Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Quy trình nhân giống in vitro cây hoa triệu chuông (Calibrachoa parviflora)

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn ngẫu nhiên một và hai yếu tô với ba lần lặp lại, nhằm xác định nồng độ NaOCl và thời gian thích hợp cho khử trùngmẫu thân cây hoa triệu chuông,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

QUY TRÌNH NHÂN GIONG IN VITRO CAY HOA

TRIEU CHUONG (Calibrachoa parviflora)

Sinh viên thực hiện: NGUYEN THI THUY VYNgành: Nông học

Niên khóa: 2019 - 2023

Thành phố Hồ Chí Minh, thang 8 năm 2023

QUY TRÌNH NHÂN GIÓNG IN VITRO CAY HOA

TRIỆU CHUONG (Calibrachoa parviflora)

Tac gia:

NGUYEN THI THUY VY

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư ngành Nông học

Giảng viên hướng dẫn:

ThS NGUYEN THỊ THANH DU YEN

Thanh phé H6 Chi Minh

Thang 8/2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho con xin thành kính khắc ghi công ơn sinh thành và đưỡng dụccủa cha mẹ Cảm ơn các anh, chị và những người thân trong gia đình đã luôn động viên và tạo mọi điêu kiện thuận lợi cho con có được ngày hôm nay.

Em xin trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Thị Thanh Duyên, khoa Nông học, trường

Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dan trong suốt quátrình thực hiện khóa luận tốt nghiép

Xin chan thanh cam on:

- Ban giám hiệu trường Dai hoc Nong Lâm Thành phé Hồ Chi Minh

- Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô trong khoa Nông học đã truyền đạt nhữngkiến thức chuyên môn vô cùng bé ích cho em trong suốt thời gian theo học tại trường

- Các thầy cô trong Bộ môn Di truyền chọn giống cây trồng đã tạo điều kiệncho em trong thời gian thực hiện đề tài

- Các bạn cùng làm đề tài trong phòng thí nghiệm và các bạn trong lớpDHI19NHB đã tận tình giúp đỡ trong quá trình tiến hành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, tháng 7, năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy Vy

TÓM TẮT

Đề tài “Quy trình nhân giống in vitro cây hoa triệu chuông (calibrachoaparviflora)” đã được tiên hành tại Bộ môn Di truyền chọn giống cây trồng, khoa Nônghọc, trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh từ tháng 02/2023 đến tháng07/2023 Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn ngẫu nhiên một và hai yếu tô với

ba lần lặp lại, nhằm xác định nồng độ NaOCl và thời gian thích hợp cho khử trùngmẫu thân cây hoa triệu chuông, xác định nồng độ BA, IBA thích hợp cho quá trìnhnhân chéi cây hoa triệu chuông và nồng độ NAA thích hợp cho sự hình thành rễ câyhoa triệu chuông.

Kết quả thu được như sau:

Mẫu thân cây hoa triệu chuông được khử trùng với nồng độ NaOCl 7% trong 7phút, cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất 78,7%

Môi trường MS bồ sung 0,3 mg/l BA va 0,2 mg/l IBA cho kết quả tốt nhất về

hệ số nhân chổi (19,6 lần), chiều cao chồi (1,06 em), số lá/chồi (5,1 14), trọng lượngchéi (3,5 g)

Môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l NAA cho kết quả tốt nhất về chiều cao chồi(2.47 cm), số la/chdi (21 14), tỷ lệ ra rễ (89,3%), chiều đài rễ (5,4 cm), số rễ (22 rễ)

MỤC LỤC

Trang TENH Eee neeenieeen enone GAGEDLAHSSSEEREJESEEESHENGUNSEEEMNIHIPHESMEHEESHBRIIMIBBDSHEESEHESHUHLADHSUSAHESSEESASH0300585/gE2 1 TESOL ATS OD seston ee vet rt era eer rT RS FR PRT 171.70000080 uy iii

Danh sách chữ viết tắt 2-7222 22221221221221221221271221221112111112121111111211221 2e viDanh sách các Dan sossissessssinssioiisiiaS114133566159005104331433943530553154833019138135149441495018439030 030 Vil I8 1iấv và 0 Vili

OL |Đặt VAI 2n 1Mie HỂNhạovecyriroitieeSEGEEIGDENHGIIGUEDDNGGHGHDEEIGEHGIGSEIGGRDIEHGGOREGIRGRNGEIGSISGRUSSii,na 2Tiện g te Hỗ TÃ sasesaeeeeneesoietisinHNGGAS020001900060008)800.G09)0000/00090 00000010010000000 0300000000000 xesssl 2

| eT 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 2- 2 eceeesseeseeeseesesssessesseesseeseenseeees 31.1 So luge vé cay hoa 6090 N6 31.1.1 Phần loại cây hoa triệu ChUỐNỔ sáseccsiessssi6610 106016 6018045 zosusanseancxeuesaswsiasseeeren.aess 31.1.2 Nguồn gốc cây hoa triệu chuông - 2-2 22 ©S+SE+SE2SE£EE2EE2EE22EEEEEEErEErrxrrxrrei 31.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây hoa triệu chuông 22 2 2+2 +s+z+zzz++zz+2 31.1.4 Điều kiện sinh trưởng 2- 2 2S1+21+2E2EE£EE92122122121221121212121212121 212cc 41.2 Dinh nghĩa nuôi cây HN 10 ii Ch 43 ÔỎ 41.3 Lịch sử phát triển nuôi cấy mÔ -2222222+22+22222222222227227271121121111111111222222 cee 51.3.1 Lịch sử nuôi cây mô trên thé giới 2-22 2+2222E£2EE22E22EE2EE222122122222212222222ee 51.3.2 Lịch sử nuôi cấy mô ở Việt Nam ooo ccc cccccesceeseseesessesscsessesetseseesseseseesessneseeeesees 81.4 Ung dung kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nghiên cứu và sản xuất 9

né tri ce | een er 101.5.1 Quy trình thực hiện nuôi cay THỊ D HỖ: gạn than SRGELSNSSOSTSBENHAGHESIGSDTXEENNGEEGGENSRSS.E08203Sg088 101.5.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vifro - 121.6 Một số chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô -c22222+++++:z22222222rrt 131.7 Nghiên cứu về nôi cấy mô cây hoa triệu chuông 222222+++++2222222222ZEttrrrree 14

Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 162.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 2 22122222222222222222222222.72221211122127222 0e 162:7 Vat WG THỈHBHIỆTTTsuscseisinnisesöaTESSGEAIEGISOIEDDEHGSEHXNGEIERES.SEES/GSSIGDRSRUIHESRSHISS088 162.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2: 2¿+2s222222122122212212112212211211221211221211211 21c ee l6

2.3 Di6u kiGn nUGi sa 0077 L 162.4 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm -222222222222EEEEEEE2+222222222222227772 2222222 162.5 BG tri thi 0) N -3'1 ÔÒỎ 18Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân câyhoa Ma 089/01/0 TT T 18Thí nghiệm 2: Anh hưởng của BA va IBA đến quá trình nhân chồi cây hoa triệu

tin Plea Tm{DfssseaestiosdiedibstiotrettbinoggigcagiaGSGISSIIOHESESIGIAGGNSSI/700.0300 10/01Q0500800 00000) 20

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ cây hoa triệu chuông

tO MAU COE occ B 22.6 Phương pháp xử li va thống kê số liệu 222-122+22222EEE2tr22222EEEEEtrrrrrrvrrrrrrrrrv 24Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN - 2-5222S22E22E22E22E222222222222222222e2 253.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân cây hoa triệu chuông 253.2 Ảnh hưởng của BA va IBA đến quá trình nhân chồi cây hoa triệu chuông từ mẫu thân 313.3 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ cây hoa triệu chuông từ mẫu chồi 38KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ - 22222 2222222222122212221221122112211 2211221221221 xe 45TÀI LIỆU THAM KHÁO Ặ 20-20210022 21202222222011 1e 46Cte 47

DANH SÁCH CHU VIET TAT

ANOVA Analysis of variance (Phân tích phương sa1)

