Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Thiết lập quy trình nhân giống in vitro cây hoa Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida)

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl, BA, IBA, NAA trong khửtrùng mẫu, nhân chdi và tạo rễ cây hoa dạ yến thảo petunia hybrida trong nuôi cấy invitro” đã được tiến hành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

THIET LAP QUY TRINH NHAN GIONG IN VITRO

CAY HOA DA YEN THAO (Petunia hybrida)

NGANH : NONG HOCKHOA : 2019 - 2023SINH VIÊN THỰC HIỆN : HỶ NHẬT HÀO

Thành phó Hồ Chí Minh, thang 8 năm 2023

THIET LẬP QUY TRÌNH NHÂN GIONG IN VITRO CAY HOA DA YEN THẢO (Petunia hybrida)

Thành phó Hồ Chí Minh, thang 8/2023

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Nông Lâm Thành Phó

Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Nông học, Bộ môn Di truyền — Chọn giống cây trồngcùng với quý thầy cô giáo đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ trong quá trình học tập và

thực hiện khóa luận của mình.

Cô Th.S Nguyễn Thị Thanh Duyên đã tận tình, hướng dẫn, theo dõi, chỉ dạy cho

em suốt quá trình học tập và góp ý dé thực hiện các thí nghiệm trong quá trình thực hiện

dé tài

Xin trân trọng cảm ơn anh Châu Đức Tài — chủ vườn giống hoa Dạ Yến Thảo - Q9Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện để thực hiện khóa luận và hoản thànhkhóa luận.

Lời cảm ơn đến các bạn cùng thực hiện khóa luận tại phòng nuôi cay mô, bộ môn

Di Truyền Chọn Giống Cây Trồng - Thúy Vy, An Khang, Minh Đức, Anh Hào, Tú Trinh,

đã đồng hành, chia sẻ kinh nghiệm, cùng giúp đỡ nhau hoàn thành khóa luận

Lời cảm ơn đến các bạn lớp DH19NHB - Quyền Cước, Phi Yến, Thanh Thương,Quỳnh Chị, đã chia sẻ, giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian làm khóa luận

Thành Phố Hỗ Chí Minh, tháng 7 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Hỷ Nhật Hào

i

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl, BA, IBA, NAA trong khửtrùng mẫu, nhân chdi và tạo rễ cây hoa dạ yến thảo (petunia hybrida) trong nuôi cấy invitro” đã được tiến hành tại phòng cấy mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Di truyền —Chọn Giống Khoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từtháng 02/2023 đến thang 08/2023 Các thí nghiệm được bồ trí theo kiều hoàn toàn ngẫunhiên 2 yếu tố, 3 lần lặp lại với mục đích xác định được phương pháp khử trùng mẫu vàmôi trường dinh dưỡng phù hợp cho cây dạ yến thảo trong các giai đoạn khác nhau: khửtrùng mẫu, nhân nhanh cụm chéi và hình thành rễ Kết quả thu được như sau:

Khi khử trùng mẫu đoạn thân mang mắt ngủ của cây hoa dạ yến thảo bằng NaOCIvới nồng độ 5% trong thời gian 10 phút cho kết quả tỉ lệ sống đạt cao nhất là 70,7 %

Môi trường MS có bồ sung 0,5 mg/l BA kết hợp với 0,1 mg/I IBA cho kết quả nhânnhanh tốt nhất với hệ số nhân chôi đạt 22,7 lần, trọng lượng chéi dat 3,6g, hé số lá/chồiđạt 4,6, chiều cao chổi đạt 3,0 cm

Môi trường MS có bồ sung nồng độ 0,1 mg/l NAA cho kết quả hình thành rễ tốtnhất với chiều dài rễ đạt 7,0 cm, số rễ dat 32,1 rễ/chồi, chiều cao chéi dat 6,3 cm, chi sốlá/chồi đạt 18

MỤC LỤC

Trang DREGE UA iosierimeniicoe min Sen een eR ee 1 LOG CAM OD ce ố 4.< iiTim hsasuiitraststosotttroosiphiske890BI84300000200501/001G40NH0080000105803/240040G0/036)8000/98310852800008015:81 iiiMUG Tá sssigg361055 55019201810 08 016 550184 01330E614À335EXI3448SYSSEEESGIE4B.ISSELESE4SSGI184EESSESESEEESSE.SSEELSSE IVDanh sách chữ viết tắt 2-52 SS2192392122121212112112112112112112111212121211 1e viDanh sach cac bang 1 VI [an SKCGH GAG HÌTÌlioseeaiioiiiieediid6igiisEthiBOSSSGĐ3S0S0SGSgRGHSSQE40EQHEXSNEHUEAREBIIREEHIGSSRIB/GHAE03/.GĐ2E.SE ix

NPA sasaeeensosoiiieorgnDgolkioL4G142G00002G0G0109/0080100344g100D408303024000006)40G100)618000G00800000gg00 |Đặt vấn đỀ - 5 s2 1E21211212112111121121111 211211112121 112121112121111212111121211 2121k 1Mục tiêu, yêu cầu và giới hạn đề tab c.cceccccccccccccsessessessessessessessessessessesseeseseeseteseeseeees 2

À IG- LIỂU out i5sedtiácâcaauilicooksSdsgdinenBssxsalviagdzsiugsteeoziygilincgstissavEoxti8Siudnieegsitdoeissisioesildsaideddasssitiuesi 3

a 2

LE ane ee 2Chương 1 TONG QUAN TALI LIỆU 2-2-2255 SS£SE£SE22EEE£2E2ZE2E2ZE22E2E22ezxe2 31.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo 2 2¿2222222E222212222122212222122711221122211211 22c 31.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học 5-5 + +2 +1+E+E£E£EEEEEEEE2EEEEEEEEEEErkrrerres 3

11 ð Pin BỘ HÌN Tỉ buaseensteorinasttrttiintortsutiirtrsnistoprtsiSigrgtstrlgtinguipidiinrgroistgiisoiingidbirrSrskie 41.1.3 Tình hình trồng và nhân giống cây cảnh Dạ yến thảo ở Việt Nam - 41.2 Nuôi cay mô tế bào thực VAte eceececcecessessesssesseescseseeessesecsseeeseeseesesecsuesesesseanseeeeeeees 51.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật +2 s+c2szcz+zczxerxrcee 51.2.2 Lịch sử nuôi cấy mô thế giới -2- 2 ©22222+2E2EE2EE2EEE2EE2EE2EE2EE22E2EEeEErrrr 61.2.3 Lịch sử nuôi cay mô tế bào thực vật ở Việt Nam -¿-2¿©22+22++2zxcc+z 6(OE HE ee 16 81.3.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống iw wizo -52- 81.3.2 Quy trình nuôi cấy 7 wi/rO ¿-52-552222222222222222212212211221271211211 22121121 xe 91.4 Chất khử trùng mẫu và một số chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cay mô 111.5 Những yếu tố anh hưởng đến kỹ thuật nhân giống vô tinh in vifro 13

IV

1.6 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Dạ yến thảo - 16Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ NOI DUNG THÍ NGHIỆM - 19

