Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Định danh nấm rễ nội cộng sinh Vesicular arbuscular mycorrhiza trong đất trồng sầu riêng bằng kỹ thuật sinh học phân tử và ảnh hưởng của cây ký chủ đến khả năng nhân giống nấm rễ nội cộng sinh

TOM TATĐề tài “Dinh danh nắm rễ nội cộng sinh Vesicular Arbuscular Mycorrhiza VAM trong rễ sầu riêng bằng kỹ thuật sinh học phân tử và ảnh hưởng của cây ký chủ đến nhângiống nắm rễ nội c

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3k 2s 2s 3K 2 2 ok

KHOA LUAN TOT NGHIEP

DINH DANH NAM RE NOI CONG SINH VESICULAR

ARBUSCULAR MYCORRHIZA TRONG DAT TRONG SAU RIENG BANG KY THUAT SINH HOC PHAN TU

VA ANH HUONG CUA CAY KY CHU DEN KHA NANG

NHAN GIONG NAM RE NOI CONG SINH

SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYEN THỊ KIỀU LOANNGÀNH : NÔNG HỌC

KHÓA : 2020 —2024

Thành phố Hỗ Chí Minh, tháng 05/2024

ĐỊNH DANH NAM RE NOI CỘNG SINH VESICULAR

ARBUSCULAR MYCORRHIZA TRONG ĐẤT TRÒNG

SAU RIÊNG BẰNG KỸ THUẬT SINH HOC PHAN TỬ

VÀ ANH HUONG CUA CÂY KÝ CHỦ DEN KHẢ NANG

NHÂN GIONG NAM RE NỘI CỘNG SINH

Tác giả NGUYEN THỊ KIỂU LOAN

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu cấp

băng kỹ sư ngành Nông học

Hướng dẫn khoa học

ThS THÁI NGUYEN DIEM HUONG

ThS NGUYEN CAO KIET

Thanh phé H6 Chi Minh

Thang 05/2024

LOI CAM ON

Lời đầu tiên, con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã sinh thành và nuôi

day con nên người.

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu và các quý thầy cô trường đại họcNông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Nông học và quý thầy cô trongkhoa đã tận tình giúp đỡ và dạy dỗ em trong suốt quá trình học tập tại trường

Đặc biệt em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Cô Thái Nguyễn Diễm Hương và Thầy Nguyễn Cao Kiệt đã trực tiếp hướngdẫn, tận tình, động viên quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em thực hiện vàhoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Bộ môn Sinh lý — Sinh hóa thực vật, bộ môn Bảo vệ thực vật, bộ môn Khoa họcđất — Phân bón, TS Bùi Minh Tri, TS Võ Thị Ngọc Hà và ThS Phạm Thị Thùy Dương

đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích trong phòng thí nghiệm

TS Nguyễn Châu Niên đã hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện nhângiống nắm rễ nội cộng sinh trong nhà lưới

TS Trần Thị Ngọc Bích đã hỗ trợ và hướng dẫn các kỹ thuật liên quan đến sinh

học phân tử.

Anh Nguyễn Vị Quốc công ty Syngenta đã cung cấp hạt giống bắp cho việc nhân

giống nam rễ nội cộng sinh

Bên cạnh đó, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến bạn Thơm, Ngọc, Huy đã nhiệttình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận Cảm ơn bạn Nguyễn Tiến Dũng vàbạn Đặng Đăng Khoa lớp DH20NHA đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong thời gian thực hiện

khóa luận tốt nghiệp

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kiều Loan

TOM TAT

Đề tài “Dinh danh nắm rễ nội cộng sinh Vesicular Arbuscular Mycorrhiza (VAM)

trong rễ sầu riêng bằng kỹ thuật sinh học phân tử và ảnh hưởng của cây ký chủ đến nhângiống nắm rễ nội cộng sinh” đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm và Trại thực nghiệm

khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh từ tháng 8/2023

đến tháng 4/2023 Mục tiêu nghiên cứu của đề tai là định danh được loài nam rễ nộicộng sinh hiện diện phổ biến trong đất trồng sầu riêng tại Cai Lay, Tiền Giang bằngphương pháp Nested — PCR và xác định được loại cây ký chủ thích hợp dé nhân sinh

khối chi nắm rễ nội cộng sinh, làm tiền đề nghiên cứu ứng dụng nam rễ nội cộng sinh

trong sản xuất nông nghiệp

Hai quần thể mẫu bào tử VAM sau khi được phân lập và chọn lựa dựa trên cácđặc điểm hình thái đã được ly trích DNA và khuếch đại bằng các cặp mỗi NS1/NS4,LSU0599/LSU0061 (cho phản ứng PCR lần 1) và cặp AMLI/AML2, LSU4f/LSU7r(cho phan ứng PCR lần 2) Kết qua đã định danh được loài Acaulospora mellea và dòngGlomus sp (chưa định danh được đến loài) là loài nắm rễ nội cộng sinh pho bién trénđất vùng rễ sầu riêng Xác định được trình tự của 2 mau nghiên cứu có độ tương đồng

từ 97,78 — 100% với 10 trình tự khác trên thế giới

Thí nghiệm nhân sinh khối nắm rễ nội cộng sinh chi Glomus được thực hiện trong

và nha màng bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 3

loại cây ký chủ (bắp, cao lương, sầu riêng) và nghiệm thức đối không sử dụng cây ký

chủ, 3LLL Kết qua thí nghiệm cho thấy ty lệ xâm nhiễm và khả năng tăng sinh bào tử

cao nhất là nghiệm thức cao lương (93,93%; 65,16 lần) tiếp theo là đến bắp (87,79%;

50,14 lần) và thấp nhất là sầu riêng (69,51%; 14,67 lần) Sau 90 ngày nuôi cấy, bắp vàcao lương là hai loại cây phù hợp dé sử dụng nhân giống chi Glomus hiện diện trong đất

trông sâu riêng tại Cai Lậy, Tiên Giang.