BA 6 - benzyladenine

ctv Cộng tác viên

CV Hệ số biến động ( Coeficient of Variation)IBA Indo - 3 — butyric acid

MS Musrashige and Skoog, 1962

NaOCl Natri hypoclorite

NSC Ngày sau cay

NAA 1 — Naphthalene acetic acid

NT Nghiệm thức

DANH SÁCH CAC BANG

TrangBảng 2.1 Thanh phan của các môi trường sử dụng trong thí nghiệm T7Bảng 2.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm Ì - 5 55555 +S2£+£+*£+vE+eeeeeeerrs 19 Bảng 2.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 2 . 55-52 5-*++<£++££+eee>eereeezers 22Bảng 3.1a Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân câyhoa triéu chudng 000015)60021225575 26Bang 3.1b Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân câyhoa trigu chu6ng 00809011 28Bảng 3.1c Anh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân câyhoa triệu chuông ở 21 NSC cac ningggg 2g Hi d1 6116104115 0108185500384340.008538 29Bảng 3.2a Ảnh hưởng của BA va IBA đến hệ số nhân chéi hoa triệu chuông qua các thời điểm 32Bảng 3.2b Ảnh hưởng của BA và IBA đến chiều cao chéi (cm) hoa triệu chuông qua

bi Hi TÍĩ THaeeniesnseuignphoaottigGitgGSRGTHINGIGIGGGSNGN(GGQENIRSENGMRNERNRSGSGtGoenaiDlBảng 3.2c Ảnh hưởng của BA và IBA đến số lá/chồi hoa triệu chuông qua các thời điểm 35Bang 3.2d Ảnh hưởng của BA và IBA đến khối lượng chồi (g) hoa triệu chuông thời

CS neeBang 3.3a Ảnh hưởng của NAA đến chiều cao cây (cm) của cây hoa triệu chuông quaeels Ti HỒ ThươơnggggnngannG003000H800300N000100070608082000180003G00G10548000/40830i04.0/0903806600agsg2TổBảng 3.3b Ảnh hưởng của NAA đến số lá/chồi (14) cây hoa triệu chuông qua các thời diém 40

Bảng 3.3c Ảnh hưởng của NAA đến tỷ lệ ra rễ (%) cây hoa triệu chuông qua các thời điểm 41

Bảng 3.3d Ảnh hưởng của NAA đến chiều đài rễ (cm), số rễ (rễ/cây) cây hoa triệu chuông ở

I00Ể 560 42

Bảng PL1 Số liệu chuyên đổi AresinVx tỷ lệ mẫu sông (%) cây hoa triệu chuông 52Bang PL2 Số liệu chuyển đổi ArcsinVx tỷ lệ mẫu nhiễm (%) cây hoa triệu chuông 53Bảng PL3 Số liệu chuyển đổi ArcsinVx tỷ lệ mẫu chết (%) cây hoa triệu chuông 54Bảng PL4 Số liệu chuyên đổi ArcsinVx tỷ lệ ra rễ (%) cây hoa triệu chuông 55

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1:1 Cay hoa triệu,ChUÔH sassscesessiisanisbiesikabrnasseeeskkA001540404138331101104343114883402810508 3

Hình 2.1 Vật liệu khởi đầu: đoạn thân mang mắt ngủ cắt bỏ lá non - 18Hình 2.2 Doan thân mang mắt ngủ đã được khử trùng -22- 2 55z52+z5+2 18Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm l 22 222222222E22E2212212221221221122121222 2e 19Hình.2.4 Vật Tiệu thĩnrphTiETt2:seecosezeosseebsoninibidfbiBgioiĐiRSRitgbdosg4200RG8SỂ09)5.010500 230g 20)gÁ, 21Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 -2- 2-2 SS+S222E2EE2EE2EE2EE2212252212212232222222 2222 22Hình 2.6 Vật liệu thí nghiệm 3 - - G22 2222223122318 2211 353182115211 11 11x cư, 23

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 -2- 2-2522 2SSE£EE2EE£EEEEE2EEEEEEEEEzErrrzree 23

Hình 3.1 Chỗi hoa triệu chuông thời điểm 42 NSC 22 2222222222z222z22zzz+2 38Hình 3.2 Các nghiệm thức ở thời điểm 21 INSC -2-©22222E22E22E22E2EZzezze2 43Hình 3.3 Quy trình nhân giống in vitro cây hoa triệu chuông -2- 2 2 s=zz54 44Hình PL1 Cây hoa triệu chuông dùng làm thí nghiệm - - 55 525252 *=++<<+>>+ 47 Hitt, PLZ: Our 0 Ca Sei os sce spars ave so 01428214461 85g13 S88565SuL4G,510XE//88.8L850138316630-18ui88 628.38 g 47Hình PL3 Mẫu nhiễm nam của thí nghiệm l - 2-2 2¿+22EE+2E222z+ZEz+zzzz+2 48Hình PL4 Quần vết nhiễm khuẩn ở thí nghiệm I - 2-2 222E2£E+2E+2E2Z225e2 48Hình PL5 Mẫu chết thí nghiệm l 2-2 2+SS+SE£EE2EE+2E2EE22E22E22E225222222222222e2 48

Hình PL6 Mẫu sạch ở nghiệm thức 5 sau 14 ngày khử trùng - 5-52 48 Hình PL7 Mẫu sạch ở nghiệm thức 5 sau 21 ngày khử trùng - 25+ 48 Hình PL8 Qui mồ thí nehiéni 2: ecaceeeiniisberonieeeo easton wget tac tweeters 49Hình PL9 Cụm chdi cây hoa triệu chuông ở nghiệm thức 4 qua từng giai đoạn 49Hình PL10 Qui mô thí nghiệm 3 - 2 - 2 2232222522323 22E2232E222 253212212121 rer 50Hình PL11 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ cây hoa triệu chuông 50Hinh PL12 Cây hoa triệu chuông 21 NSC - . cece eeeeeeeeceeeeseeeeeeeeseeeeeees 51BlirhTLTE Kiếm HỖ 0 cna cect et er cpt enn meni ZỊ

MỞ ĐẦUĐặt van đề

Hoa triệu chuông (Calibrachoa parviflora) thuộc họ Cà (Solanacea), có nguồngốc từ Nam Mỹ, Mexico và Tây Nam Hoa Kỳ (Fregonezi, J N., et al., 2013) Hoatriệu chuông mang một vẻ dep tươi sáng Loại hoa này có thé được xem như là món

qua tặng quý giá với ý nghĩa là mang đến hạnh phúc, may mắn cho người thân trong

gia đình Vẻ đẹp rực rỡ thu hút của hoa triệu chuông khiến triệu chuông được mệnhdanh là nữ hoàng hoa ban công, loài hoa rất dé trưng bày trang trí làm nổi bật khônggian, được rat nhiêu người ưa chuộng.

Nhân giống hoa triệu chuông thường từ hạt và giâm cành Tuy nhiên phươngpháp nhân giống này có thời gian kéo dài và chất lượng cây giống tạo ra không đồngđều Hạt giống hoa rất nhỏ, từ lúc gieo đến nảy mầm khoảng 2 - 3 tuần, tỷ lệ nảy mầmtương đối thấp (50 - 60%), giá thành hạt giống tương đối cao Giâm cành có hệ sốnhân thấp, sức sống yếu hơn gieo hạt Hiện nay để giảm thiểu và khắc phục nhữngkhuyết điểm của nhân giống bang hạt và giâm cành thì việc ứng dung công nghệ invitro nhằm dé sản xuất ra giống cây con sạch, đồng loạt và số lượng lớn trong thờigian ngắn rất được phô biến (Hà Thị Lan Anh, 2018)

Trong quy trình nhân giống bằng phương pháp in vitro, trải qua 5 giai đoạnchính gồm: khử trùng mô mẫu cấy, tái sinh mẫu nuôi cấy, nhân nhanh, tạo cây hoànchỉnh, đưa cây con ra đất (Trần Thị Dung, 2003)

Hiện nay để khử trùng mẫu các chất khử trùng thường được sử dụng như thủyngân clorua (HgC]›), nước oxy già (H202) hoặc Javen Trong đó Javen có chứa Natrihypocloric (NaOCl) là hoạt chất khử trùng ít gây ton thương đến mô thực vật, dé phânhủy và ít gây ảnh hưởng đến môi trường

Trong các chất điều hòa sinh trưởng thì BA là một cytokinin cần thiết cho sựnhân nhanh chéi in vitro, IBA và NAA là auxin tổng hợp có hoạt tính sinh học mạnh,thường được sử dụng kết hợp với cytokinin sử dụng cho việc nhân chồi, NAA còn

dùng cho việc tạo rễ Tuy nhiên, yêu cầu đối với các chất này thay đổi theo loài, loại

mô, nên cần tiễn hành thí nghiệm dé tìm ra nồng độ thích hợp

Nhìn chung, chưa có nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây hoa triệuchuông ở Việt Nam Vì vậy dé tài “Quy trình nhân giống in vitro cây hoa triệuchuông (calibrachoa parviflora)” đã được thực hiện, để tìm ra nồng độ chất khửtrùng, thời gian khử trùng và chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho nhân giống invitro cây hoa triệu chuông.

