổi, gan) tùy thuộc vào loài

F hepatica là sán lá gan ở

cừu và gia súc.

Vật chủ trung giang là các

loại ốc nước ngọt

ốc Limnaea

viridis và Limnaea swinhoei.

5

3 Mẫu và phương pháp thực hiện

• Lấy mẫu và bảo quản mẫu:

Các mẫu phân được thu thập tại các trang trại có cừu bị nhiễm hoặc nghi

nhiễm, các mẫu được bảo quản trong ống nghiệm ở nhiệt độ 4°C, còn trong quá

trình chuyển mẫu thì lưu giữ mẫu ở -80°C

6

• Xét nghiệm mẫu trực tiếp:

Cho khoảng 30 ml nước muối thông thường (dung dịch đẳng trương NaCl 0,9%) và ống

nghiệm chứa mẫu đặt ở nhiệt độ phòng trong

30 phút, sàn lọc loại bỏ phần hạt lớn Đem hỗn hợp cho vào ống Eppendorf ly tâm ở tốc độ

2.000 vòng trong 4 phút Lấy phần lắng đi soi

dưới kính hiển vi

7

• Sử dụng formalin etyl axetat

Lấy vài gam mẫu đi gây cho vào ống nghiệm chứa 9 ml formalin 10% ủ ở nhiệt

độ phòng trong 30 phút, thêm 2-3ml etyl axetat vào mỗi ống đậy nấp lắc trong 30

giây, loại bỏ khí sinh ra trong ống và ly tâm trong 4 phút ở tốc độ 2500 vòng Từ kết

tủa thu được, lấy một giọt đi soi dưới kinh hiển vi 4, 10 và 40×

8

• Ly trích DNA

Sử dụng bộ dụng cụ tách chiết DNA từ mẫu phân theo chỉ định của nhà sản suất

để tách DNA

Lấy cặn mẫu đi sàng và siêu âm ở mức điện áp 90 volt trong 5 lần, 5 giây/ lần Sau

đó, 300 µl mẫu được đổ vào ống nghiệm 1,5 ml và tiến hành chiết DNA

Trứng của F hepatica được phân lập từ mẫu gan của những động vật bị nhiễm,

sau mỗi bước 5 giây lấy 1 giọt mẫu đem soi dưới kính để xác định xem trứng đã vỡ

hay chưa, ngoài ra còn sử dụng máy Nanodrop để xác định nồng độ DNA sau khi trích

xuất

9

• Phản ứng PCR

Gen spacer xen kẽ của F.patica được chọn làm gen mục tiêu cho xét

nghiệm PCR

-Thành phần của phản ứng PCR

12,5 µl hỗn hợp chính( Taq polymerase, buffer, dNTP, Mg2+)

1µl primer F

1µl primer R

2 µl DNA chiết xuất

8,5 µl nước cất

10

Trình tự primer R và primer F

Thông số Trình tự Chiều

dài

Tm (°C)

Tỉ lệ GC

Kích thước sản phẩm

Intergenic spacer

(AF179871) primer F

CATTACCGACTCA

GCTTGCA 20 bp 60.0 50.0%

220 bp

Intergenic spacer

(AF179871) primer R

ACCAAACGTTCGG

TTAGGT 20 bp 60.0 50.0%

11

Quá trình phản ứng

PCR gồm 3 giai đoạn:

-Biến tính.

-Gắn mồi.

-Kéo dài.

12

Chu trình nhiệt

13

Giai đoạn Nhiệt độ(⁰C) Thời gian(phút,

giây) Số chu kì Tiền biến tính 94 5 phút 1

Biến tính 94 1 phút 35 Bắt cập 55 45 giây 35 Kéo dài 72 1 phút 35 Hậu kéo dài 72 5 phút 1

Điện di và kiểm tra

mẫu:

Mẫu đối chứng âm là

nước vô trùng và đối chứng

dương là đoạn DNA dài

220bp Mẫu được điện di

trong gel agarose 1% TBE và

thuốc nhuộm an toàn DNA(1

μg/ml) g/ml)

14

Tài liệu tham khảo

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8410177/

https://www.vinmec.com/vi/benh/san-la-gan-3291/

https://www.biologydiscussion.com/invertebrate-zoology/phylum-platyhelminthes/fasciol a-hepatica-habitat-structure-and-life-history/28888

15

Cảm ơn thầy và các bạn đã chú ý lắng

nghe

16