NIƯC WUC a acces cece eececesee shen seca a acer Sane eal ae a Re el IV

Danh sách chữ vit (8 caeeeeseseesnonnoietesstoioLEEEGIEISESGSG0300030051.0001298.205500100/008630020ccpessssd Vjáïih:sácH:od0i DEA ổTseesoseenisakkeensdimecdoodggrraurdtifodausì-VeusidkghaiknunalnllvaSzcdydossiokoSi8LannagEšBosôgSiinomếngsh sụn VI

IDãïiB;S4GH:686: 1101 1 eee en Vill

1989:1170 8 |FLW FE co con sansa peo ln Gg13.008810124612100040/20001610)1580048104.6.100365015060101806060668:08 1Mụe tiêu đỗ TĂI sen ngon ninh ng 2g Di nh HA HS TH N0 /15013000100001301510106/00/01/00000013900000 tue 5

| RA PDNDDDDDDDUNDUDNEC NHEI NAY A ˆ 2

Giới hạn đề tài - 5-5552 SS12E321221211212112112111211211121111111121112112121121111211211 22c rrrey 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 22 2222222E222E2EE2EE£EE2EEzZEE2EEzzxzzrerxee 3

1.1 Tổng quan nam rễ nội cộng sinh Vescular Arbuscular Mycrorrhiza (VAM) 3

[TS SP Watt) | ii evresirereeseer ae eee rere eee 000090 H2 nrie 3

1.1.1.1 Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza) - - 5 552 S+*++++ee+exeeeerxerrerrererre 21.1.1.2 Nam rễ nội Cone Sink! (ETidGTTVGOTTHHZ] cua se ngan niSiLDiG3E00) HhgSh354G232g 3819180088830 SẺ 41.1.2 Thành phan cau trúc nấm rễ nội cộng sinh 2- 22 222++2+2+£z++z+++zx++zxzzz+z 41,1<5,1 Cầu 6 bÃo seeensesntariotnihitiiigrkdtorESGSGINGHS4GHi05000009nq5gii'CdnnøizgBrgrnone 411-3 Côutrlio trội ————— 41.1.3 Cơ chế cộng sinh và mối liên hệ giữa nắm nội cộng sinh với cây ký chủ 31.1.4 Vai trò của nam rễ nội cộng sinh VAM đối với cây trồng -+- 61.2 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nam rễ nội cộng sinh VAM 7

1.2.1 Các nghiên cứu Ong DUCE sscsxzssssssgi056066611014056040336430435500696365950140019410913 eee 7 1.2.2 Cac nghién ctu ngoal NGC 0 8

1.3 Tổng quan về PCR va Nested PCR 2-22 22222E122E22E122122112212211221221 22222 e2 91.4 Cơ sở và nghiên cứu về các primer sử dung trong phản ứng Nested PCR 10

1.5 Giới thiệu chung về BLLAST - 2-52 2S22E2E22E221125121121121121121121121121121121 21C 131.6 Cơ sở nghiên cứu về nhân sinh khối nắm cộng sinh trên cây ký chủ - 13

Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 16

2.1 Tối đưng nghiền atte đỗ HÃT cece nacencsnswmaronnrcsentoesissrannnennuennacaueiaimieraees l62.2 Thời gian và địa điểm 2 ¿+5¿+222E22E22E125121121121121121121121121121121121121121121 2 xe 162.3 Nội dung 1: Định danh nắm rễ nội cộng sinh hiện diện phổ biến trong đất trồng sầuriêng tại Cai Lay, Tiền Giang bang kỹ thuật sinh học phân tử 2-22 52552 16

23.1 ‘Vat lid thi HghHlỆHásssscnnnagbinnhn bì 3öISGHASãS3SSHESSESEISCEHRERSIS-SNERXHAESSIHEESGS8SE4SEAS43658SẸSE 16

2.3.1.1 Mau đất vùng rễ đất trồng sầu riéing o.oo ccc ccccccsecsecssecseesseesessseesecsecsueeseesseesees 162.3.1.2 Các cặp mỗi được sử đụng trong nghiên cứu . -22+2c2++zLkrxrxsrrrcez 162.3.1.3 0 na 172.3.1.4 Trang thiết bị và dụng cụ thi nghiệm 5 5-2225 +++£+*E+zEereerrrrrrrrrrreree 17

25342: PHƯỚH ĐHẾB NEMISH GỮ saassxsozss8i2948583005511906)05659034B4059953S434E939393BEQBLAMSIBGHSESSSEESS9SESE 18

552,1 Er di miHfnh: | es 182.3.2.2 Dinh danh nam VAM bằng sinh học phân tử -2- 22 2z22zz2s2z+zzxzzs2 182.3.3 Xử lý số LSU once ccccceccccceeceeesesecscssesvesesssevesessssscecssssessessssnssesassessesecseseesesseseeesaeeeeees 202.4 Nội dung 2: Nhân sinh khối bào tử nam nội cộng sinh trên 3 loại ký chủ khác nhau 21

24.) Vật liệu Te HSH GŨitussesensiirsitsettososuisEHGIGIEEEAGSREEMHEESHIIENESRRASESHISDISHSHSG.RESSRSESAS0SHEEB 21 2:42) Phương:pháp:nghiÊn Cte crcscvewsrwcus avon tenwetoiieasseniees canienndeacrmanintnecanecaateartan otter 23

2.4.3 Phương pháp tiến hành - 22 2SS22222SE2SE22E1221222122122212212112212112212212212 222 e2 23

2.4.4 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi .- . - +5 +52 *22*+* 2E rrrrrrrrrrrrrkrreree 24

QAS in l8 4:44 25

CHƯƠNG 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN -22222©222222222222222222zxczzxe2 26

3.1 Nội dung 1: Định danh nam ré nội cộng sinh hiện diện phô biến trong đất trồng sauriêng tai Cai Lay, Tiền Giang bang kỹ thuật sinh học phân tử -2-2- 52552 26

3.1.1 Đặc điểm về hình thái của loài VAM phô biến trong đất trồng sầu riêng 26

3.1.2 Định danh nam rễ nội cộng sinh ¡016000 10 97 nh“ ẽố 283.1.2.1 Kết quả và hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu GLOI -5 283.1.5:2 Et cpa LAST tình thự at PN eeukLHH.khha SH ic hicinaarcsinusisomanie 293.1.2.3 So sánh sự khác biệt các nucleotide của mẫu GLOI so với các mẫu nghiên cứutren th TUIUÐHÝẳáầầầÄẮÄẮẰẮẰẮẰẮÁẮÁẶẮẶẮẶ

3.2.2 Định danh nam rễ nội cộng sinh mẫu ACAUPCR2 -2222+22++22s+2 323.2.2.1 Kết quả và hình ảnh điện di sản phẩm PCR của mẫu ACAUPCR2 32

3.2.2.2 Kết quả BLAST trình tự của ACAUPCR2 2©22222222222222222222222222e2 33

3.2.2.3 So sánh sự khác biệt các nucleotide của mẫu ACAUPCR2 so với các mẫu nghiên

etry 2i8¡1 20,0" ,.ÔỎ 34

3.3 Nội dung 2: Nhân sinh khối bào tử nắm nội cộng sinh trên 3 loại ký chủ khác nhau 35

3.3.1 Đặc điểm chi Glomus sử dung trong nhân sinh khối -.38

3.3.2 Ảnh hưởng của cây ký chủ đến tỷ lệ xâm nhiễm giai đoạn 30, 45, 60NSC 373.3.3 Ảnh hưởng của cây ký chủ đến các dạng cấu trúc VAM xâm nhiễm giai đoạn 30,