Mục tiêu

Xác định nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng mauthân cây hoa triệu chuông.

Xác định nồng độ BA, IBA thích hợp cho khả năng nhân chồi cây hoa triệu

chuông từ mẫu thân

Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho khả năng tạo rễ của cây hoa triệuchuông từ mẫu chồi

Yêu cầu của đề tài

- Bồ trí thí nghiệm theo đúng quy phạm

- Số liệu ghi nhận được xử lý và phân tích thống kê

Giới hạn của đề tài

Chỉ làm trên một giống cây hoa triệu chuông và không thực hiện ra vườn ươmtrong thời gian từ tháng 02/2023 đến tháng 07/2023

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây hoa triệu chuông

1.1.1 Phân loại cầy hoa triệu chuông

Chi: Calibrachoa (Hà Thị Lan Anh, 2018)

Họ: Solanaceae Hình 1.1 Cây hoa triệu chuông

Tên khoa học: Calibrachoa parviflora Nguồn: Công Ty TNHH Kiến Trúc

1.1.2 Nguồn gốc cây hoa triệu chuông Cảnh Quan Hata, (2022)

Cây hoa triệu chuông có xuất xứ từ Châu Âu, được biết đến vào đầu những năm

1990, là loài hoa mới được nhập nội vào nước ta trong những năm gan đây Tat cả các

giống triệu chuông là giống lai với các giống có nguồn gốc từ Nam Mỹ

Các giống hoa triệu chuông hoang dại đầu tiên được phát hiện ở Brazil có sự đadạng về màu sắc, kích thước và hình dáng hoa Thông qua quá trình lai tạo và chọnlọc, các giống hoa triệu chuông trồng hiện nay có nhiều ưu điểm để phù hợp với thịhiểu của người chơi hoa (Hà Thị Lan Anh, 2018)

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây hoa triệu chuông

Rễ: rễ cây hoa triệu chuông thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiềungang, ở tầng đất mặt từ 10 - 20 em Kích thước các rễ trong bộ rễ chênh lệch nhaukhông nhiều, số rễ tương đối nhiều nên khả năng hút nước và dinh dưỡng của cây rấtmạnh Vì vậy, triệu chuông rat thích hợp trồng trên các loại giá thé tơi xốp, chủ độngđiều chỉnh thành phần dinh dưỡng phù hợp dé kích thích bộ rễ phát triển (Hà Thị LanAnh, 2018).

Thân: cây hoa triệu chuông thuộc loại cây hoa thân thảo rủ có chiều cao từ 10

-50 cm Thân khá cứng, phủ ít lông dính, nhánh cây được phân ra từ các nách lá Trên

thân có các mắt ngủ tiềm sinh ở giữa cuống lá và thân Thân có khả năng tái sinh nên

được sử dụng để nhân giống vô tính

Lá: lá đơn mọc cách trên thân không có lá kèm Phiến lá mềm mỏng, mépkhông có răng cưa, nhỏ, hình thuôn hoặc oval, có màu sắc khác nhau (xanh đậm, xanhnhạt ) tùy giống Mặt trên và mặt dưới lá có lớp lông phủ mịn, gân lá hìnhchân chim.

Hoa: có thể ra hoa quanh năm nếu được chăm sóc tốt Hoa hình chuông, viền

cach hoa có gon sóng Mau sắc hoa đa dạng (trắng, tím, đỏ, hong ) có thé có một

màu hoặc pha trộn giữa các màu Đường kính hoa từ 1 - 2 cm tuy nhiên vô cùng saihoa Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành Cánh đài hợp ởgốc còn lại ở quả, cánh tràng hợp thành ống loe hợp ở đỉnh, nỗi rõ các gân thùy

Quả: quả nang hai mãnh, nhiều hạt

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng

Anh sáng: Triệu chuông ưa sáng hoàn toàn, càng nhiêu nang cây cảng sai hoa.

Nhiệt độ: Mặc dù ưa nắng, tuy nhiên là cây thân thảo bộ rễ ăn nông nên triệu

chuông dễ bị đốt nóng nếu trồng dưới ánh nắng mặt trời gay gắt Nhiệt độ phù hợp vớitriệu chuông từ 15 - 28°C, mùa hè cần che nang hoặc trồng cây dưới giàn lưới Nhiệt

độ cao quá khiến cây xấu yếu, phát triển kém

Độ am: Cây hoa triệu chuông sinh trưởng, phát triển thuận lợi nhất trong điềukiện ẩm độ đất từ 65 - 80%, độ âm không khí từ 60 - 75% Trong thời kỳ nở hoa nếu

độ 4m quá cao gây thối hoa và sâu bệnh phát triển mạnh làm giảm chất lượng hoa và

độ bền của hoa Khi trồng nên sử dụng chậu thoáng và thoát nước tốt (Hà Thị LanAnh, 2018).

1.2 Định nghĩa nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cay mô tế bào thực vật, là phạm tri khái niệm chung cho tất cả các loạinuôi cây nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Bao gồm:

- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

- Nuôi cay co quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phan, noãn chưa thụ tinh

- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

- Nuôi cay m6 seo (callus)

- Nuôi cay tế bao đơn (huyền phù tế bào)

- Nuôi cấy Protoplast: nuôi cấy phần bên trong của tế bào thực vật sau khi tách

vỏ, còn gọi là nuôi cây tê bảo trân.

Nuôi cay mô tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vat in vitro (trong ống nghiệm)

đề phân biệt với các quá trình nuôi cấy cây trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm(Ngô Xuân Bình, 2010).

1.3 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô

1.3.1 Lịch sử nuôi cấy mô trên thé giới

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cay mô và tế bào thé giới đượcbắt đầu từ năm 1902, khi nhà sinh lý thực vật người Đức Gottlieb Haberlandt là ngườiđầu tiên dựa trên thuyết tế bào của Schleiden va Schwann đã đề xuất phương phápnuôi cây tế bào thực vật được công bố trong bai báo nhan đề “Những thực nghiệmnuôi cay tế bào thực vat tách biệt” Lich sử nuôi cay mô có thé chia thành 4 giai đoạn:

Giai đoạn 1

Theo thuyét té bao: moi co thé sinh vat phức tap đều được cấu tao từ những đơn

vị nhỏ là các tế bào Các tế bào riêng rẽ có khả năng tự điều hòa sự sinh trưởng vàphân chia của chính nó, mỗi tế bào riêng biệt đều có tính toàn năng (Totipotent), du ở

10 mức độ phân hóa nào, chúng vẫn có khả năng tái hiện thành một cơ thể hoàn chỉnh.Các tế bao đã phân hóa đang thực hiện các chức phận khác nhau của cơ thé đều mangcác thông tin di truyền có trong tế bào ban dau, đó là tế bào trứng được thụ tinh và lànhững đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lên cơ thể mới Haberlandt cho rằng:

“ Tôi tin tưởng rằng tôi đã không đưa ra một tiên đoán quá táo bạo nếu cho rangbằng cách nuôi cấy, người ta có khả năng tạo thành công các phôi nhân tạo từ các tếbào sinh dưỡng” Ông đã thí nghiệm nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá củamột số cây thuộc lớp một lá mầm như : Erythronium, Tradescantia , tuy nhiên các tế

bào này sống được nhưng không phân chia Sau này người ta tìm ra nguyên nhân củathất bại là do ông đã nuôi cấy những tế bào đã mắt khả năng tái sinh, hơn nữa nhữngcây thuộc lớp 1 lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, môi trường nuôi cấy còn đơngiản và chưa có các chất điều hòa sinh trưởng cần thiết.