2.1 NOi dung thi nghiém 19

2.2 Thời gian va địa diém nghiên cứu -2- 2 2+222+22+2E+2EE2222221221222122122222zxe2 195,3 Vi liệu thí ee 192.3.1 GiO1g eee ecccccccccsessessessessssessesssessssessesstsssssesssssissstessssessessessessessessessessessesseeseeeeeees 192.3.2 Thiét bi va dung TUÔN ẢẢẢẢ 202.3.3 Điều kiện nuôi cấy in VitPO co eecscccccssecssesssessseesseesseessecssecssecssecssecssecssecsecsecssecssees 202.3.4 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm 2: ©22©2222S2222EE22E+2E2z2EzzEzzzx2 205.3 BỖ †rÌ fiÍ ee 322.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên đốt thân cây

Dạ yến thảo - 2-5252 222222522522121121121121121121121121121121121121211212121212122121 xe 22,2.4.2 Thi nghiệm 2: Anh hưởng của BA va IBA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi từđốt thân cây Dạ yến thảo i wi#7O 2 22:22222222222221222122212221221122112211 221121 xe 252.4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của mẫu cây DạVEN HAO occ “<5ắỖ 72.4 Phương pháp xử lý số liệu - 2¿©2¿2222222E122E2E12212251221211221221221122121 22c 29Chương 3 KẾT QUÁ VÀ THÁO LUẬN ¿ c co E6 -EnSOSiee-iioeecbaseeiogie 303.1 Ảnh hưởng nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân Dạ yến thảo 303.2 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi của đốt thân cây da

3.3 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của mẫu chi cây dạ yến thảo 46KITEF TT LIT TH eeeeereeeestressrreuoreeaerroaeerobeoesgreasagsa 53TÀI LIỆU THAM KHAO - 2° ©2222222222E22EE22EE2EE22EE2212221221221E221221 22 2ExeC 54

OO, , TT 57

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

ANOVA Analysis of variance (Phân tích phương sai)

BA 6 - benzyladenine

CRD Completely Randomized Design

CV Hệ số biến động (Coeficient of Variation)

ĐHST Điều hòa sinh trưởng

ctv Cong tac vién

IBA Indo — 3 - butyric acid

EC Lan lặp lại

MS Musrashige and Skoog (1962)

NaCIO Natri hypochlorite

NSC Ngày sau cay

NAA 1 — Naphthalene acetic acid

NT Nghiệm thức

WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)

vi

DANH SÁCH CÁC BANG

trang

Bảng 2.1 Thành phan các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm 20

Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm 1 - ¿- - + 1S SE sEskEsrrsersrrrree 22 Bang 2,3 Các:nphiệm thức thi nghigm: 2 ss:sssstsssssxoi40651035:01665310 053 05605400080643058664813.095889.089050 24 Bang 2,4 Các nehiệm tiức thí ñghẲiỆHñ 3 scscsscssssnewesmsasureernensemeaaenaennnemenneesvecmennn 25 Bang 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng đến tỉ lệ sông của mẫu cây dạ yến thảo qua các thời điểm - 2 22©2222222E22EE2EE+2EE2EE22EE2712222222 222222 31 Bang 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng đến tỉ lệ nhiễm của mẫu cây dạ yến thảo qua các thời điỂm - 2-22 ©2222++2E22EE2EE22EE22E22E222E22E2zzxee 33 Bang 3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến hệ số nhân chdi (lần) cây hoa dạ yến thân giữa Eh co ca Hư E2.7021.04227010040.003022743 C1.0021211202017720127071 38 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến chiều cao chổi (cm) cây hoa dạ yến fMlb uarễu TA TH naeaiesdhiesiangkeosattieuogdloessfbiSssdojkesosdnhihrlsfdEpvsolsgfessfugtsesil 40 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tô hợp BA và IBA đến số lá/chồi cây hoa da yến thảo qua các "0801011 Ô 42 Bang 3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp BA va IBA đến trọng lượng chỗi (g) cây hoa dạ yến thao qua 207g vn ‹s13 44

Bang 3.7 Ảnh hưởng của NAA đến chiều cao chéi (cm) hoa da yến thao qua từng thời _ Ôn cố ho on ch cơ rốn cơ Ôn Ôn nó SỜ ÔNG tHU 46 Bang 3.8 Anh hưởng của NAA đến hệ số lá (lá/chồi) và cây hoa dạ yến thảo thời điểm tữH từng (HÔI đÌỂGG, osu 21222 41.3202 H2gU HINH Zo gu 2270180 08380777300150g70 6Ó 47 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của NAA đến tỉ lệ ra rễ (%) của hoa dạ yến thảo qua các thời điểm =7 " 50 Bảng 3.10 Anh hưởng của NAA đến chiều dài rễ (cm) và số rễ (rễ/chỗồi) cây hoa da yến thao qua từng thời điỀm 2-2 2 222122E22E22E221221221221212121212121212121 2121 xe 50 Bảng PL4.1 Số liệu chuyên đổi Arsin% tỉ lệ mẫu sống (%) cây hoa da yến thảo 64

Bảng PL4.2 Số liệu chuyển đổi Arsin% tỉ lệ mẫu nhiễm (%) cây hoa dạ yến thao 65

Bảng PL4.3 Số liệu chuyền đôi Arsin% tỉ lệ mẫu chết (%) cây hoa dạ yến thảo 66

Bảng PL4.4 Số liệu chuyển đổi Arsin% tỉ lệ ra rễ (%) của cây hoa da yến thảo 67

eK x 2 4A x ^ x :Ẩ x AK 2 h tA 2 x: sk

Biêu đồ 3.1 Tỉ lệ mau sạch bệnh, mau nhiễm, mau chết sau ở thí nghiệm 1 ở thời điêm

Biểu đồ 3.2 Tốc độ tăng trưởng số chồi mẫu cây dạ yên thảo ở thí nghiệm 2 62Biểu đồ 3.3 Tốc độ tăng trưởng chiều cao chồi mẫu cây dạ yến thảo ở thí nghiệm 2 62Biếu đồ 3.4 Tốc độ tăng trưởng số lá trung bình (lá) của cây dạ yến thảo qua các thờiidm 6 thi mghiGm 6 4 63Biểu đồ 3.5 Tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây da yến thao (cm) qua các thời điểm ở

thí NSN 3 sxsezeseerzeseeezssesessssebásEE 1E 015518835438551633458583361584555SEGESXGEISESISES24656052889333888-E03 63

Vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

trang

Hình 1.1 low đạ Yên THÁG „ -soc©ecrELL2 .EH1920.74707920.27292077c7242,797717440070702312 6 3Hình 2.1 Cây và đoạn thân mang mắt ngủ của cây dạ yến thảo . - 20Hình 2.2 Doan thân được dùng đề làm vật liệu khởi đầu cho thí nghiệm l 22Hình 2.3 Sơ đồ bồ trí thí nghiệm L 2 2¿©2222222EZ22E+2EEE2EE+2EEE2EEEzEErcrrree 23

Hình 2.4 Vật liệu thí nghiệm 2 - - - 2522222 22*2E2EEEErErEErErrrrrrrrrrrrrrrrrrrrree 25Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm 2 - 2-22 +SSE£SE92E22E2E212212251212112112112122112122 Xe 26Hnh2,6 ‘Vat liệu CH SICH ccs se eorsurasseenennvonsesncounepxnconsmensaemesenensanueamnamenanemnennneen 27

Ag le bóf thĩ m HE 3 er 28Hình 3.1 Ảnh hưởng của BA va IBA đến sự phát triển của của cụm chồi mẫu cây dạ yếnthảo thời điểm 42 NSC - 222222222222 E rrrerie 45Hình 3.2 Ảnh hưởng của NAA đến sự phát triển của mẫu cây dạ yến thảo thời điểm