TAS AGO! ISIS taastgrpz oxi ce nctne cert ca bane tora tcc eae reese ana 38

3.3.4 Ảnh hưởng của cây ký chủ đến tỷ lệ xâm nhiễm và dạng cau tric VAM giai đoạn

EU T NCO A Ms, ct cect rc Sek Cố ca Tổ TC co 39

3.3.5 Kích thước và sinh khối rễ cây ký chủ - 22 22©22222222E+22+2Exzzxzrrrerrez 423.3.6 Ảnh hưởng của cây ký chủ đến hình thái bào tử chi Glomus sau thí nghiệm 433.3.7 Ảnh hưởng của cây ký chủ đến mật độ bào tử nam và khả năng tăng sinh bào tử 46KET LUẬN VÀ DE NGHỊ -©22©22222221222222122312212211211221211211 2121121121 ee 48TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-2252 2S22S2E2E22E25125121121121121121121121121122122122.22e2 49

PHÙ TL vee eee ee 55

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Viết tắt Viết đầy đủ

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

NCBI National Center for Biotechnology Information

NSC Ngày sau chủng

NT Nghiệm thức

PCR Polymerase chain reaction

PVLG Polyvinyl — lactose — glycerol

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecyl sulphate

TAE Tris — acetate -EDTA

TCVN Tiéu chuan Viét Nam

TE Tris -EDTA

VAM Vesicular Arbuscular Mycorrhiza (Nam rễ nội cộng sinh)

DANH SÂCH CAC BANG

Trang

Bảng 2.1 Câc cặp primer được sử dụng trong khuếch đại DNA nam VAM 17Bang 2.2 Thanh phan hóa chat sử dung cho phản ứng PCR - 2-22 ©2222z55225 19

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PC - 5-5-5252 2 S22 E +2 re 20

Bang 2.3 Kết quả phđn tích giâ thĩ nhđn sinh khối nam rễ nội cộng sinh trong thí nghiệm

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thâi của 2 loăi VAM hiện diện phô biến trong đất trồng sầu riíng

Ixi ni T0En TRÍ 8Í ences neice 26

Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng vă bao phủ trình tự mẫu GLOI so với câc nghiín cứu trín thế

Bảng 3.3 Câc vị trí nucleotide sai khâc của mẫu GLOI so với câc mẫu nghiín cứu trín

TU ao nỗ 7ẪPÐBSẪ7ÏŸ7Ỷa Ỷẽ n ẽ ẽn nồG nan Ý“ỶỶnnẽaTns.a.=nsa.a m 30Bảng 3.4 Tỷ lệ tương đồng vă bao phủ trình tự mẫu ACAUPCR2 so với câc nghiín cứutren thĩ SiO 0777 ‹ 33Bang 3.5 Câc vị tri nucleotide sai khâc của mau ACAUPCR2 so với câc mẫu nghiín cứu

ee 34Bang 3.6 Anh hưởng của cđy ky chủ đến câc dang cau tric VAM xđm nhiễm giai đoạn

SOAS OTS Csr assez ts rec a tate oe hoe el a Es 38

Bang 3.7 Ảnh hưởng của cđy ký chủ đến xđm nhiễm vă dang cau trúc VAM giai đoạn

1008/1019: 39

Bảng 3.8 Kích thước vă sinh khối rễ cđy ký chủ sau 90 ngăy được cấy VAM 42

Bảng 3.9 Đặc điểm hình thâi băo tử chi Glomus sau khi nhđn nuôi bằng cđy ký chủ khâc

[TM 2V ee 43

Bảng 3.10 Đặc điểm hình thâi của băo tử trước vă sau thí nghiệm - - 45

Bang 3.11 Ảnh hưởng của cđy ký chủ đến mật độ băo tử/chậu, khối lượng giâ thĩ, khả

năng tăng sinh BAO t¡scccsesssxi161606116661460395975586066596850560993559580135009991350159V08356599007910386E8 46

DANH SÁCH CÁC HÌNH

; Trang Hinh 1.1 A) Bao tử (Spores), B) Soi nâm (Hypha) - 5 5555 +++£+*+vEeerrersrrrrrke 4 Hình 1.2 A) Túi (Vesicles), B) Bui (Arbuscules) 5 2222232221132 c2 zrerrrererrer 6

Hình 1.3 Gen DNA ribosome 18S với vi trí gan mỗi của cặp mỗi NS1/NS4 và

AMIELAML2 waikichithuoe DNA sctnnosontigttginhggtontE89GSI0GRSIS0GG560G00IG020S10Eã0S00đ/00880 12

Hình 2.1 So đồ bố trí thí mghiGim oo cece ccc ccc ccc ccssesseessessessesseeseesuesseeseessesseseseeseeseeees 23

I?0)1.E0s/sái00 06/2/7660 1 57

Hình 3.2 Bào tử loài Acaulospora sp (xem ở vật kính 40X) -c2-c<csc- ZlHình 3.3 Kết quả điện di san phẩm PCR của mẫu GLOI được khuyéch đại dựa trên kỹ

thuật Nested PCR: sacseebnbiisiBnoei ii SEA0 G5 EHOES GÀEHSQD HỤEEGEESIĐINHOÚEg S3 BÌG)S2 G3Hb2G10B18SSAB.SD0ASAGUSEERSG gEAEEQ, 28

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu ACAUPCR2 được khuyếch đại dựa trên

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Nam rễ nội cộng sinh (VAM) là nhóm sinh vật cộng sinh phổ biến nhất trong hệ

sinh thái đất, nam rễ nội cộng sinh tạo quan hệ tương hỗ với 80% các loài thực vật sống

trên cạn và đối với cây trồng khoảng 90% (Smith và Read, 2008) Nam Vescular

Arbuscular Mycorrhiza (VAM) giữ vai trò quan trọng trong mối quan hệ giữa thực vật

và cũng là nơi sinh trưởng của nam rễ nội cộng sinh (Begoude va ctv, 2016) Sự cộng

sinh giữa nam và rễ là hình thức hỗ sinh trong đó nắm thâm nhập qua tế bao vỏ của rễ cây,màng sinh chat của tế bao chủ bao quanh sợi nam, tạo ra những vòng xoắn của sợi nam ởbên trong tế bào Cả hai bên sử dụng chất dinh dưỡng trong mối quan hệ tương hỗ, namVAM giúp thực vật lay dinh dưỡng như photpho, sulfur, nitrogen, kali và các vi lượng từ

đất (Smith và Read, 2008; Roy-Bolduc và Hijri, 2011) Các nghiên cứu đã cho thấy nam

rễ nội cộng sinh đem lại rất nhiều lợi ích cho cây trồng và tăng hiệu quả kinh tế cho người

dân và phù hợp với sự phát triển của nền nông nghiệp bền vững ngày nay (Lưu Thị Thúy

Hải và ctv, 2022).