Giai đoạn 2

Được bắt đầu vào năm 1934 với công trình của White: ông đã nuôi cấy thànhcông rễ cà chua (Lycopersicum esculanum) trên môi trường lỏng chứa muối khoáng,ølucose và dịch chiết nắm men Năm 1935, Thimann đã phát hiện ra auxin (IAA) trong

mô thực vật, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dung IAA cùng các vitamin bổ sung vào môitrường nuôi cấy và đã thu được kết quả tốt Cũng trong thời gian này, Gautheret (Pháp)

đã nghiên cứu nuôi cay mô tượng tang một số cây thân gồ như Liễu (Salix caprea) vàDương (Populus alba), các mô nuôi cay đã sống được trên môi trường đơn giản nhưngphân chia rất chậm Năm 1939 ông đã sử dụng môi trường nuôicấy có bé sung IAA dénuôi cây mô cà rốt và lần đầu tiên đã tạo được mô sẹo phân chia liên tục Trong nhữngnăm 1940, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp thành

công: NAA, 2,4D và được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong nuôi cay mô cùng với

nước dừa, kết quả nghiên cứu cho thấy chúng có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, thúcđây phân chia tế bào rõ rệt

Năm 1948, Skoog và các cộng sự đã phát hiện ra kinetin và tác dụng kích thích

sự phân chia tế bao, tác dụng của các hooemon kiểm soát dự hình thành chỗi và rễ của

mô sẹo thuốc lá nuôi cấy in vitro Day là những nguyên lý cơ bản điều khiển sự hìnhthành các cơ quan của kỹ thuật nuôi cay mô và tế bao

Giai đoạn 3

Là giai đoạn nghiên cứu sự phân hóa của các tổ chức được nuôi cấy Skoog vàMiller (1956) đã tìm hiểu ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/xitokinin trong môi trường nuôicấy đến sự hình thành cơ quan và tao được chéi từ mô thuốc lá nuôi cấy Nếu tỷ lệ nàycao thì mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ và ngược lại Những kết luận tương tự cũngđược chứng minh ở nhiều loài cây khác Năm 1956, Nickell đã nuôi thành công tế baođơn của đậu (Phaseolus vulgaris) trong dịch lỏng Năm 1960, Bergman đã tái sinh tếbào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng (còn gọi là kỹ thuật gieo tế bảo) Vasil và

Hildebrandt đã nuôi cay huyền phù tế bao đơn thuốc lá tạo thành cây hoàn chỉnh Haiông là những người đầu tiên chứng minh học thuyết tế bào bằng thực nghiệm.

Giai đoạn 4

Từ năm 1960 đến nay, là giai đoạn ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bàovào công tác giống và nghiên cứu di truyền Năm 1960, Cooking đã dùng menCellulasa để phân huy vỏ Cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào không

có vỏ, còn gọi là tế bào trần (protoplast) Nitsch (1967), Nakata va Tanaka (1968) tạođược cây thuốc lá đơn bội bang cách nuôi cấy bao phan Nakata và Takebe (1970 —1971) cho các protoplast thuốc lá tái tạo vỏ Cellulose, tế bào mới phân chia tạo lênquan lạc tế bao trong môi trường lỏng và sau đó tạo được cây hoàn chỉnh Năm 1977,Melchers dung hợp protoplast giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây lai

khoai tây - cà chua “Pomate”.

Từ năm 1965 Ledoux cho rằng có thé gây ra biến di di truyền ở tế bao, thậm chí

ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai, ADN ngoại lai sau khi vàotrong tế bao sẽ gắn voi ADN nội bào Tế bao trần có khả năng hap thụ ADN ngoại laitương đối dé dàng Một van dé quan trọng là sau khi ADN ngoại lai vào trong tế baothực vật, đặc biệt là trong tế bào trần, chúng không bị các nuclease của tế bảo chủphân hủy.

Ngày nay nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng

dé duy tri va nudi cay các tế bao, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùngtrên môi trường nuôi cay giàu đinh dưỡng với những thành phan đã xác định

Các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cay mô tế bào thực vật có thể cung cấp

những lợi thế nhất định so với phương pháp nhân giống truyền thống, bao gồm:

Tạo ra chính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lượng caohoặc có những tính trạng mong muốn khác

Tạo ra các cây trưởng thành một cách nhanh chóng.

Tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phan dé tạo hạt.Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã được biến đổi gen

Tao ra các cây trong điều kiện vô trùng, dé có thé vận chuyên mà hạn chế tối đakhả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh

Có thể tạo ra các cây mà nếu không có nuôi cấy mô thì thường có tỷ lệ nảymam thấp hoặc sinh trưởng yếu, ví dụ hoa lan hoặc cây nap ấm.

Làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân té lây nhiễm khác và

nhân nhanh các cây này như là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng ruộng và nông nghiệp

Nuôi cay mô tế bào thực vật dựa trên thực tế là rất nhiều các tế bào thực vật cókha năng tái sinh thành cây hoan chỉnh (còn gọi là totipotency — khả năng biệt hóa của

tế bào đơn lẻ thành những tế bào chuyên biệt với số lượng không giới hạn) Các tế bàođơn lẻ, các tế bảo thực vật không có thành tế bào (protoplast), các mảnh lá, rễ hoặcthân, thường có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào mới trên môi trường nuôi cay bổsung các chất dinh dưỡng và hormone thực vật

1.3.2 Lịch sử nuôi cấy mô ở Việt Nam

Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến

kỹ thuật nuôi cay mô thực vat

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh

Học, Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng Bước đầu phòng tậptrung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, nhưnuôi cấy bao phan, nuôi cây mô sẹo va protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao

6 phan lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội va ctv, 1978) Tiếp

đó là thành công nuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành,1978) Phòng thí nghiệm tiếp theo được đặt tại phân viện Khoa Học Việt Nam ở TP

Hồ Chí Minh, sau đó là Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ ThuậtNông Nghiệp Việt Nam, chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay, đã

có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện

Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung ương, các trường Đại học), mà có cả ởmột số tỉnh và cơ sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ,Nghệ Tĩnh).

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bao thực vậtphát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhângiống khoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện LâmNghiệp) Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào

kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước

(Nguyễn Tường Vân và ctv, 1994; Định Thị Tòng và ctv, 1994) Các kết quả về dung

hợp tế bảo trần, chuyên gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành

và ctv, 1993) Nuôi cấy bao phan dé tao dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại ViệnCông Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệuquí dé bảo tồn nguồn gen và tạo các dong tế bào có hàm lượng sinh học quan trọngcũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bay

và ctv, 1995; Bùi Bá Bồng, 1995)

Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngay cảng đạt được những

bước tiến vượt bậc Cụ thé:

Tại viện sinh học Nhiệt đới, từ đầu những năm 2000, đã tập trung vào côngnghệ nuôi cây mô các cây công nghiệp như cà phê, hồ tiêu và nhóm cây lâm nghiệpthân gỗ như Paulownia, dó bầu, Neem Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phụctráng giống, tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh Nghiên cứu cải thiện

7 điều kiện nuôi cấy in vitro, biorector cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy

dau, hoa lan, cây cảnh Tạo thành công mô seo/ré bất định hai cây dược liệu quý

là Xạ đen và Tam thất nhằm nhânnhanh sinh khối phục vụ sản xuất hợp chất thứ

cấp Đã nhân giống thành công giống lan đặc hữu Việt Nam (Bích Diệp, 2014)

1.4 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nghiên cứu và sản xuất

Dưới các điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào thực vật có thé nhân lên, hình

thành cơ quan và thậm chí có thể tái sinh cây hoàn chỉnh Sự tái sinh cây hoàn chỉnh từ

một nhóm tế bào bằng phương pháp nuối cây mô thể hiện một bước quan trọng trongnông nghiệp hiện đại.