Pir UW oe et mm, Esseswoeeteieretsoddtiass2g6000010G0020193003013010020030:8./300000081008 58

Hình PL3 Mẫu sạch, sống sau 21 NSC -22 2222222222E22E222E2212222221 222222 58Hình PL4 Mẫu chét «000 csssecsseeesssecsseeeessneessevecsseeessseessesecsnsscesnseseneeecsaneessnseesneeeeseess 58Hình PLS Mau chi da yến thảo sau 7 ngày nuơi cấy -2 22©22222222222zce: 59Hình PL6 Mẫu chồi da yến thảo sau 14 ngày nuơi cấy -2-©222-555+5c5c+2 59Hình PL7 Mẫu chồi dạ yến thảo sau 21 ngày nuơi cấy -22©22255+z555+2 59Hình PL8 Mẫu chdi dạ yến thảo sau 28 ngày nuơi cấy -2 2 2552252: 59

Hình PL9 Tồn cảnh khu thí nghiệm 2 :- . 5-502-22222221222211202 6, d0 59

Hình PL10 Mẫu cây dạ yến thảo khơng bé sung NAA sau 7NSC - 60Hình PL11 Mẫu cây dạ yéN thảo b6 sung 0,4 mg/I NAA sau 7NSC - 60Hình PL12 Hiện tượng xoắn rễ ở nồng độ 0,3 mg/l NAA trên mẫu cây da yên thảo thời

Gi 8920 e1 60Hình PL13 Hiện tượng tạo mơ sẹo ở nồng độ 0,4 mg/l NAA trên mẫu cây da yến thảo

SO, nưectadetSEi5a60nhieeBieotgta510nginivT09980030560800%0019180003005040/4000hu010180188 60

MỞ ĐẦU

Đặt van đề

Hoa dạ yến thảo (Petunia hybrida L.) còn có tên gọi khác là da yên là loài thựcvật thuộc họ cà (Solanaceae), có nguồn gốc từ các nước miền Nam châu Mỹ Hoa cómàu sắc đa dạng như trắng, hồng, đỏ, tim , và dang cây phong phú Dạ yến thaothường được trồng trong các chậu trang trí, chậu hoa treo trong nhà, trong vườn, làmviền cho khu vườn và tô điểm cho góc vườn hay căn nhà thêm rực rỡ, nếu chăm sóctốt cây có thé ra hoa quanh năm (Bui Thị Cúc va ctv, 2017)

Hiện nay, ở Việt Nam cây hoa dạ yến thảo được trồng chủ yếu từ hạt với giáhạt tương đối đắt (từ 1,000 đến 5,000 đồng/hạt tùy thuộc vào dạng cây và màu sắchoa), đồng thời tỉ lệ nảy mầm chỉ khoảng 60 - 65%, tỷ lệ chết cao, hạt nhỏ nên giáthành cây giống khá cao Dạ yến thảo còn có thể nhân giống bằng phương pháp giâmcành nhưng có nhược điểm là cần lượng cây mẹ lớn, hệ số nhân giống thấp, cây con

sinh trưởng kém và dễ nhiễm các loại bệnh (Bùi Thị Cúc và ctv, 2017)

Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bao thực vật giúp nâng cao hệ số nhân giống,cây giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về kiểu hình, ồn định về tính ditruyền là hướng đi gần như tất yếu trong nền sản xuất nông nghiệp công nghệ cao

hiện nay.

Việc sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho quátrình sinh trưởng của cây thì việc tạo nguồn vật liệu ban đầu là giai đoạn vô cùng khókhăn bởi vì giai đoạn này mẫu cây thông thường sẽ dễ bị nhiễm nắm, khuẩn, bị chếthoặc mẫu cây phát triển chậm, có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên, mộttrong số đó là các thao tác trong quy trình khử mẫu (Abdi và ctv, 2012) Phần lớn chấtkhử trùng được sử dụng hiện nay là HgCl., hiện tại có quá nhiều tài liệu tham khảo tríchdẫn sử dụng hợp chất này (Thompson va ctv, 2009) Ngoài ra, HgCl› gây ra những anh

hưởng tiêu cực cho sức khỏe người sử dụng (WHO, 2000) Do đó, việc nghiên cứu và

tìm ra chat khử trùng an toàn cho sức khỏe con người là môi quan tâm lớn của các nha

vi nhân giông.

Bồ sung một số chất điều hòa sinh trưởng như BA, NAA, IBA , là rất cần thiếtcho dé kích thích cho cây sinh trưởng, phát triển, tạo chi và ra rễ Tuy vậy, yêu cầu đốivới những chất này thay đôi tùy loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinhcủa các loài thực vật khác nhau do đó cần tiến hành các thí nghiệm dé tìm ra môi trườngtốt nhất.

Vì những lý do trên, đề tài “Thiết lập quy trình nuôi cấy in vitro cây dạ yến thảo(Petunia hybrida)” đã được tiễn hành

Mục tiêu, yêu cầu và giới hạn đề tài

Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ thực hiện quy trình in vitro trên một giống cây dạ yến thảo và chưa thựchiện quy trình ra vườn ươm từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 6 năm 2023

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo

1.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học

Phân loại (Ando và ctv, 2005).

Loai: Petunia hybrida

Tên thông thường: da yên thảo, da yến thảo

Hình 1.1 Hoa Dạ Yến ThảoNguồn: Công ty TNHH hạt giống hoa Việt Nam (2023)

Dạ yến thảo là cây hằng năm, ưa sáng, thân cao từ 15 - 30 cm có lông min baoquanh, phân nhánh từ nách lá Lá đơn hình oval, mọc đối hay luân phiên, có phủ lớplông mịn mềm mại, mép lá không có răng cưa Hoa nở vào mùa hè là dạng hoa đơn cuốnhoa dài 2 — 3 cm, đài hoa cao 1 — 2,5 cm Hoa lưỡng tính, hình phéu Ngày nay, do sựlai tạo đã cho ra đời nhiều hình dạng hoa như cánh đơn, cánh kép với mép có viền và

gợi sóng hoặc mép viền gợi sóng Hoa đa dạng màu, có màu tím, trắng, đỏ, cam, xanh

nhạt pha đỏ, có mùi thơm dịu (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006)

Dạ yến thảo thích nghỉ được với hầu hết các loại đất, pH từ 6,0 — 7,0 Cây thíchhợp với khí hậu ôn hòa, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng, không chịu

được ngập lụt hay khô hạn, đa số các loài thuộc chỉ này ưa nhiệt độ lạnh, ưa độ amnhưng không được ngập, cây nhạy cảm với ánh nắng trực tiếp (Lê Hồng Thủy Tiên,2006).

1.1.2 Phân bố dia ly

Dạ yến thảo vốn là loài đặc hữu của Nam Mỹ, phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệtđới với nhiệt độ từ 22°C — 39°C Sự đa dạng về loài chủ yếu tìm thấy ở vùng Serra củaBrazil, nơi tìm thấy loài Petunia integrifolia và Petunia axillaris được xem là nguồn gốccua Petunia hybrida (Dạ Yén Thao), ngoai ra Da Yến Thảo còn được tìm thấy nhiều ở

Argentina, Uruguay, Paraguay va Bolivia (Joao và ctv, 2009).