Sầu riêng được mệnh danh là “nữ hoàng” của các loại trái cây nhiệt đới và rất được

ưa chuộng ở các nước Đông Nam Á Việc định danh nắm rễ nội cộng sinh ở sầu riêng hiện

nay cũng đã được thực hiện trên một số nghiên cứu nhưng hau hết các nghiên cứu nàychỉ dừng lại ở định danh dựa trên hình thái, màu sắc, kích thước của các bao tử Phươngpháp định danh này thường bị giới hạn khi xác định đến cấp loài và đôi khi dé bị nhằm

lẫn (Raja và ctv, 2017) Vì vậy, việc kết hợp giữa định danh hình thái và sinh học phân

tử có ưu điểm là sẽ cho kết quả chính xác đặc biệt là các loài gần, loài đồng hình (Hồ ViếtHiếu và ctv, 2018, Raja và ctv, 2017)

Với lợi ích mà nam rễ nội cộng sinh đem lại thì ứng dụng nam rễ nội cộng sinh

vào sản xuất sầu riêng nói riêng và các loại cây trồng nói chung là rất cần thiết Theo

Murugan & Anil (2017) cho đến nay, nam VAM không thé nuôi cấy được mà chỉ có thé

nhân sinh khối bằng cây ký chủ, mức độ xâm nhiễm của bào tử nắm rễ cộng sinh phụ

thuộc vào sự sinh trưởng và phát triển của cây ký chủ và môi trường Việc chọn cây ký

chủ có ảnh hưởng rat lớn đên việc sản xuât bao tử và sự xâm nhiễm mycorrhiza trong ré

cây ký chủ Cây ký chủ được sử dụng dé nuôi cấy nam mycorrhiza phải đảm bảo các tiêuchí chịu được điều kiện nhà kính, có bộ rễ phát triển rộng, phù hợp với sự phát triển củanắm mycorrhiza (Prameswari, 2021).

Từ những van dé trên, việc định danh nam rễ nội cộng sinh phô biến trong dat vùng

rễ sầu riêng bằng sinh học phân tử và nhân sinh khối trên các loại cây trồng là vô cùngcần thiết, dé phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo Vì vậy, đề tài “Dinh danh nam rễ nội

cộng sinh Vesicular Arbuscular Mycorrhiza trong rễ sầu riêng bằng kỹ thuật sinh học

phân tử và ảnh hưởng của cây ký chủ đến khả năng nhân giống nam rễ nội cộng sinh” đãđược tiến hành

sản phẩm PCR đạt chất lượng tốt, thích hợp cho giải trình tự

Bồ trí thí nghiệm trong chậu, theo dõi các chỉ tiêu đúng phương pháp, đánh giáảnh hưởng của các loại cây ký chủ đến khả năng tăng sinh bào tử và sinh khối của rễ cây

ký chủ trong nhà mảng.

Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2023 - 05/2024, các thí nghiệm được thực hiệntại phòng thí nghiệm và Trại thực nghiệm khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâmthành phố Hồ Chí Minh

Do kinh phí có hạn nên chỉ giải trình tự 2 loài hiện diện phổ biến trong đất trồng

sầu riêng tại Tiền Giang

Do giới hạn về số lượng bào tử nên chỉ nhân sinh khối trong chậu với lượng banđầu từ 15 bào tử/chậu và 5 chậu/ô thí nghiệm

Thời gian làm đề tài ngắn nên chỉ đánh giá sinh khối trên 1 chu kỳ và trên 3 loại cây trồng

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan nắm rễ nội cộng sinh Vescular Arbuscular Mycrorrhiza (VAM)

Thuật ngữ Mycorrhiza được Frank - nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức đưa ra

dé chỉ mối quan hệ giữa nam đặc biệt giữa nam cộng sinh và rễ cây Nam rễ nội cộng

sinh VAM được xác định là mối quan hệ không thé thiếu ở hầu hết các loài thực vật hơn80% các loài thực vật có kha năng hình thành cộng sinh 10 với nam rễ (Newman vàReddell, 1987) Su két hợp đó mang lại lợi ich cho cả thực vật va nam rễ VAM, qua đó

nam rễ VAM có được các hợp chất đồng hóa từ thực vật dé sống Đồng thời, nhờ nắm rễ

VAM cây có thê tăng cường khả năng hấp thu nước, các chất hữu cơ hòa tan trong đấtgiúp chống chịu với các yếu tố bệnh hại cũng như các chất độc kim loại nặng Do đó, có

tác dụng cải tạo và ồn định cấu trúc đất, cân bằng hệ sinh thái (Brundrett và Tedersoo,

2018).

1.1.1 Phân loại

Ước tính trên thế giới hiện có khoảng 1000 chi thuộc 200 họ thực vật có quan hệcộng sinh nam rễ Có 535 loài nắm thuộc 81 chi, 30 ho,10 bộ nam có thé cộng sinh vớitrên 1500 loài cây gỗ khác nhau (Trappe, 2005) Dựa trên đặc điểm xâm nhiễm của nam

vào rễ cây chủ, Mycorrhiza được phân thành 3 nhóm là ngoại cộng sinh

(Ectomycorrhiza), nội cộng sinh (Endomycorrhiza) và nội — ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrh1za) (Smith và Read, 1997).

1.1.1.1 Nam rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza)

Soi nam bao quanh rễ dinh dưỡng, không xuyên qua mô tế bào mà chỉ kéo daigiữa các vách tế bào Các sợi nam đan chéo nhau hình thành một màng nắm trên bề mặt

rễ dinh dưỡng Thé sợi nam sinh trưởng hình thành mạng lưới giữa các tế bào tang vỏ

rễ gọi là Hartig Rễ nắm ngoại cộng sinh có hình dạng và màu sắc nhất định rất dễ nhận

biết bằng mắt thường (Trần Văn Mão, 2004)

1.1.1.2 Nắm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza)

Thể sợi nắm có thé xuyên qua tế bào bên trong rễ cây chủ, không biến đổi hình

thái, không hình thành màng nấm trên bề mặt rễ, vẫn giữ nguyên lông hút Thể sợi namvẫn kéo dai giữa gian bào nhưng không hình thành lưới Hartig Nam rễ nội cộng sinh chialàm hai loại: sợi nắm không có vách (Aseptate endotrophic mycorrhiza — AEM) và sợi

nam có vách ngăn (Septate endotrophic mycorrhiza — SEM), những loại này thường khónhận biết bằng mắt thường Bên cạnh đó, loại sợi nắm không có vách ngăn thường códạng túi bóng (Vesicular) và dang chùm (Arbuscular), gọi là nam dang túi chùm