Một số ứng dụng quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô trong nghiên cứu vàsản xuât:

- Bằng phương pháp nuôi cấy mô người ta có thể tạo ra nguồn cung cấp mộtlượng lớn giống cây trồng thương phẩm trong thời gian ngắn và có đặc tính giống hệtcây mẹ Đồng thời có thể nhân giống nhanh chóng với số lượng lớn các dòng thực vật

vô tính có đặc tính di truyền có giá trị

- Rút ngắn thời gian sinh trưởng một số cây trồng có thời gian sinh trưởng dài,khó nhân giống nhưng có giá trị cao hoặc đang có nguy cơ tuyệt chủng TẾ bào sửdụng trong nuôi cây thường được lay từ cây trưởng thành, nên tuy cây tái sinh còn nhỏnhưng tudi tế bào đã trưởng thành, do đó khi đưa vào môi trường nuôi cấy thì thời giantrưởng thành, ra hoa của chúng được rút ngắn (Nguyễn Đức Thành, 2000).

- Thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo giống cây trồng bằng các phương pháp sinhhọc hiện đại như: xử lý bằng phóng xạ, hóa chất gây đột biến, chuyên gen bằngphương pháp sử dụng nuôi cấy mô, các yếu tố ngoại cảnh có thể được kiểm soát tốthơn trong môi trường chọn lọc Việc gây biến đổi di truyền và chọn loc có thể tiếnhành ở mức tế bào Cây tái sinh mang tính trang di truyền mới, ít xuất hiện thé kham

(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

1.5 Nhân giống vô tinh in vitro

1.5.1 Quy trình thực hiện nuôi cấy in vitro

Theo Nguyễn Đức Thanh (2000), quy trình nhân giống in vitro gồm:

Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vi trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính va tính trạng của cây

mẹ ban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cây mẹ can thận, cây mẹ thường làcây có nhiều đặc tính ưu việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao Sau đó, chọn cơ quan dé laymau thường là mô non, đoạn than có chéi ngủ, lá non hoặc hoa non Mô chon dé nuôicây thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữđược các đặc tính sinh học quý của cây me, it nguy cơ biến dị Tuy theo điều kiện, giaiđoạn này có thé kéo dài 3 - 6 tháng

Thiết lập hệ thong cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyên mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cay dé tạo nguyên

liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước Khử trùng

bề mặt mau vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy Cay mẫu vật vào ống nghiệmhoặc bình nuôi cây có sẵn môi trường nhân tạo (giai đoạn này là giai đoạn cay mẫu in vitro)

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nắm, virus sẽ được nuôi trongphòng nuôi cây với điều kiện nhiệt độ ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định,

từ mẫu nuôi cấy đã bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan hoặc các phôi

vô tính Giai đoạn này phụ thuộc vào từng đôi tượng đem nhân giông, thông thườngkéo dai từ 2 - 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyên

Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá trìnhnuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cây sạch

đã được tạo ra, từ đó nhận được các cum chỗi và các phôi vô tính sinh trường tốt trongquá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người ta cần tạo ra tốc độ nhânnhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cay Thành phan và điều kiện môi trường cần tối

ưu hóa để tạo được mục tiêu nhân nhanh Đối với môi trường nhân chéi, người ta

sử dung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) với nồng

độ khác nhau tùy từng đối tượng cây Quy trình cấy chuyền để nhân nhanh chồithường trong khoảng 1 — 2 tháng tùy loài cây Tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2 — 8 lần saumột lần cấy chuyền Nhìn chung giai đoạn thường kéo dài 10 — 36 tháng Giai đoạnnhân nhanh chổi ban đầu không nên kéo dai quá lâu để tránh sự hình thành biến

di sôma.

Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Các chéi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thé phát triển rễ tự sinh, nhưngthông thưởng các chồi này phải cấy chuyền sang một môi trường khác dé kích thíchtạo rễ Đối với môi trường tạo rễ, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng

thuộc nhóm auxin như a - NAA, IAA, IBA Thông thường giai đoạn này kéo dài 2 - 8

tuần tuỳ đối tượng Khi cây có đủ các bộ phận thân, lá, rễ với kích thích nhất định đảmbảo cho sinh trưởng, phát triển bình thường ngoài tự nhiên, người ta mới tiến hành giaiđoạn tiếp theo là đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên

Chuyên cây ra dat trồng

Đây là giai đoạn đầu cây được chuyên từ điều kiện vô trùng trong ống nghiệm

ra ngoài môi trường tự nhiên Giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng của quytrình nhân giống in vitro Da số các loài cây trồng chỉ sau khi chồi đã ra rễ tạo thànhcây hoàn chỉnh với kích thước nhât định mới được huân luyện và chuyên ra ngoài

vườn ươm Cây nuôi cấy in vitro được sinh trưởng và phát triển trong những điều kiện

tối ưu về nhiệt độ, độ ầm, pH, dinh dưỡng Vì vậy, trước khi đưa ra trồng, người ta cần

huấn luyện cây dé thích nghi với điều kiện tự nhiên Quá trình thích nghỉ với điều kiệnbên ngoài của cây ở giai đoạn đầu yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt Vì vậy, câyđược chuyền từ môi trường từ bão hòa hơi nước sang vườn ươm cần phải đáp ứng các

yêu cau: che cây non bằng nylon và có hệ thống phun sương cung cấp độ âm va làm

mát cây; giá thé trồng cây có thé là đất mun, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứađất, xơ đừa mun cưa và bọt biển, trau Giai đoạn này đòi hỏi 4 - 16 tuần

1.5.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro có kha năng khắc phục được nhiều trở ngại màphương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những ưu điểm chính:

- Có hệ số nhân rat cao, rút ngắn thời gian đưa 1 giống mới vào sản xuất dai trà

- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển

và năng suất cao

- Tạo được dòng thuần của cây tạp hóa

- Tạo được cây có genotyl mới (đa bội, đơn bội)

- Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen.

- Có khả năng sản xuất quanh năm

- Có thé nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh tháinhất định hoặc hạt nảy mầm kém

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền

và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhângiống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973) Ngoài ra, phương pháp này còn cónhững bat lợi sau:

+ Mặc dù số lượng cây giống thu được có thé rat cao nhưng cây con có kíchthước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

+ Cây có thể có những đặc tính không mong muốn

+ Khả năng tạo đột biến tăng.

+ Khả năng tái sinh có thé bị mat đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào

nhiêu lần

+ Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt

+ Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp va

gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ

+ Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus.+ Bảo quan và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giaophan trong ngân hàng gen

1.6 Một số chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Theo Trần Văn Minh (1997), các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chiathành các nhóm chính sau:

Nhóm auxin

Môi trường nuôi cay được bồ sung các auxin khác nhau như: IAA, NAA, IBA,2,4-D IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D là cácauxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoat tính mạnh hơn vi do đặc điểmphân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin oxidase) không có tác dung.

Đặc điềm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộcnhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng quang,hướng địa, hướng hóa, tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn

Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yêu sử dụng cho môi trường ra rễ và kết

hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chôi.

Vai trò của các chât thuộc nhóm auxin được khái quát:

- Kích thích phân chia và kéo dai tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chéi bên Ưu thế chồiđỉnh làm ức chế sinh trưởng của chéi nách Nếu ngắt bỏ chdi đỉnh sẽ dẫn đến sự pháttriển chồi nách Nếu thay thé vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chấtkeo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng Cơ chế ức chế của chéi đỉnhliên quan đến một chất điều hòa sinh trưởng khác là ethylen Auxin (NAA) kích thíchchổi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụtrong nuôi cay mô

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo.

- Kích thích tạo chéi bất định (ở nồng độ thấp)

Chức năng chủ yêu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chỗi trong nuôi cây mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thé của chéi đỉnh

- Tạo chéi bat định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Uc chế sự kéo dai chồi

1.7 Nghiên cứu về nôi cấy mô cây hoa triệu chuông

Theo kết quả nghiên cứu của Hà Thị Lan Anh (2018) trong nghiên cứu nhângiống vô tính cây hoa triệu chuông xác định được công thức khử trùng tạo mẫu hoatriệu chuông sạch, có khả năng tái sinh chồi tối ưu nhất là xử lí sơ bộ mẫu kết hợp khửtrùng bằng NaClO 7% trong thời gian 5 phút, với tỉ lệ mẫu sạch sống là 80% Môitrường thích hợp nhất dé nhân nhanh chéi : MS + 30 g đường + 7 g/l agar có bố sung0,3 mg/l BAP Môi trường tạo rễ tốt nhất: MS + 30 g đường + 7 g/l agar có bổ sung0,1 mg/l NAA.