Ngày nay, các loài hoa thuộc chi này đã có nhiều phân hóa về đặc điểm hình thái

và điều kiện thích nghi Nhiều loài có thé sống tốt ở các điều kiện khí hậu khác hoàntoàn so với tổ tiên nó Do quá trình thuần hóa của con người và di thực nên các loàithuộc chi Petunia đã phân bố ngày càng rộng rãi tiêu biểu như loài Petunia hybrida (Joao

và ctv, 2009).

1.1.3 Tình hình trồng và nhân giống cây cảnh Dạ yến thảo ở Việt Nam

Cây Dạ Yến Thảo với màu sắc và kiểu đáng hoa đa dạng, bắt mắt nên đã được ưachuộng dùng làm hoa cảnh trang trí trong nhiều kiểu không gian khác nhau như phòngkhách, ban công, vườn hoa, tiểu cảnh sân vườn Trong những năm gần đây, các nhà vườntrồng cây cảnh đang đặc biệt quan tâm đến loại cây này vì nó mang lại hiệu quả kinh tếcao, được thị trường ưa chuộng Ở Việt Nam, Dạ yến thảo được trồng nhiều ở các nơinhư Đà Lat, TP Hồ Chí Minh, Sa Déc (tinh Đồng Tháp), chủ yếu là các giống có théthích nghỉ với điều kiện khí hậu ở nước ta Tuy nhiên dé có giống hoa đẹp các nhà vườnthường nhập các giống mới từ các nước như Trung Quốc, Đức, Nga hoặc Ba Lan có hoanhiều loại màu Mặc khác người dân cũng nhân giống cây hoa này bằng cách giâm cành

và sử dụng cây con từ quá trình nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, trồng được cây Dạ yên thảo

để cây khỏe mạnh đến khi ra hoa yêu cầu nhà vườn có nhiều kinh nghiệm Đa số cácgiống Dạ yến thảo trên thị trường rất khó đề canh tác, khâu xử lý hạt giống cho nảy mầm

khá khó, phương pháp giâm cành thì đòi hỏi nhiều kĩ thuật của người trồng (Lê HồngThủy Tiên, 2006).

Dạ yến thảo là cây ưa mát, ưa am, nhưng không ưa được ngập ung, cây không chiuđược khi thời tiết khô nóng, cây sau khi mất nước có tưới lại cũng khó hồi phục do thâncây rỗng xốp, lá mỏng (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006) Đây là đối tượng tiềm năng chongành trồng hoa cảnh ở Việt Nam, cần có những giống Dạ yến thảo mới với khả năngchống chịu tốt, dễ canh tác hơn nhưng vẫn mang tính thâm mỹ cao

1.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt G (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bao bat kỳcủa một cơ thé sinh vật da bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá théhoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều

mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi

gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh

Đó là tính toàn năng của tế bào

Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thê thống nhất bao gồm nhiều cơ quanchức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên, tất cảcác loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu,

tế bào hợp tử tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng riêng biệt(chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đồi thành các

tê bao chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.

Sự phân hóa tế bào là sự chuyên các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên

hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.

Quá trình phân hóa tế bào có thé hiền thị:

Tế bào phôi sinh > Tế bào mô phân sinh > Tế bao phân hóa có chức năng riêng

biệt.

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúngkhông hoàn toàn mat khả năng biến đổi mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiệnthích hợp, chúng lại có thé trở về dạng tế bào mô phân sinh và phân chia mạnh mẽ Quátrình đó gọi là phản phân hóa tế bảo.

Tế bào chuyên hóa (mô) > Tế bào mô phân sinh (Duong và ctv, 2003)

Ung dung kỹ thuật nhân giống in vitro đã mở ra một hướng phát triển mới trongngành nông nghiệp, giúp tăng sản lượng và chất lượng cây giống, đảm bảo nguồn cungcấp cây giống có chất lượng tốt cho thực tiễn sản xuất

1.2.2 Lịch sử nuôi cấy mô thế giới

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lich sử nuôi cấy mô và tế bao thế giới được bắtđầu từ năm 1902, khi nhà sinh lý thực vật người Đức Gottlieb Haberlandt là người đầutiên dựa trên thuyết tế bào của Schleiden và Schwann đã đề xuất phương pháp nuôi cấy

tế bào thực vật được công bồ trong bài báo nhan đề “Những thực nghiệm nuôi cấy tếbào thực vật tách biệt” Nuôi cây mô có thê chia thành 4 giai đoạn:

- Giai đoạn 1 (1902 — 1930): giai đoạn của các thử nghiệm ban dau

- Giai đoạn 2 (1934 — 1954): năm 1937, Gautheret nuôi thành công mô tế bào carốt, phát hiện vai trò của vitamin, auxin va cytokinin

- Giai đoạn 3 (1957 — 1992): tách và nuôi tế bào đơn, nhận biết vai trò của tỷ lệcytokinin/auxin, tạo được protoplast và tái sinh cây, tạo cây đơn bội từ nuôi túi phấn từnăm 1980: phát triển công nghệ gene thực vật

- Giai đoạn 4 (từ 1992 đến nay): ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy mô

lớn và trên diện rộng.

1.2.3 Lich sử nuôi cay mô tế bào thực vật ở Việt Nam

Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹthuật nuôi cay mô thực vat

Phòng thí nghiệm nuôi cay mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học,Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiêncứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điêu kiện Việt Nam, như nuôi cây bao

phan, nuôi cấy mô sẹo va protoplast, va đã thành công khi nuôi cấy bao 6 phan lúa vàthuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv, 1978) Tiếp đó là thành côngnuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978) Phòng thínghiệm tiếp theo được đặt tại phân viện Khoa Học Việt Nam ở TP Hồ Chí Minh, sau đó

là Dai học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam,

chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệmnuôi cây mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di Truyền Nông Nghiệp, ViệnRau Quả Trung ương, các trường Đại học), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (ĐàLạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh)

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vậtphát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giốngkhoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp).Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vvực chon dòng tế bào kháng bệnh(Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân

và ctv, 1994; Dinh Thi Tong va ctv, 1994) Các két qua vé dung hop té bao tran, chuyéngen luc lap cũng thu được kết quả ly thú (Nguyễn Đức Thanh va ctv, 1993) Nuôi caybao phan dé tao dong thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và

Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệu quý dé bảo tồn nguồn gen

và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được pháttriển (Phan Huy Bảo và Lê Thi Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv, 1995; Bùi Bá Bong,1995).

Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngày càng dat được những bướctiễn vượt bậc Cụ thé:

Tại Viện sinh học Nhiệt đới, từ đầu những năm 2000, đã tập trung vào công nghệnuôi cấy mô các cây công nghiệp như cà phê, hồ tiêu và nhóm cây lâm nghiệp thân gỗnhư paulownia, đó bau, neem Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống,tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh Nghiên cứu cải thiện 7 điều kiệnnuôi cấy in vitro, bioreactor cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy dau, hoa lan,cây cảnh Lan đầu tiên trong nước, các nhà nghiên cứu đã nuôi cay thành công mô phôi

vô tinh (soma), mô chéi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi

trường lỏng tạo điều kiện rất thuận lợi cho việc nhân sinh khối quy mô lớn tạo sản phẩm

có khả năng thương mại hóa Tạo và nuôi nhân rễ bất định sâm Ngọc Linh và bước đầughi nhận được sự hình thành rễ tơ (hairy root) sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩnAgrobacterium rhizogenes, tạo điều kiện cho việc nuôi nhân quy mô lớn sinh khối nhằmthu hoạt chất phục vụ ngành mỹ phẩm và y dược Đến năm 2015, ứng dung và công đãtập trung vào công nghệ nuôi cấy mô các với đề tài “Nghiên cứu một số giải pháp kỹthuật Công nghệ cao nhằm nâng cao hiệu quả trong nuôi cây mô”, sau thời gian nghiêncứu đã thu được như kết quả như: đã chế tạo hệ thống chiếu sáng thông minh sử dụngđèn LED trong nhân giống cây đảng sâm (Codonopsis Javanica) bằng phương phápnuôi cay mô quy mô thí nghiệm Hoàn chỉnh quy trình công nghệ sản xuất cây giốngĐảng sâm (Codonopsis Javanica) bằng phương pháp nuôi cấy mô công nghệ cao quy

mô thí nghiệm (Cục thông tin KH&CN quốc gia, 2020)

1.3 Nhân giống in vitro

1.3.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bao thực vật là phương pháp nuôi cấy in vitro mô hoặc tế bao

đã tách rời ra khỏi cơ thể thực vật trong môi trường thích hợp dé chúng trở lại trangthái chưa phân chia tế bào và biệt hoá thành mô, cơ quan, phát triển thành cây con mới.Tất cả mọi tế bào của một cơ thẻ thực vật đều có tính toàn năng, nghĩa là chứa bộ gen

y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thé đều có khả năng tổng hợp những loạiprotein- enzym giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡng trong môi trường thích hợpđều có thê phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng giống hệt cây ban đầu và ra hoa,kết quả bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.3.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Theo Nickell (1973) phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục đượcnhiều trở ngại mà phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những ưu điểm

chính:

- Có hệ số nhân rất cao, rút ngắn thời gian đưa 1 giống mới vào sản xuất đại trà

- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển

và năng suât cao.

- Tạo được dòng thuần của cây tạp hóa.

- Tạo được cây có genotype mới (đa bội, đơn bội).

- Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen.

- Có khả năng sản xuất quanh năm

- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhấtđịnh hoặc hạt nảy mam kém

Nhược điểm:

Phương pháp nuôi cấy in vitro đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nênchỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương phápkhác Ngoài ra, phương pháp này còn có những bat lợi sau:

+ Mặc dù số lượng cây giống thu được có thé rất cao nhưng cây con có kích thướcnhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

+ Cây có thé có những đặc tính không mong muốn

+ Khả năng tạo đột biến tăng

+ Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bàonhiều lần

+ Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt

+ Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốcghép trong nghề trồng cây ăn qua, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ

+ Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

+ Bao quản và lưu g1ữ các tập đoàn giông nhân giông vô tính và các loài giao phân

trong ngân hàng gen.

1.3.2 Quy trình nuôi cấy in vitro

Theo Nguyễn Van Ay (2019) nuôi cay mô gồm 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Chọn cây me dé lây mẫu thường là cây ưu việt, khỏe mạnh, đảm bảo sạch bệnh và

có giá trị kinh tê cao Chọn cơ quan dé lay mau thường là chôi non, đoạn thân, đoạn than

có choi ngủ, hoa non, lá non Mô được chon dé nuôi cây mô là các mô có khả năng tái

sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và én định

Tùy vào điều kiện mà giai đoạn này có thể kéo dai từ 3 — 6 tháng

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu (nuôi cấy khởi động):

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Trong nuôi cay mô, khửtrùng mẫu cấy là rất quan trọng nhằm đảm bảo mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, tỷ lệsong cao, mẫu tồn tại và sinh trưởng tốt Thông thường sử dụng phương pháp nhiệt, lọc,hóa chất và một số phương pháp khác để khử trùng mẫu cấy

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôicấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thé nhân giống Vật liệu nuôicấy là các thé chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thê chdi, đôi khinồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điềukiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh.

Đây là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có đầy đủ lá, thân, rễ để chuẩn bị chuyền ravườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để năng cao sức sống khi ra môi trường bìnhthường Các chất có tác dụng tạo chéi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thíchquá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy khác với điều kiện tự nhiên bên ngoài, đây là mộtbước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vàonhiều yếu tố, hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mau, kiểu ditruyền.

Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Đề đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cầnđảm bảo một số yêu cầu về tiêu chuẩn hình thái nhất định như số lá, số rễ, chiều cao cây.Cây con đã ra rễ được lay khoi éng nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi

có bóng râm, độ âm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu

thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thé tăng cường độ chiếu sáng và hạ âmđộ.

1.4 Chất khử trùng mẫu và một số chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô

1.4.1 Chất khử trùng mẫu

Natri hypochlorite (NaOCl), được tìm thấy trong chat giặt tây, khoảng 5,25% dungdịch Thông thường, chất giặt tây được pha loãng trong nước đề đạt được nồng độ 5 -25% Thời gian khử trùng thường từ 5 đến 30 phút, tiếp theo là 3 - 5 lần rửa lại bằngnước vô trùng Lời khuyên của David Constantine là điều chỉnh độ pH của thuốc tâyđến khoảng pH 7 Quy trình là phải chuẩn bị thuốc tây pha loãng mới và điều chỉnh pH

7 bằng 5M HCI Clo sẽ giảm bay hơn nhanh hơn ở pH thấp hơn

Thủy ngân clorua (HgC]›) là một hóa chat rất nguy hiểm mà thường được báo cáo

là được sử dụng như là một chất tây cục bộ Thompson và ctv (2009) so sánh thủy ngânclorua ở 0,2% với thuốc tay gia đình với độ pha loãng 1:3 trong nước Họ tìm thay cảhai đều giống nhau trong việc loại bỏ vi sinh vật, nhưng chất tây gia đình cho kết quảchồi phát triển tốt hơn Nhóm tác giả cũng chỉ ra sự độc hại khi sử dụng thủy ngânclorua Chỉ đơn giản là tùy vào mẫu đề sử dụng hợp chất này như một chất khử trùng bềmặt; tuy nhiên, có rất nhiều tài liệu tham khảo trích dẫn sử dụng chất này đề khử trùngtrong nuôi cấy in vitro Theo bảng chỉ dẫn an toàn hóa chất được tim thấy trên Internet,HgCl2 chi được sử dụng khi nhân viên được bảo vệ bằng kính bảo hộ, tạp dé, mặt nạphòng hơi độc và găng tay HgCl› có tác dụng mãn tính trên người, bao gồm hoạt độngnhư một chất gây ung thư, gây đột biến đối với tế bào soma của động vật có vú, độc tốtrong hệ thống sinh sản của phụ nữ và gây tôn thương não, hệ thống thần kinh ngoại vi

và hệ thần kinh trung ương, da và mắt Nó rất nguy hiểm trong trường hợp tiếp xúc với

da và ăn mòn mắt, và phối nếu hít phải; chăm sóc y tế ngay lập tức khi bị phơi nhiễm

Xử lý an toàn HgCh sau khi chất này được sử dung là một van dé quan trọng khác

1.4.2 Một số chất ĐHST trong nuôi cấy mô

Các chất ĐHST thực vật là những chất hữu cơ khác với những chất dinh dưỡng,với một hàm lượng nhỏ kích thích, ức chế hoặc bổ sung bat kì quá trình sinh lý của thựcvật Chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích về độ vượt qua mức kích thích tối

11

đa sẽ gây ảnh hưởng ức chế (Nguyễn Minh Chơn, 2004) Mặc dù chúng không tham giatrực tiếp vào quá trình trao đôi chất, nhưng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng và pháttriển của cây.