(Vesicular Arbuscular mycorrhiza — VAM) (Tran Văn Mão, 2004)

1.1.2 Thanh phan cấu trúc nắm rễ nội cộng sinh

1.1.2.1 Cấu trúc ngoại bào

Bao tử: Bào tử vô tính, hình cầu lớn (20 — 1000 um) được tạo thành từ sợi nam

trong đất hoặc rễ Bào tử thường có chức năng dự trữ, là giai đoạn tiềm sinh và cũng là

yếu tô lan truyền giống Soi nam (hypha): mạng lưới sợi nắm trong đất có hình dang sợimỏng Chức năng của sợi nam là hap thu chất dinh dưỡng, gia tăng sự kết hợp với rễ cây

trồng và hình thành bào tử Sợi nắm có khả năng phát triển giới hạn, chúng sẽ chết saukhi nảy mầm vài tuần nếu không gặp được rễ cây ký chủ (Soura, 2015)

Soi nam (hypha): Năm 2004, Peterson va ctv nhận định rang sự hình thành namnội cộng sinh VAM có liên quan đến hàng loạt các bước từ sự tiếp xúc với rễ đến sự hìnhthành vòi bám, xâm nhập vảo tê bao biêu bì, sự phát triên của sợi nam nội bảo và bụi

trong một số trường hợp hình thành cấu trúc túi

Sự cộng sinh có thé bắt đầu từ sự nảy mam cia bao tử khi gap điều kiện thuận lợi,

bao tử hình thành ống mầm và phát triển thành sợi nam ngoại bao Các sợi nam này cảmứng được sự hiện điện của rễ cây và phát triển hướng đến rễ Dé phát triển tất cả các cau

trúc bên trong, các sợi nam phải tiếp xúc với bề mặt của tế bao biểu bì rễ hoặc lông hút

rồi hình thành một câu trúc đặc biệt gọi là vòi bám, sau đó xâm nhập vào lớp biéu bì trướckhi đến tế bảo rễ Tại những vị trí mà sợi nắm tiếp xúc với bề mặt rễ, nơi mà các vòi bámhình thành vào xâm nhập vào rễ gọi là điểm xâm nhiễm Sợi nắm khi tiếp xúc với bề mặt

rễ có thé hình thành nhiều điểm xâm nhiễm

Bụi (Arbuscules): Được hình thành do sự phân chia nhiều lần và giảm dần về độ

day của sợi nam bat đầu từ sợi nắm đầu tiên (đường kính 5 - 10 1) và kết thúc bởi sự gia

tăng của những sợi nhánh (đường kính <1) Bui được xem là nơi cộng sinh chính giữaVAM và cây ký chủ Bụi chỉ sống được vài ngày và bắt đầu phân hủy nhưng sợi nắm vàtúi có thể tổn tại trong rễ trong vai tháng hoặc vài năm (Smith và Read, 1997)

Túi (Vesicle): Phát triển dé tích lũy sản phẩm dự trữ ở nhiều loại VAM Túi là nơiphinh to lên của sợi nam, nằm trong tế bào vỏ rễ hoặc bên ngoài gian bảo Túi có thé pháttriển bên trong rễ gia và có chức năng như yếu tố lan truyền giống Một vài nắm có cautrúc túi giống như bao tử trong đất (Hoàng Tuấn Dũng, 2007)

(Rios-Ruiz và ctv, 2019) Hinh 1.2 A) Tui (Vesicles), B) Bui (Arbuscules)

1.1.3 Co chế cộng sinh và mối liên hệ giữa nắm nội cộng sinh với cây ký chủ

Sự cộng sinh Mycorrhiza bat đầu bằng sự nảy mầm từ một yếu tố lan truyền giốngđược lưu giữ trong đất, yếu tố đó là bào tử của VAM hoặc là những mảnh rễ có mycorrhizacộng sinh Soi nam cảm ứng được sự hiện diện của rễ bằng sự phát triển hướng vào rễ,

thiết lập sự tiếp xúc và phát triển đọc theo bề mặt rễ Tiếp đến, một hoặcnhiều sợ nắm

sinh ra khôi u gọi là giác bám, bám giữa hai tê bảo biêu bì.

Các soi nam hoặc bao từ nam tổn tại trong đất hoặc rễ cây ở điều kiện thích hợp

sẽ phát triển mạnh và hướng vào rễ chủ Một hệ thống rễ phụ phát triển trong đất tăngcường hấp thụ dinh dưỡng cho cây Tuy nhiên, nam rễ cộng sinh từ lâu cũng đã được biết

đến có khả năng ngăn chặn các bệnh hại ở cây ký chủ và những ảnh hưởng ức chế này đãđược chứng minh cả trên và đưới mặt đất, đã được hệ thống hóa và mở rộng qua nhiều

nhóm bệnh hại (Smith và Read, 2008).

1.1.4 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh VAM đối với cây trồng

Đến nay có rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò của nắm rễ VAM trong việc

làm tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng cho cây chủ đặc biệt là hấp thu P trong đất Qua

đó, thực vật được nam rễ VAM cộng sinh có 2 con đường hấp thu dinh dưỡng (Smith và

và Read ,1997) Cây ký chủ có thé hap thu dinh dưỡng trực tiếp từ sự vận chuyên chất

dinh dưỡng qua lớp biểu bì hoặc lông hút, con đường còn lại là sự hap thu chất dinh dưỡng

gián tiếp nhờ sự cộng sinh của nam rễ VAM (Nagy và ctv, 2009)

Theo Jakobsen và ctv (1992) thì sự khác biệt giữa nắm trở nên rõ nét hơn khi dòng

P được thể hiện trên cơ sở chiều dai nam Hệ sợi nam ngoại bào kéo dài thống rễ giúp câychủ tiếp cận lượng P trong đất từ con đường cộng sinh với nam rễ đáng ké hơn con đường

tự hap thu (Nagy và ctv, 2009) Bên cạnh đó, một yếu tô dinh dưỡng không thể thiếu đối

với cây trồng là đạm (N) Nam VAM có thé đây nhanh quá trình phân hủy chất hữu co,

qua đó tăng khả năng tiếp nhận và hap thu nitrate (Javot, 2007) Năm 1993 Frey cho rangcác sợi nam của VAM có thé cải thiện hiệu quả hấp thu N vô cơ cao hơn; nam Glomusintraradices và Gigaspora margarita vận chuyền hơn 30% N đến cây bắp Mặc dù nam rễVAM có thể có thé truyền một phần N đến cấy chu (Hodge va Fitter, 2010), tuy nhiênHeyden và ctv (2015) lại cho rằng nắm rễ VAM thu được N từ phân hủy chất hữu cơ và

sử dụng N chủ yếu cho sự phát triển và sự trao đổi chất của chúng, làm cho chúng cạnhtranh cây ký chủ Nam rễ VAM là dạng cộng sinh bắt buộc, và việc trao đối chất dinhdưỡng hai chiều giữa nắm và cây ký chủ là một đặc điểm quan trọng đối với tính năngcộng sinh, do đó cây ký chủ cũng cung cấp một lượng sản pham quang hợp cho nam rễsinh trưởng và phát triển (Wright và ctv, 1998) Việc trao đổi chất dinh dưỡng giữanam VAM và cây chủ là nhờ vào sự phát triển của cau trúc sợi nam và bụi trong tế bao.Khi bụi của nắm VAM tiêu biến từ đó giải phóng một lượng dinh đưỡng vào tế bào rễ