Một số nghiên cứu của cây cùng họ: cây Dạ Yến Thao (Petunia hybrida)

Theo Tran Quốc Cường (2011), môi trường MS có bổ sung BA 2,0 mg/I NAA0,5 mg/l cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá tốt là 88,9% va cho số chồi cao (4 chồi) Môitrường MS có bồ sung TDZ 0,2 mg/l cho tỷ lệ chồi tái sinh từ lá đạt 100%, số chi táisinh cao nhất với 9,9 chồi, chiều cao chỗồi cao nhất là 2,3 cm

Theo kết quả nghiên cứu của Bui Thị cúc va ctv (2017), môi trường MS có bốsung 30 g/l succrose, 6 g/l agar, 0,75 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA với hệ số nhân chồi

dat 73,11 lần, chiều cao trung bình đạt 2,63cm sau 5 tuần nuôi cấy.

Theo Nguyễn Tiến Long và ctv (2021), sử dụng đoạn thân mang mắt ngủ làm

nguồn nguyên liệu khởi đầu và khử trùng bằng dung dịch HgCl› nồng độ 0,1% trongthời gian 10 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất (tỷ lệ mẫu sống đạt 60%) Môitrường tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ tốt nhất là: MS + 1 mg BAP/1 + 6,5 gagar/l + 30 g sacarose/1 (tỷ lệ mẫu tạo chồi 100%, số chồi trung binh/mau dat 2,73);môi trường nhân nhanh chéi tốt nhất là MS + 1 mg BA/I + 0,2 mg IBA/1 + 6,5 g agar/l+ 30 g sacarose/1 (số chồi trung bình/mẫu dat 19,53) Mô lá của cây in vitro là cơ quansinh dưỡng phù hợp nhất để nhân nhanh, 100% các chi in vitro tái sinh thông quahình thức mô seo, tỷ lệ số chồi/mẫu đạt 21,53.

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền chọn giống cây trồng, KhoaNông học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

- Thời gian: từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 07 năm 2023

2.2 Vật liệu thí nghiệm

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vật liệu nuôi cấy khởi đầu là đoạn thân mang mắt ngủ của cây giống hoa triệuchuông khỏe mạnh, không bị sâu bệnh.

2.2.2 Hóa chất sử dụng

NaOCl (Natri hypocloric): 12%, xuất xứ Việt Nam

BA (6 - benzyladenine): độ tinh khiết >99%, xuất xứ Canada

IBA (Indole - 3 — butyric acid): độ tinh khiết > 98%, xuất xứ Canada

NAA (1 — Naphthalene acetic acid): độ tinh khiết >98%, xuất xứ Canada

2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối

Nhiệt độ: 25 + 2°C

Độ âm: 50 — 60 %

Cường độ ánh sáng: 2000 lux.

2.4 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm

Môi trường dinh dưỡng khoáng MS cải tiến theo nghiên cứu của Murashige và

Skoog (1962) có các thành phần theo bảng sau:

Bảng 2.1 Thành phần của môi trường sử dụng trong thí nghiệm.

Thanh phan Môi trường(mg/l) MS

Đa lượng NH4NO3 1650

KNO3 1900 CaCl2.2H20 440 MgSO¿.7H2O 370 KH2PO4 170

Vi lượng MnSO¿.4H2O 16,9

ZnSO.4.4H20 8,6 CuSO4.5H20 0,025 CoCl2.6H20 0,025

Na2Mo,44H20 0,25

H3BO3 6,2

KI 0,83Sat EDTA FeSO 7H20 27,8

Na2EDTA 313

Vitamin Myo-Inositol 100

Thiamine HCl (B1) 0,5

Pyridoxine HCI (B6) 0,5 Glycine 2,0 Nicotine acid (B5) 0,5Cac thanh phan khac:

- Đường saccarose: 30 g/1

- Agar: 8 g/]

Môi trường được điều chính về pH = 5,8 + 0,05 (bằng NaOH IN và HCI 1N)trước khi hap khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 117°C, 1 atm trong 15 phút đối vớicác dụng cụ thí nghiệm, dung cụ thủy tinh không chứa môi trường thì khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 15 phút).

2.5 Bồ trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên

mẫu thân cây hoa triệu chuông

Mục tiêu: Xác định nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng thích hợp dé khử

trùng mẫu thân cây hoa triệu chuông.

Vật liệu khởi đầu: Các đoạn thân mang mắt ngủ được cắt dai khoảng 3 - 4 cm,cắt bỏ lá non

Môi trường nền: Môi trường được sử dụng là môi trường MS, có bổ sung 8 g/lagar, 30 g/l đường saccarose.

Hình 2.1 Vật liệu khởi đầu: đoạn Hình 2.2 Đoạn thân mang mắtthân mang mắt ngủ cắt bỏ lá non ngủ đã được khử trùng

Thí nghiệm hai yếu tố gồm 9 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫunhiên với 3 lần lặp lại

Yếu tô A: nồng độ NaOCl (5%; 7%; 9%)

Yếu tô B: thời gian khử trùng mau (5 phút; 7 phút; 9 phút)

Đoạn thân mang mắt ngủ cây hoa triệu chuông đã được khử trùng dùng làm vật liệu

cho thí nghiệm.

Bảng 2.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 1

Hình 2.3 So đô bô trí thí nghiệm 1

Quy mô thí nghiệm

- Dem các đoạn thân đã cat rửa sạch dưới vòi nước may.

- Ngâm, lắc mẫu trong xà phòng pha loãng trong 10 - 15 phút sau đó rửa sạchbằng nước cat 2 - 3 lần

- Lắc mẫu với cồn 70° trong 1 phút, rửa sạch lại với nước cất 3 - 4 lần

- Xử lý mẫu với các nồng độ NaOCl và thời gian như sơ đồ bố trí thí nghiệm và

2 giọt Tween - 20 bổ sung/100ml nước cất dé tăng hiệu quả khử trùng, sau đó rửa sạchlại bằng nước cất 3 - 4 lần

- Mẫu cấy sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ được cắt bỏ bề mặt tiếp xúcvới chất khử trùng, vì các tế bào ở bề mặt tiếp xúc dưới tác dụng của chất khử trùngmạnh dé bị chết Để đảm bảo cho chồi có thé hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trườngthì thao tác này rất quan trọng Sau khi cắt tiến hành thâm khô mẫu bằng giấy thấm,

tiếp tục cắt các đoạn chéi thành các đoạn ngắn chứa mắt ngủ, mỗi đoạn dai 1 - 1,5 cm.

- Cây mẫu đã xử lý vào chai có môi trường MS, bổ sung 8 g/l agar, 30 g/l

đường saccarose.

Theo dõi toàn bộ mẫu trên nghiệm thức bắt đầu 7 NSC, mỗi lần cách nhau 7

ngày, theo dõi trong vòng 2] ngày.

- Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Số mẫu séng/téng số mẫu cay trong thí nghiệm) x 100Dém trực tiếp số mẫu sống trên tông số các mẫu trong nghiệm thức, mẫu sống

là mẫu vẫn giữ được màu xanh lục, không bị ngả màu hay phân hủy và không nhiễm

- Tỷ lệ mẫu chết không nhiễm (%) = (Số mẫu chết/tổng số mẫu cấy trong thínghiệm) x 100.

Đếm trực tiếp số mẫu chết trên tổng số các mẫu trong nghiệm thức, mẫu chết là

những mẫu có dấu hiệu bị phân hủy, nhưng không nhiễm

- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Số mẫu nhiém/téng số mẫu cay trong thi nghiém) x 100

Đếm trực tiếp số mẫu nhiễm trên tổng số các mẫu trong nghiệm thức, mau nhiễm là mau có các biêu hiện xuât hiện các sợi hoặc vệt nam moc, có dâu hiệu bi phân hủy.

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA va IBA đến quá trình nhân chồi cây hoa triệu

chuông từ mẫu thân

Mục tiêu: Xác định nồng độ BA, IBA thích hợp cho khả năng nhân chồi cây

hoa triệu chuông từ mẫu thân.