Auxin

Auxin là một chất có nhân Idol, có công thức hóa hoc là CioH9O2N, Auxin tự nhiênđược tìm thay ở nhiều thực vật là indol axetic acid (IAA) IAA có các dẫn xuất là 1-

Naphthalene axetic acid (NAA) và 2,4 - Dichlorophenoxyaxetic acid (2,4D).

NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một Auxin nhân tao có hoạttính mạnh hon auxin tự nhiên IAA Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non(

chồi, lá đang phát triển), trong hạt được hình thành, trong hạt nảy mam (Trịnh Xuân Vũ

va ctv, 1976).

Ung dung:

- Trong nuôi cay mô, Auxin (IBA va NAA) cũng có tác dụng tao rễ tốt

- NAA (Auxin tông hợp ø-NAA 99%) là chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tácdụng ở phô rộng, thúc đây sự phân chia tế bào và hình thành rễ nhánh, rễ, lá, dùng détăng nhanh tốc độ giâm trồng va được sử dung rộng rãi trong việc nhân giống cây nông

nghiệp, lâm nghiệp.

- Dé kéo dai sự chín của quả, bảo quản qua lâu, sử dung dung dịch NAA (10 — 20ppm)

- Dé tăng đậu quả, tăng sinh trưởng của qua và tạo quả không hạt, người ta xử lý

Auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4 - Dichlorophenoxyaxetic acid (2,4 - D) 10 ppm cho

một số cây trồng như cà chua, cam, chanh

Do đó, Cytokinin có ham lượng cao nhất ở phôi, quả non, rễ (Trịnh Xuân Vũ và ctv,

1976).

Vai trò sinh học và ứng dụng:

- Cytokinin kích thích sự phát triển mầm hoa

- Cytokinin cảm ứng hình thành chôi cây từ mô sẹo nuôi cây, duy trì sự trẻ hóa củacác cơ quan và loại bỏ ưu thé ngọn cũng như hạn chế sự phát triển của rễ

- Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (Thidiazuron),

BA (Benzyl adenine), BAP (Benzyl-amino-purine), Kinetin (6 — furfuryl amino purine)

va Cytokinin tự nhiên trong nước dita được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tao chdi

Phương pháp vô trùng

Mau có chứa ít hay nhiều vi khuẩn, nam tùy theo sự tiếp xúc của chúng với môitrường Dé loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi mô nuôi cấy thì phương pháp thông dụng hiện nay

là dùng các hóa chat có hoạt tính diét khuẩn và nam vi khuẩn

Khả năng tiêu diệt nam, vi khuẩn của hóa chat vô trùng phụ thuộc vào nồng độ,thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng trên bề mặt nuôi cấy Đề tăng hiệu quảthì người ta có thé ngâm mẫu vào ethanol 70 - 80% trong 30 giây, sau đó mới xử lí vớidung dịch diệt khuẩn Với các mẫu quá bân thì phải rửa kỹ bằng nước xà phòng và phải

dé dưới vòi nước chảy từ 20 - 30 phút, sẽ có tác dung làm giảm đáng ké hệ vi khuẩn

khỏi mâu cây.

13

Tác nhân vô trùng ngoài diệt nam, vi khuẩn còn ảnh hưởng tới mô cấy Vì vậy,chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và sự man cảm của mẫu (NgôXuân Bình, 2010).

Môi trường nuôi cay

Thành phan môi trường nuôi cay mô thực vat thay đổi tùy theo loài, bộ phận vàmục đích nuôi cấy, vì vậy thành phần của môi trường là khác nhau Thành phần môitrường còn thay đôi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cây vàmục đích nuôi cay như: duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mam hoặc tái sinh câyhoàn chỉnh (Ngô Xuân Bình, 2010).

Mặc dù có sự đa dạng vê thành phân và nông độ các chât, nhưng tât cả các loại

môi trường nuôi cây đêu gôm có các thành phân sau: Các loại muôi khoáng, nguôn cacbon, vitamin, các chat điêu tiệt sinh trưởng, các nhóm chat bô sung, chat độn (Vũ

Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm và ctv, 2013)

Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô - tế bào

thực vật được chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm da lượng và nhóm vi

lượng.

- Các nguyên tố đa lượng:

Nitơ (N): thường được sử dụng ở hai dạng nitrat (NO3-) hoặc muối amoni (NH4+)riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau

Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4?

Photpho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về photpho rất cao Chính

vì vậy photpho là một nguyên tố cần thiết của môi trojong và thường được đưa vào môi

trường ở dạng ortophotphat hoặc đường photphat Ngoài ra khi photpho ở dạng H2PO4

và HPOs- còn có tác dụng như một hệ thống đệm làm 6n định pH của môi trường trongquá trình nuôi cấy

- Các nguyên tô vi lượng: ngoài các nguyên tố khoáng đa lượng, trong môi trườngcòn cần các nguyên tố vi lương là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co

Nguôn cacbon

Hau hêt các mô nuôi cây là di dưỡng, không có khả năng tông hợp cacbon Vi vậy

việc đưa vào môi trường nuôi cây nguôn cacbon hữu cơ là điêu kiện bat buộc Trong phân lớn các môi trường, nguôn cacbon và năng lượng chủ yêu là saccarose và glucose

là nguồn cacbon tốt nhất Ở một số mô thi có thé dùng mantose, fructose va galactose

Vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cay in vitro co kha nang tự tonghợp được hau hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng do đó phải bổ sungthêm vào môi trường một số vitamin, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B như vitamin

BI, B3, B5, Bó, axit nicotinic, mesoinosit Vitamin BI được coi là vitamin thiết yếu đốivới sự sinh trưởng của tế bào thực vật (RILEY,P S va ctv, 1972)

Các nhóm chat chat bé sung

Bên cạnh các chat điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dung nhiều dung dich hữu

cơ phức tạp có thành phần không xác định như: nước dừa, dịch chiết nắm men nhằmtăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy

Trong nuôi cấy có trường hợp người ta sử dụng cả than hoạt tính như một chất phụgia, kết quả nghiên cứu của Fridborg và cộng tác viên (1978) cho thấy than hoạt tính cótác dụng hap thụ các chất tiết ra từ mô cấy, vỏ bao phan và làm tăng hiệu suất sinh phôi

Chất độn (thạch - agar)

Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường Theo nghiên cứucủa Bhojwani và Razdan (1983), khi nồng độ của agar cao, môi trường trở nên cứng, sựkhuếch tán của các chất dinh dưỡng như hấp thụ của mô gặp khó khăn Đa số nuôi cấy

phôi được thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào loài cây ma sử dụng cho phù hợp.

Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ

bộ

Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển ở các loài là không như nhau.Thực tế nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ được duy tri, ít biến déi, thường

Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500 lux được dùng phô biến cho nhiều loại mô

Giá trị pH của môi trường

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận cácdinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy, đối với mỗi loại môi trường nhất định vàđối với từng trường hợp cụ thê của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường vớimức 6n định ban đầu Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng va phát triển

ở nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,0 - 6,0 Khi pH thấp sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolosedẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa của các tế bào trong mônuôi cấy

1.6 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Dạ yến thảo

Trên thế giới

- Zhang Hong (2008) đã nghiên cứu nhân giống in vitro Dạ yến thảo kết quả chothấy MS + BA 2,0 mg/l có tac dụng tốt nhất đối với cảm ứng tạo callus, môi trường nhânnhanh thích hợp nhất là MS + BA 1,0 mg/l + NAA 0,1 mg/l và môi trường thích hợpnhất của rễ là 1/2MS + NAA 0,1 mg/l

- Zhou Rui-jin va ctv (2009) đã nghiên cứu nhân giống in vitro Dạ yến thảo kếtquả cho thấy môi trường thích hợp nhất cho nhân chồi MS bổ sung 0,6 mg/l BA + 0,3mg/l IBA, hệ số nhân chồi dat 5 lần

- Theo kết quả nghiên cứu của Hassan và ctv (2010) trong thí nghiệm nhân chồithì số chồi Dạ yên thảo trung bình cao nhất với môi trường bé sung BA 0,8 mg/l và NAA

0,1 mg/l Đối với thí nghiệm tái sinh chồi từ mẫu cấy lá của hoa Dạ yến thao thì tỉ lệchồi được tái sinh là 45% đã được quan sát trong môi trường MS có b6 sung BA 2,0mg/l.

- Wei Shugin (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro Da yến thảo kết quả chothấy môi trường MS + NAA 0,5 mg/l + BA 0,3 mg/l + agar 8 g/l + sucrose 30 g/l thíchhợp nhất cho nhân chéi Môi trường ra rễ thích hợp là 0,5 mg/I NAA

Ở Việt Nam

- Phạm Văn Lộc (2010) đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây Dạ yến thảo kết quảcho thấy mẫu lá được khử trùng bằng javel với nồng độ 40% Môi trường MS bồ sung1,5 mg/l BA thích hợp nhất cho quá trình hình thành chdi từ lá Ở nồng độ 1,0 mg/l 2,4-D cho tỷ lệ tao mô sẹo cao nhất Môi trường MS có bồ sung 0,8 mg/l BA tốt nhất détái sinh chồi Môi trường MS có bồ sung 0,1 mg/l GA3 thích hợp dé tăng trưởng chồi.Môi trường MS + 0,8 mg/l IBA thích hợp dé tạo rễ

- Theo Tran Quốc cường (2011), môi trường MS có bồ sung BA 2,0 mg/l NAA 0,5mg/1 cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá tốt là 88,9% và cho số chồi cao (4 chồi) Môi trường

MS có bé sung TDZ 0,2 mg/l cho ty lệ chỗi tái sinh từ lá dat 100%, số chdi tái sinh cao

nhât với 9,9 choi, chiêu cao chối cao nhât là 2,3 cm.

- Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thùy Vân (2015) đã cho thấy khi xử lý mẫu

sơ bộ dưới vòi nước sạch, rửa bằng cồn 70% trong 2 phút, lắc mẫu với Javen 5% trong

15 phút, rửa lại bằng nước cất 2-3 lần, làm khô mẫu trên giấy lọc khử trùng cho hiệuquả khử trùng đạt 38%, môi trường MS + 30 g/l đường saccarose + 8 g/l agar + Img/]BAP với hệ số nhân chi là 103

- Theo kết quả nghiên cứu của Bui Thị cúc và ctv (2017), môi trường MS có bổsung 30 g/l succrose, 6g/1 agar, 0,75 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA với hệ số nhân chồi đạt

73,11 lần, chiều cao trung bình đạt 2,63cm sau 5 tuần nuôi cay.

- Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tiến Long va ctv (2021), môi trường nhânnhanh chỗi tốt nhất là MS + 1,0 mg/l BA + 0,2 mg/l IBA + 6,5 g agar/1 + 30 g sacarose/l(số chéi trung bình/mẫu đạt 19,53)

iW)

Dé bổ sung thêm nguồn tài liệu tham khảo và đưa ra một quy trình kỹ thuật nhângiống cây hoa Dạ yến thảo chung mang tính khái quát ứng dụng rộng rãi, đề tài: “Thiếtlập quy trình nuôi cấy in vitro cây dạ yến thảo (Petunia hybrida)” được thực hiện.

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung thí nghiệm

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: tháng 2/2023 đến tháng 6/2023

- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Di truyền — Chọn giốngcây trồng Trại thực nghiệm Khoa Nông Học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố

2.3.2 Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị: Cân kĩ thuật, máy đo pH, ndi hap khử trùng, tủ lạnh, máy cất nước hailần, buồng cấy vô trùng, cân phân tích, tủ sấy, máy khuấy gia từ nhiệt

Dụng cụ: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, chai thủy tinh (loại 100 ml, 250

ml, 500 ml), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bac, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo

2.3.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tôi

Nhiệt độ: 25 + 2°C

Độ am: 50 - 60 %

Cường độ ánh sáng: 2000 lux.

2.3.4 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm

+ Môi trường nuôi cay: Môi trường dinh dưỡng khoáng MS cải tiến theo nghiêncứu của Murashige và Skoog (1962), có bé sung các chất điều hòa sinh trưởng theo bảng

sau:

Bảng 2.1 Thành phần các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm.

Thành Phần Nông Độ (mg/l)Khoáng đa lượng NH4NO3 1650

KI 0,83 NazMo04.2H20 0,25

CuSO4.5H20 0,025 CoCl2.6H20 0,025

Sat EDTA Naz.EDTA 37,3

FeSO4.7H20 27,8 Vitamin Myo-Inositol 100

Thiamin (Bi) 0,5 Nicotinic acid 0,5

Pyridoxine (Be) 0,5 Glycine 3

Môi trường được điều chỉnh về pH=5,8 + 0,05 (bằng NaOH IN và HCI IN) trướckhi hap khử trùng bằng nồi hấp khử trùng 6 121°C, 1 atm trong 15 phút

21

2.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng

- BA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic — Canada)

- IBA độ tinh khiết > 98% (hãng BioBasic — Canada)

- NAA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic — Canada)

Môi trường nền: Môi trường được sử dụng là môi trường MS có bồ sung 8g/1

agar, 30ø/1 đường saccarose.

Bồ trí thí nghiệm

Thí nghiệm hai yếu tố gồm 9 nghiệm thức được bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫunhiên (Completely Randomized Degign), ba lần lặp lại, trong đó:

Yếu tô A: nồng độ NaOCl (5%; 7%; 9%)

Yếu tổ B: thời gian rửa mẫu (5 phút; 10 phút; 15 phút)

Bang 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm 1

Quy mô thí nghiệm

Rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước máy, sau đó rửa trong dung dịch nước xà phòng

và được rửa lại bằng nước cất 2-3 lần, đưa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng

Trong tủ cấy vô trùng:

BI: Rửa chồi bang nước cất vô trùng

B2: Lắc etanol 70% (v/v) trong 1 phút

B3: Rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng

B4: Lắc mẫu bằng hóa chất khử trùng với nồng độ và thời gian theo thí nghiệm và

2 giọt Tween - 20 bổ sung/100ml nước cất dé tăng hiệu quả khử trùng

B5: Rửa lại 3 - 5 lần bằng nước cắt vô trùng

B6: Mẫu cấy sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ được cắt bỏ bề mặt tiếp xúcvới chất khử trùng, vì các tế bào ở bề mặt tiếp xúc dưới tác dụng của chất khử trùngmạnh dé bị chết Dé dam bảo cho chdi có thé hap thụ chất dinh dưỡng từ môi trường thìthao tác này rất quan trọng Sau khi cắt tiến hành thắm khô mẫu bằng giấy thâm, tiếptục cắt các đoạn chồi thành các đoạn ngắn chứa mắt ngủ, mỗi đoạn dai 1,5 cm, cay lênmôi trường cơ bản MS có bổ sung 8g/1 agar, 30g/1 đường saccarose dé mẫu cấy tái sinhchổi vào bình nuôi cấy thể tích 50ml