Su hấp thu chất dinh dưỡng trong đất của nam rễ chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như pH

đất, nhiệt độ (Gavito và ctv,2005) Bên cạnh đó hiệu quả hấp thụ chất dinh dưỡng của

nam rễ có thê bị ảnh hưởng bởi sự phân bó không gian (chiều dai) của sợi nam ngoại baotrong đất (Jakobsen và ctv, 1992)

Ngoài việc làm tăng khả năng hấp thu dinh đưỡng, nắm rễ VAM còn có rất nhiềuvai trò khác như: giúp tăng khả năng chống chịu cây trồng trong các điều kiện bắt lợi khicộng sinh với cây (Habte và Soedarjo, 1996; Gavito và ctv, 2005) Nắm rễ VAM và vikhuẩn có lợi có thể cùng ton tại ma không ảnh hưởng với nhau, do đó sự kết hợp này cóthé làm tăng sự phát triển của cây trồng, tăng sức dé kháng và chống lại các tác nhân gâybệnh (Akhtar và Siddiqui, 2008) Nắm rễ VAM cộng sinh với cây trồng làm giảm khoảng

7% truyền trùng gây hại (Hol và Cook, 2005) Akhtar và Siddiqui (2008) cũng nhận thấy

khi kết hợp Glomus intraradices, Pseudomonas alcaligenes, và Bacillus pumilus làmgiảm sự nhân lên của tuyến trùng (56 - 66%) Ngoài ra kích thích cây chủ sinh trưởng vaphát triển, tăng khả năng ra hoa và thụ phan (Ploulton va ctv, 2001)

1.2 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nam rễ nội cộng sinh VAM

1.2.1 Các nghiên cứu trong nước

Việc nghiên cứu nam rễ nội cộng sinh đang trở thành một hướng phát triển ở Việt

Nam nhằm đáp ứng các nhu cầu về ứng dụng nấm rễ nội cộng sinh vào sản xuất nông

nghiệp Tuy nhiên các nghiên cứu còn mới và thường chỉ dừng lại ở mức độ phân lập,

định danh và nghiên cứu vai trò của Vesicular Arbuscular Mycorrhiza trong việc hap thu

lân trên cây trong.

Năm 2012, Nguyễn Thị Kim Liên và ctv đã phân lập được 16 loài thuộc 6 chỉ nắmVAM trong đất trồng cam tại Quỳ Hợp, Nghệ An Đỗ Thị Xuân (2016) đã định danh được

bốn chi nam là Acaulospora, Entrophosphora, Glomus, Gigaspora trong đất trồng bap,

mè, ớt tại TP Can Thơ Nguyễn Thị Minh va Nguyễn Thu Hà (2016) đã tuyển chọn được

2 chủng Arbuscular Mycorrhizae (Gigaspara, Acaulospora) 3 chủng Rhizobium đều là

những chủng sinh trưởng, phát triển nhanh, có sức sống và khả năng cộng sinh cao vớicây trồng, có thé dùng làm giống dé sản xuất vật liệu sinh học đề làm giống sản xuất vậtliệu sinh học Lê Thị Hoàng Yến (2017) đã phân lập được 15 loài nam thuộc 8 chi nắm

rễ cộng sinh VAM trong đất trồng bắp tại Hà Nội

Bên cạnh đó nhóm tác giả Lê Thị Kim Duyên và ctv (2019) bằng phương phápphân loại dựa vào hình thai, đã phân loại được 8 chi và 27 loài, nghiên cứu kha năng cộng

sinh của nắm rễ lên cây chủ trên các môi trường gồm cát, xơ dừa và đất dinh dưỡng đượctrộn với tỉ lệ khác nhau Kết quả cho thấy môi trường có tỉ lệ cát/xơ dừa/ đất dinh dưỡng

với tỉ lệ 1:1:1 là môi trường thích hợp nhất cho sự cộng sinh của VAM vào cây chủ

Nguyễn Vũ Phong và ctv (2021) cũng đã nghiên cứu đặc điểm và xác định thành

phần ton tại của nắm rễ nội cộng sinh trong đất trồng hồ tiêu đã xác định sự hiện diện của

nam nội cộng sinh rễ thuộc chi Acaulospora, Gigaspora, Glomite, Glomus vàScutellospora, trong đó Glomus va Acaulospora là hai chi pho biến nhất Khi nhân nuôihỗn hợp nắm cộng sinh hệ số nhân đạt khoảng 8,5 lần trên cây bắp (Zea mays) so với 6,5lần trên cây cao lương (Sorghum bicolor) hay cỏ man trầu (Eleusine indica) sau 40 ngày

Hom hồ tiêu giâm trên giá thé b6 sung hỗn hợp nam rễ cộng sinh có chiều cao hom, số

lượng rễ và khối lượng rễ tươi cao hơn có ý nghĩa so với cây đối chứng

1.2.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Đến nay việc nghiên cứu mycorrhiza trên thé giới rất phát triển các nghiên cứu rat

đa dang chủ yếu là các nghiên cứu chuyên sâu như vai trò của nam rễ nội cộng sinh

(VAM) đến sự hấp thu dinh dưỡng của cây trồng (Koide, 1991; Smith va ctv, 1996) Việcphân loại nam VAM được tiến hành từ rất sớm ké từ khi nắm VAM được nghiên cứu đếnnay Gedermann và Trappe (1974) đã phân loại VAM thành 44 loài thuộc 7 chi nam của

họ Endogonaceae.