Chuẩn bị vật liệu: sử dụng kết quả ở thí nghiệm 1 và bố sung thêm nguồn mẫu

dé chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm 2

Vật liệu: Đoạn thân mang mắt ngủ của cây hoa triệu chuông được chuẩn bị còn

sống va không bị nhiễm nam, khuẩn, mỗi đoạn dài 1 - 1,5 cm.

Yếu tô A (nồng độ BA): 0,3 mg/1; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l.

Yếu tô B (nồng độ IBA): 0,1 mg/l; 0,2 mg/1; 0,3 mg/l

Bảng 2.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 2

Nông độ BA Nông độ IBA

(mg/) (mg/l)

0,1 0,2 0,3 0,3 NTI NT4 NT7

0,5 NT2 NTS NT8

0,7 NT3 NT6 NT9

NT1 NT6 NT3 NT5 NT9 NI2 NT4 NT7 NTS

NT4 NT8 NT9 NT6 NT1 NT5 NT7 NT2 NT3

NT2 NT9 NT7 NT3 NT4 NT6 NI NTS NT5

Hình 2.5 So đô bô trí thí nghiệm 2

Quy mô thí nghiệm

Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi:

Theo dõi các chỉ tiêu về chồi sau khi cấy, 7 ngày 1 lần, theo dõi trong 6 tuần,

theo dõi 5 chai, 10 mẫu/ô cơ sở, các chỉ tiêu:

- Hệ số nhân chồi = Tổng số chéi tao thành/tổng số chéi đưa vào Đếm tất

cả các chồi trên 2mm

- Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch đến điểm cao nhất của chồi cao nhấtbằng thước đo mẫu tính trung bình

- Số lá/chồi (1á) = Tổng (số 14/ch6i)/Téng số chồi khảo sát, tính trung bình

- Khối lượng chồi: cân khối lượng chéi sau 42 NSC, tính trung bình

(*) Mẫu nảy chéi: là mẫu sau khi tạo mô sẹo, bat đầu hình thành chồi và có thénhìn thấy chéi bang mắt thường qua chai cấy

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ cây hoa triệuchuông từ mẫu chồi

Mục tiêu: Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho khả năng tạo rễ cây hoa

triệu chuông từ mẫu chéi

Vật liệu: Các chồi tạo ra trong TN2 (chdi cao 0,5 - 1 cm, có 3 - 4 lá) được sửdụng làm vật liệu nghiên cứu.

Tổng số mẫu: 1 x 25x 5 x 3 = 375 mẫu

Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi:

Theo dõi khả năng hình thành rễ sau khi cấy, 7 ngày 1 lần, theo dõi trong 3

tuần, theo dõi 10 chai, 10 mẫu/ô cơ sở, các chỉ tiêu:

- Chiều cao cây (cm): đo từ mặt thạch đến điểm cao nhất của cây bằng thước

đo mẫu, tính trung bình

- Số lá/chồi (1á) = Tổng (số 14/ch6i)/Téng số chồi khảo sát, tính trung bình

- Tỷ lệ ra rễ (%) = (tổng số mẫu ra rễ/tông số mẫu cấy) x 100

- Chiều đài rễ (đo sau 21 NSC) (em): đo từ gốc đến chóp rễ của rễ dài nhất, tínhtrung bình.

- Số rễ (đếm sau 21 NSC) (rễ/cây): đếm số rễ hình thành, tính trung bình

(*) Rễ được tính khi có thé thay được qua mặt chai cay bang mat thuong.

2.6 Phương pháp xử li và thống kê số liệu

Số liệu được tổng hợp và xử lý sơ bộ bằng phần mềm Microsoft Excel, phântích ANOVA bằng phần mềm R (4.2.0)

Chương 3KET QUA VÀ THẢO LUẬN3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân cây hoatriệu chuông.

Khử trùng mô thực vật như một giai đoạn tiên quyết cho sự thành công trongnuôi cấy in vitro Mục tiêu của giai đoạn này là thu được lượng lớn mẫu cấy vô trùng

và còn khả năng tăng trưởng (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006) Rất khó dé tạo nguồnmẫu sạch ban đầu từ mẫu thu ngoài đồng ruộng do mẫu thường xuyên tiếp xúc với tácnhân gây bệnh Nguồn mẫu này nếu không được khử trùng hoặc khử trùng không sạchthì nuôi cấy mô sẽ có tỷ lệ nhiễm rất cao hoặc thời gian khử trùng quá dài làm mẫu dễ

bị tốn thương dẫn đến các mô và tế bao thực vật bị chết

Trong nuôi cay mô tế bào thực vật, NaOCl được dùng như một chất khử trùngthông dụng vì khả năng diệt vi khuẩn, nắm cao, giá thành rẽ lại ít gây độc hai

Vì vậy đề tăng tỷ lệ mẫu sạch và đảm bảo chất lượng của mẫu cấy, thí nghiệmẢnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu cây hoa triệu chuông

(50,7%).

Bảng 3.1a Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân câyhoa triệu chuông ở 7 NSC

Chỉ tiêu Thời gian Nông độ NaOCl (%) 1B

(phú) 5 7 9

5 66,7° 73,3° 74,7 70,24

Tỷ lệ mẫu 7 78,7 88,0% 74,7 — 72,0^aie 9 65,3° 54,74 50,74 66,78

Tỷ lệ mẫu nhiễm ở các nghiệm thức có các nồng độ NaOCl khác nhau thì khácbiệt rất có ý nghĩa thống kê Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp ở nồng độ NaOCI 9% (1,8%), khácbiệt có ý nghĩa thống kê với các nồng độ còn lại, nồng độ NaOCl 5% cho tỷ lệ mẫunhiễm cao nhất (22,7%) Với 3 mức thời gian 5 phút, 7 phút, 9 phút thì tỷ lệ mẫunhiễm thấp nhất ở thời gian 9 phút (6,7%), khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Sự kếthợp giữa nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng không cho khác biệt có ý nghĩa thống

kê, tỷ lệ nhiễm dao động từ 0% - 29,3%.

Ty lệ mẫu chết ở các nghiệm thức có nồng độ NaOCl và thời gian khử trùngkhác nhau thì khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê, nồng độ NaOCl 5% có tỷ lệ

mẫu chết thấp nhất 5,8%, nồng độ NaOCI 9% là mức nồng độ có tỷ lệ mẫu chết cao

nhất (41,3%) NT1 (5% NaOCl + 5 phút và NT4 (5% NaOCl + 7 phút) cho tỷ lệ mẫuchết thấp nhất là 4,0%, không khác biệt đối với NT2 (7% NaOCl + 5 phút) và NT5 (7%

NaOCl + 7 phút), nhưng khác biệt so với các nghiệm thức còn lại.

Dựa vào bảng 3.1b cho thay:

Ở thời điểm 14 NSC, mẫu cây triệu chuông cấy vào môi trường có chứa mứcnồng độ NaOCl khác nhau thì khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Tỷ lệ mẫu sống caonhất ở nồng độ NaOCl 7% (75,1%), ty lệ mẫu sống thấp nhất ở nồng độ NaOCl 9%(50,7%), khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Thời gian khử trùng trong 7 phút có tỷ lệmẫu sống cao nhất (20,4%), khác biệt so với các mức thời gian còn lại Khi kết hợp 2yếu tố nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng thi ở mức nồng độ NaOCl 7% và thời

gian 7 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất 82,7%, khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống

kê so với các nghiệm thức còn lại, NT9 (9% NaOCl + 9 phút) cho tỷ lệ sống thấp nhất42,7%.

Với các mức nồng độ NaOCI khác nhau thì tỷ lệ mẫu nhiễm có sự khác biệttrong thống kê Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất ở nồng độ NaOCl 9% là 3,1%, khác biệtvới các mức nồng độ 5% và 9% Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất ở thời gian 9 phút với7,6%, khác biệt với mức thời gian 5 phút (20,9%) và 7 phút (20,4%) NT9 là nghiệmthức cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất với sự kết hợp giữa nồng độ NaOCl 9% và thời

gian khử trùng trong 9 phút (0%).