Đề mẫu nuôi cấy lên giàn nuôi cấy theo dõi tỉ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết, tỉ lệmẫu nhiễm sau mỗi 7 ngày nuôi cấy, theo dõi trong 21 ngày Chỉ tiêu theo dõi gồm:

- Tỷ lệ mẫu sóng (%): (Số mẫu sống/ tong số mẫu cấy trong thí nghiệm) x 100

- Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Số mẫu chết/ tổng số mẫu cấy trong thí nghiệm) x 100

- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Số mẫu nhiễm/ tổng số mẫu cấy trong thí nghiệm) x 100

(*) Mẫu sông: là mau vân còn giữ được màu xanh lục, không bi ngã màu hoặc

phân hủy và không nhiễm

(*) Mẫu chết: là mẫu có dấu hiệu bị phân hủy nhưng không nhiễm

(*) Mẫu nhiễm: là mẫu có các biểu hiện xuất hiện các sợi nam mốc, các dịch khuẩn,

có dấu hiệu bị phân hủy

(*)Két qua của TNI là tiền đề để thực hiện TN2

2.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh cụmchỗồi từ đốt thân cây Dạ yến thao in vitro

Mục tiêu: xác định được nồng độ BA, IBA thích hợp cho quá trình nhân nhanhchéi của mẫu cây Dạ yến thảo

Chuẩn bị vật liệu: Sử dụng kết qua ở thí nghiệm 1 dé chuẩn bi vật liệu cho thí

Môi trường nền: môi trường được sử dụng là môi trường MS được bồ sung 8g/1agar, 30 g/l đường saccarose, BA và IBA được bồ sung theo nghiệm thức

- Tổng số mẫu: 2 x 13 x 9 x 3 = 702 mẫu

Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi:

Cay mẫu vào môi trường MS có bổ sung BA và IBA theo từng nghiệm thức, theo dõicác chỉ tiêu về chỗồi sau khi nuôi cấy, 7 ngày 1 lần, theo dõi trong 6 tuần, 5 chai, 10mẫu/NT, các chỉ tiêu:

- Hệ số nhân chéi = Tổng số chồi tạo thành/ tổng số chồi đưa vào

- Chiều cao chéi (cm): đo từ mặt thạch đến điểm cao nhất của chéi bằng thước

đo mẫu

- Số lá/chỗi (lá) = Tổng (số lá/chồi)/ Tổng số chồi khảo sát

- Khối lượng chồi tươi: cân khối lượng chéi sau 42 NSC

(*) Mẫu nảy chéi: là mẫu sau khi tạo mô sẹo và bắt đầu hình thành chồi, có thénhìn thấy chéi bằng mắt thường qua chai cấy

2.4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của mẫucây Dạ yến thảo

Mục tiêu: xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của mẫu cây

Dạ yến thảo

Vật liệu: Chồi được tạo ra từ NT tốt nhất trong TN2 (cao 1,5 cm, có 4— 6 lá) được

sử dụng làm vật liệu nghiên cứu ở TN3.

Zi

Môi trường nền: môi trường được sử dụng là môi trường MS được bồ sung 8g/1agar, 30 g/l đường saccarose, bố sung NAA theo nghiệm thức

Thí nghiệm một yếu tố gồm 5 NT được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với

Hình 2.7 Sơ đồ bó tri thí nghiệm 3

Quy mô thí nghiệm

Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi các chỉ tiêu về chdi sau khi nuôi cấy, 7 ngày 1 lần, theo dõi trong 3 tuần,theo dõi 5 chai, 10 mau/NT, các chỉ tiêu:

- Tỷ lệ ra rễ (%) = (tổng số mau ra rễ/tổng số mẫu cấy) x 100

- Chiều dai rễ (do lần cuối) (cm): đo từ gốc đến chop rễ của rễ dài nhất

- Số ré/chdi (rễ): đếm số rễ phát sinh trên mỗi mẫu cây sau 21 NSC

- Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch đến điểm cao nhất của chồi bằng thước

đo mẫu

- Số 1a/chdi (lá) = Tổng (số 14/chdi)/ Tông số chồi khảo sát

- Chat lượng rễ: Đánh giá cảm quan qua 3 tiêu chí 21 NSC

Rễ xấu: ít rễ, nhỏ ngắn, mảnh, nhiều mô seo

Rễ trung bình: map, ngắn, gốc chồi hình thành ít mô sẹo

Rễ tốt: mập, nhiều rễ, dài, màu trắng đục(*) Rễ: phát triển từ phần cấy vào môi trường mà mắt thường có thê thấy đượcqua mặt chai cấy

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thu thập, tông hợp tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel; phântích phương sai ANOVA và trắc nghiệm phân hạng LSD bằng phần mềm R 4.2

29

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân Dạ yến thảo

Vào mẫu là quy trình quan trọng dẫn đến sự sống và phát triển của mô thực vậttrong in vitro mà việc lựa chon nồng độ chất khử trùng phải đủ lớn để loại bỏ hoàn toànnắm, vi khuân và các tác nhân sinh học ảnh hưởng tới mô thực vật tuy nhiên không đượcphá hủy mô thực vật, tùy từng loại thực vật mà nồng độ chất khử trùng cũng phải khácnhau Chất khử trùng này cần phải dễ sử dụng, ít độc hại và vấn đề chi phí cũng cầnđược quan tâm Do đó, hợp chất natri hybochlorite (NaOCl) được sử dụng dé khảo sáttrong thí nghiệm khử trùng mẫu cây hoa Dạ yến thảo

Đồng thời, thời gian khử trùng cũng cần được quan tâm đến, vì mô thực vật khi

tiép xúc quá lâu với chat khử trùng sẽ bi giảm sức sông hoặc chết.

Thí nghiệm 1 có vai trò quyết định trong nuôi cấy mô tế bào, nếu thí nghiệm khôngthành công thì sẽ không có mẫu vô trùng đề thực hiện các thí nghiệm tiếp theo Vì vậy,thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NaOCl 5%, 7%, 9%, và thời gian khử trùng 5 phút,

10 phút, 15 phút được tiến hành Kết quả thu được như sau, qua bảng 3.1 cho thấy:

Ở thời điểm 7 NSC, đối với các mức nồng độ NaOCl dé khử trùng mau thì tỉ lệsống của mau cây Dạ yến thảo có sự khác biệt có ý nghĩa trong thống kê Sử dụng nồng

độ 5% NaOCl dé khử trùng mẫu cây dạ yến thảo cho tỉ lệ sống trung bình cao nhất là58,2% khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với mức nồng độ 7% NaOCl và 9% NaOCl.Khử trùng mẫu trong 5 phút cho tỉ lệ sống trung bình cao nhất là 58,7% tuy không có

sự khác biệt với thời gian 10 phút nhưng lại có sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê vớikhoảng thời gian 15 phút Sự kết hợp giữa các mức nồng độ NaOCl và thời gian khửtrùng cho các tỉ lệ sống khác nhau và rất có ý nghĩa trong thống kê