Năm 1990, Morton va Benny đã phân loại Gomerales thành 3 họ là Glomeraceae,

Acaulosporaceae và Gigasporaceae Trong đó, họ Glomeraceae gồm 2 chi nam làGlomus và Sclerocystic,; Acaulosporaceae gồm 2 chỉ nam là Acaulospora vàEntrophospora, cuỗi cùng là 2 chi nam Gigaspora và Scutellospora thuộc họ

sử dung phương pháp cấy đơn và kép 2 loài bao tử trong điều kiện nhà kính

bắp nhờ chủng 10 g nam rễ nội cộng sinh (Glomus versiforme) ở dạng rễ bắp và cho khô

hạn vừa và khô hạn nặng trong 30 ngày Kết quả cho thấy hạn hán ở cả hai mức độ nàylàm giảm chiều cao cây cũng như hàm lượng chất điệp lục và caroten, do đó cản trở quátrình quang hợp Tuy nhiên, việc chủng VAM đã cải thiện đáng ké tác động có hại củaton thương oxy hóa do hạn hán gây ra, làm tăng hàm lượng các chat hòa tan tương thích.Nhờ đó mà chiều cao cây và trọng lượng khô được cải thiện đáng kể

Nghiên cứu về nam rễ nội cộng sinh ở cây rầu riêng tai quận Manokwari, Indonesiacủa nhóm tác giả Suharno va ctv (2019) cho thay ty lệ nam rễ nội cộng sinh (VAM) daođộng từ 39,29 đến 80,00%, số lượng bao tử là 112 — 336 bào tử trên 100 gam mau dat

Dựa trên các đặc điểm hình thái bào tử nhóm tác giả đã định danh các chi chiếm ưu thégồm Glomus, Scutellospora và Acaulospora

1.3 Tong quan vé PCR va Nested PCR

1.3.1 Giới thiệu về PCR

PCR là khuếch đại một đoạn DNA được chứa trong eppendorf dựa vào sự thay đôicủa nhiệt độ Khuéch đại được thực hiện trong một eppendorf nhỏ chứa dung dịch phảnứng (gọi là PCR mix) có thé tích vào khoảng từ 10uL đến 50uL với các thành phan chủ

yêu là enzyme polymerase chịu nhiệt, thường sử dụng là Taq polymerase, có hoạt tính tối

đa ở 72°C và bền được với nhiệt độ; 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine,

Thymine, Guanine, va Cytosine thường được gọi là dATP, dTTP, dGTP va dCTP; DNA

đích sẽ được khuếch dai; các đoạn primer (được gọi là primer) xuôi và ngược là các đoạn

oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 — 30 nucleotide có trình tự bé sung đặc hiệu vớitrình tự ở 2 đầu đoạn DNA đích; ion Mg”* trong muối MgCl, có nồng độ thích hợp; dungdịch đệm dé làm dung môi cho phản ứng Eppendorf được đặt vào buồng ủ chu kỳ nhiệtcủa máy luân nhiệt (thermal cycler), thường gọi là máy PCR, chu trình nhiệt trong máy

được cài đặt và làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đôi theo từng chu kỳ

của chu trình nhiệt, nhờ vậy mà phản ứng khuếch đại DNA sẽ xảy ra (Ramesh va ctv,

1992).

Về mat nguyén tac, mét chu ky nhiét d6 sé bao gom 3 giai đoạn là giai đoạn biến

tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài Ở giai đoạn biến tính nhiệt độ sẽ được đưalên 94°C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA bị bẻ gãy và tách thànhcác mạch đơn Ở giai đoạn bat cặp, nhiệt độ sẽ được hạ đến 55°C — 65°C, là nhiệt độ thích

hợp dé các đoạn primer tìm đến bắt cặp bé sung vào hai đầu của đoạn DNA đích Cuối

cùng là giai đoạn kéo dài, nhiệt độ sẽ lại được đưa lên 72°C, là nhiệt độ thích hợp chohoạt tính của enzyme Taq polymerase kéo các dNTP gắn vào đầu 3° của đoạn primer đang

bắt cặp trên đầu 5° của sợi DNA đích dé bắt đầu cho sự tong hop nén mach bô sung cho

mạch DNA đích Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đã được nhân bản thành hai

bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích

đã nhận bản được thành 2°° đến 2" bản sao, tức là đến hàng ty bản sao

1.3.2 Giới thiệu về Nested PCR

Nested PCR là một sự cải tiến của PCR được thiết kế nhằm dé cải thiện độ nhạy

và độ đặc hiệu Nested PCR liên quan đến việc sử dụng hai bộ mồi và hai phản ứng PCRliên tiếp Bộ mỗi đầu tiên được thiết kế dé gắn vào các trình tự ngược dòng từ bộ mồi thứhai và được sử dụng trong phản ứng PCR ban đầu Các bộ khuếch đại thu được từ phảnứng PCR đầu tiên được sử dụng làm khuôn mẫu cho bộ mồi thứ hai và bước khuếch đạithứ hai Độ nhạy và độ đặc hiệu của quá trình khuếch đại DNA có thể được tăng cườngđáng ké bang kỹ thuật này Tuy nhiên, khả năng nhiễm có thé tăng bởi khi thao tác bốsung các sản phẩm DNA đã khuếch đại Dé giảm thiểu việc nhiễm mẫu, các phần khác

nhau của quy trình nên được tách biệt về mặt vật lý với nhau, tốt nhất là trong các phòng

hoàn toàn riêng biệt Bộ khuếch đại từ các xét nghiệm Nested PCR được phát hiện theocách tương tự như trong PCR ở trên (Michael và Joseph, 2019).

1.4 Cơ sở và nghiên cứu về các primer sử dụng trong phản ứng Nested PCR

Primer (còn có tên gọi khác là đoạn môi) là một sợi nucleic acid (hoặc ribonucleic

acid) dùng dé làm đoạn khởi đầu cho quá trình nhân đôi của DNA Hầu hết các DNA

polymerase (enzyme xúc tác quá trình nhân đôi DNA) không thê bắt đầu tông hợp một

đoạn DNA mới mà thiếu primer Vì nó chỉ gắn các nucleotide vào sợi primer có sẵn theonguyên tắc bổ sung với sợi khuôn Các primer cần thiết cho quá trình tổng hợp DNA là

một đoạn ngắn của sợi RNA Soi RNA này được sinh ra bởi RNA polymerase, và sau đóđược loại bỏ và thay thế bằng DNA nhờ DNA polymerase

Nhiều kỹ thuật phòng thí nghiệm về lĩnh vực sinh học phân tử có liên quan đến

DNA polymerase, như giải trình tự DNA (DNA sequencing), chuỗi phản ứng PCR

(Polymerase chain reaction) Cac primer sử dụng cho các kỹ thuật đó thường là nhữngphân tử DNA ngắn được tông hợp nhân tạo với chiều dai khoảng 20 bases Trong chuỗi

phản ứng PCR, các primer được sử dung dé xác định đoạn DNA được khuếch dai bởi quá

trình PCR Chiều dài của primer thường không quá 50 nu vì DNA thường là sợi đôi, chiềudai của nó có giá trị trong các cặp base Chiều dai của DNA soi đơn có giá trị trong cáccặp base hay các nu chúng bắt cặp chính xác với đoạn bắt đầu và đoạn kết thúc dé khuếchđại Hầu hết các phòng thí nghiệm không tự tổng hợp được primer, nên sẽ được đặt làmbởi các công ty.