Bang 3.1b Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân câyhoa triệu chuông ở 14 NSC

TB 64,98 75,1* 50.7 76,4^ CV(%)=3.3 Fa=166,2" Fns=l23” Fas=30,07

5 4,0! 59 10,7° 16,9C

Ty lệ 7 10,79 10,79 253° 20,48mau chét ° b a F

(%) 9 36,0 45,3 58,3 31,1

TB 6,7" 15,6° 46,24 CV(%)=73 Fa=498,9" FR=69,5" Fap=6,6"

Tỷ lệ mẫu chết ở các nghiệm thức có nồng độ NaOCl và thời gian khử trùngkhác nhau thì khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Tỷ lệ mẫu chết thấp nhất ở nồng độNaOCl 5% (6,7%), tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở nồng độ NaOCI 9% là 46,2% Thời giankhử trùng trong 5 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất 16,9%, khác biệt với các mốc thờigian còn lại Xét đến sự kết hợp giữa 2 yêu tố nghiệm thức có nồng độ NaOCl 9% vàthời gian khử trùng trong 9 phút có tỷ lệ mẫu chết thấp nhất là NT1 (5% NaOCl + 5

phút) 4,0%, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại, NT9 (9%NaOCl + 9 phút) có tỷ lệ mau chết cao nhất là 58,39%.

Nông độ NaOCl và thời gian khử trùng vẫn có ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu sống,mẫu nhiễm, mẫu chết cây hoa triệu chuông ở 21 NSC (Bang 3.1)

Bảng 3.1c Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu thân cây

hoa triệu chuông ở 21 NSC

Chitiêu Thời gian (phút) Nồng độ NaOCl (%) TB

5 7 9

5 53,34 65,3 70,7° 60,94

Ty lệ mẫu 7 72,08 78,73 $ Ta có Lan sạch sông

5 42,72 26,7 18,7° 21,8^

Tỷ lệ mẫu 7 17,3° 8,04 8,04 13,35 nhiễm (%) 9 5,34 5,34 0,0° 8,9¢

TB 29,34 11,18 3,6

CV (%)=8,4 Fa=433,2" Fp=111,9" Fap= 13,8"

Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các số có cùng ki tự di kèm thé hiện sự khác biệt

không có ý nghĩa thong kê, (**): khác biệt rất có ý nghĩa vê mặt thong kê (P<0,01) Tat cả số liệu tỉ lệ

đều được chuyển đổi theo công thức aresinVx.

Tại thời điểm 21 NSC, nồng độ NaOCl 7% vẫn là nồng độ thích hợp cho việckhử trùng mẫu cây hoa triệu chuông cho kết quả tỷ lệ mẫu sống cao nhất (69,8%),

khác biệt so với các nồng độ còn lại Thời gian cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 7 phút(63,1%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất ở thời gian 9 phút (55,6%) Đối với sự tương tác

giữa 2 yếu tố nồng độ NaOCI và thời gian khử trùng nghiệm thức có tỷ lệ mẫu sống

cao nhất là NTS (78,7%), tuy không khác biệt với NT2 (72,0%) nhưng khác biệt rất có

ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức còn lại

Ty lệ mẫu nhiễm của các nghiệm thức có nồng độ NaOCl và thời gian khử

trùng khác nhau thì khác biệt rất có ý nghĩa thống kê, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất ở mức

nồng độ NaOCl 9% (3,6%), thời gian khử trùng trong 9 phút có tỷ lệ mẫu nhiễm thấpnhất là 8,9%, rất khác biệt so với các mốc thời gian còn lại Sự kết hợp giữa 2 yếu tốnồng độ NaOCl và thời gian khử trùng rất có ý nghĩa về mặt thống kê, tỷ lệ mẫu thấpnhất ở NT9 (9% NaOCI + 9 phút) 0%, tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất ở NT1 (5% NaOCl +

5 phút) 42,7%.

Môi trường chứa các nồng độ NaOCl khác nhau thì khác biệt rất có ý nghĩathống kê về tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ mẫu chết thấp nhất ở nồng độ NaOCl 5% (7,6%),khác biệt về mặt thống kê so với các mức nồng độ còn lại Yếu tố thời gian cũng ảnhhưởng đến tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu chết thấp nhất ở thời gian là 5 phút (17,3%) Xétđến sự kết hợp 2 yếu tố thì NT1 (5% NaOCl + 5 phút) có tỷ lệ mẫu chết thấp nhất 4%,không khác biệt với NT4 (5% NaOCl + 7 phú nhưng rất khác biệt so với các nghiệmthức còn lại.

Qua kết quả phân tích có thể thấy được, trong cùng một đơn vị thời gian (7 phút) khi

tăng nồng độ chất khử trùng từ 5% lên 7% thì hiệu quả khử trùng tăng rõ rệt, cụ thé là

tỷ lệ mẫu nhiễm giảm xuống từ 17,3% còn 8,0% va tỷ lệ mẫu sạch tăng từ 72,0% lên78,2% Trong khi đó thời gian khử trùng mẫu là 9 phút thi tỷ lệ mẫu sống từ 52,7%(NaOCl 5%) giảm xuống 45,3% (NaOCl 7%) va chi còn 37,3% (NaOCl 9%) Mặc dùNT9 (NaOCl 9% + 9 phút) đạt tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất 0% nhưng tỷ lệ mẫu chết lớn62,7% do nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng cao làm chết tế bào thực vật nênkhông đạt hiệu quả khử trùng Điều này là trùng khớp với nghiên cứu của Hà Thị LanAnh (2018) trong cùng thời gian khử trùng khi tăng nồng độ NaOCl thì tỷ lệ sống tăng

từ 20% lên 80% và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm còn 10% Tóm lại khử trùng mẫu với nồng

độ NaOCl thấp va trong thời gian ngắn sẽ giảm tỷ lệ mẫu chết trên mẫu nhưng tăng

khả năng mẫu nhiễm và ngược lại Vì vậy nồng độ NaOCl 7% và thời gian 7 phút là sựkết hợp tối ưu cho khử trùng mẫu cây hoa triệu chuông.

3.2 Ảnh hưởng của BA và IBA đến quá trình nhân chồi cây hoa triệu chuông từmẫu thân

Dựa vào kết quả thí nghiệm 1 cho thấy khi khử trùng mẫu cây hoa triệu chuôngtrong dung dich NaOCl 7% trong 7 phút là nồng độ và thời gian thích hợp cho khửtrùng mẫu cây hoa triệu chuông trong nuôi cấy mô, dựa trên cơ sở đó tiến hành thínghiệm 2, bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng BA va IBA trong môi trường MScho quá trình nhân chôi.

BA là một chất điều hòa sinh trưởng phô biến thuộc nhóm cytokinin, có vai tròkích thích phân chia tế bào, kích thích phát sinh chéi trong nuôi cấy mô, tạo chéi batđịnh (ở nồng độ cao), kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế củachéi đỉnh (Trần Văn Minh, 1997)

Trong nhóm auxin, IBA thường được dùng kết hợp với cytokinin sử dụng chomôi trường ra chồi Tỷ lệ IBA/BA là tỷ lệ auxin/cytokinin cũng thường được sử dụng

trong nuôi cây mô tê bao thực vat.

Tuy nhiên việc lựa chon tỷ lệ auxin/cytokinin như thế nào còn phụ thuộc vàotừng loại cây nuôi cay cụ thể Do đó thí nghiệm được tiến hành dé tìm ra nồng độ BA

và IBA phù hợp đến quá trình nhân chồi cây hoa triệu chuông

Tat cả các nghiệm thức của thí nghiệm đều bat đầu ra chỗi ở thời điểm 28 NSC

Ở thời điểm 28 NSC, hệ số nhân chổi của các nghiệm thức được cấy vào môitrường chứa nồng độ BA và IBA khác nhau thì khác biệt rất có ý nghĩa thống kê (Bảng3.2a) Hệ số nhân chồi lớn nhất ở nồng độ BA 0,3 mg/l (13,1 lần), không khác biệt vớinồng độ 0,5 mg/l, nhưng khác biệt với nồng độ 0,7 mg/l Với nồng độ IBA mức nồng

độ 0,2 mg/l có hệ số nhân chồi lớn nhất (13,5 lần), không khác biệt với mức nồng độ0,1 mg/l nhưng khác biệt với mức nồng độ 0,3 mg/l Xét đến sự kết hợp của nồng độ

BA và IBA thì hệ số nhân chéi không có ý nghĩa thống kê, hệ số nhân chồi dao động

từ 7,8 - 15,5 lần