Phương pháp sinh học phân tử đã trở thành tiêu chuan dé nghiên cứu các cộngđồng VAM (Gorzelak và ctv, 2012) Đặc biệt là các công nghệ giải trình tự cho phép xácđịnh đặc tính hiệu quả cao của các cộng đồng vi sinh vật bằng cách giải trình tự cáckhuếch đại cỡ trung bình (200-600 bp) hiện thường được sử dụng (Opik va ctv, 2009).RNA ribosome (rRNA) thường được sử dụng chủ yếu dé định danh nấm VAM chủ yếu

là do khả năng phân giải cao và khả năng liên kết giữa các nhóm phân loại rộng(Stockinger và ctv, 2010, Schoch va ctv, 2012) Trong khi vùng ITS đã được đề xuất làmvùng tiêu chuẩn cho nam (Schoch và ctv, 2012), nhưng đối với VAM vùng này đặc biệt

biến đổi và khó phân biệt được các loài có gần giống nhau về gen Vì vậy, Stockinger và

ctv (2010) đã đề xuất vùng 1500 bp, bao gồm một đoạn gen Rrna trong vùng SSU, toàn

bộ vùng ITS và một phan gen rRNA vùng LSU dé mã hóa DNA VAM

Do đó, việc sử dụng cặp môi chính xác dé thực hiện phan ứng Nested PCR nam rénội cộng sinh VAM là rat quan trọng Một số nghiên cứu đã thiết kế các cặp môi các môiđặc trưng cho loài có thé được sử dụng dé khuếch đại gen từ các loại nam đã biết từ mẫu

rễ có sự xâm nhiễm của VAM (Abbas và ctv, 1996)

Trong thí nghiệm của Kjøller và Rosendahl (1999), hai mồi LSU0061 và LSU0599

đã được sử dụng trong lần khuếch dai DNA đầu tiên cho sản phẩm có kích thước 700 bp

Sau đó sản phẩm PCR từ lần khuếch đại đầu tiên được pha loãng 10 lần và sử dụng 1 pl

trong PCR lồng nhau với cặp mỗi đặc hiệu LSURK4f / LSURK7r Kết quả cho thayLSURK4f / LSURK7r khuếch đại các sản pham PCR phân lập của Glomus mosseae,Glomus caledonium va Glomus coronatum là 300 bp cho thay tính đặc hiệu với loàiGlomus Đồng thời sự kết hợp Nested PCR giữa 2 đoạn mồi này còn cho phép phát hiệnmột số chủng nắm thuộc VAM xâm nhiễm trong rễ cây ký chủ

Cho và ctv (2006) trong một thí nghiệm thực hiện ly trích DNA của bao tử nắmVAM dựa trên phân loại hình thái, đã ly trích 50 — 60 bao tử/mẫu Trình tự gen SSUrRNA được khuếch đại PCR từ DNA đã được tinh sạch bằng cách sử dụng đoạn môi baoquát bên ngoài NS1/NS4 cho phan ứng PCR đầu tiên có kích thước 1100 bp và đoạn môiđặc hiệu VAM là AML1/AML2 (Auh, 2004) cho phản ứng PCR lần 2 có kích thước ~800

bp Các môi sau được thiết kế dựa trên DNA ribosome (18S rDNA) Kết quả cho thấybằng phương pháp này đã định danh thêm, 9 loài thuộc 6 chi, trong đó có 3 loài Glomus,

1 loài Paraglomus, | loài Gigaspora, 2 loài Scutellospora, 1 loài Acaulospora và 1 loài

Archaeospora tại tỉnh Chungbuk Tại tỉnh Chungnam đã xác định được tổng cộng 6 loàithuộc 5 chi như 2 loài Gigaspora, 1 loài Glomus, | loài Scufellospora, | loài Acaulospora

có tính đặc hiệu tốt hơn nhiều và bao phủ tat cả các nhóm VAM đã biết Các đoạn môi

AMLI và AML2 cho thấy khả năng tốt đề tránh khuếch đại DNA không phải nắm rễ nộicộng sinh VAM.

Hình 1.3 Gen DNA ribosome 18S với vị trí gắn mỗi của cặp mỗi NS1/NS4 và

AML1/AML2 và kích thước DNA.

Các cặp mỗi LSU4f/ LSU7r, AML1/AML2 và LSU0061/LSU0599 cũng đã đượcTrần Trọng Nghĩa (2022) sử dụng để khuếch đại DNA nắm rễ nội cộng sinh (VAM) vớiphương pháp nested PCR Phan ứng PCR lần đầu với cặp mỗi AML1/AML2 hoặcLSU0061/LSU0599 với kích thước lần lượt là 800 bp và 700 bp sau đó tiếp tục tiến hànhphản ứng PCR lần 2 với cặp môi LSURK4f/LSURK7r với kích thước 300 bp Kết quacho thay từ 50 mau đất trồng dua leo và 50 mẫu rễ, đã xác định được 16 trình tự thuộcnam rễ nội cộng sinh gồm các loài Acaulospora, Gigaspora, Rhizophagus,

Claroideoglomus.

1.5 Giới thiệu chung về BLAST

Trong tin sinh học, Basic Local Alignment Search Tool hay gọi là BLAST là một

giải thuật để so sánh các chuỗi sinh học, như các chuỗi amino acid của các proteinhay

của các chuỗi DNA khác nhau Khi được cung cấp một thư viện hay cơ sở dir liệu cácchuỗi đó, tìm kiếm BLAST sẽ cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm các chuỗi trình tự vớichuỗi có sẵn mà ta quan tâm

BLAST tìm kiếm những bắt cặp trình tự có điểm số cao giữa chuỗi truy van và các

chuỗi trong cơ sở đữ liệu bằng cách sử dụng phương pháp dựa trên kinh nghiệm(heuristic) dé có thé có tìm được kết quả gần tốt bằng với giải thuật Smith-Waterman

Thuật toán bắt cặp trình tự tối ưu của Smith-Waterman là quá chậm khi tìm kiếm trong

một cơ sở dữ liệu gen quá lớn như Ngân Hàng Gen (GenBank) Bởi vậy, giải thuật

BLAST dùng một hướng tiếp cận heuristic, dù ít chính xác hơn Smith-Waterman nhưng

lại cho tốc độ nhanh hơn gấp 50 lần Tốc độ và sự chính xác tương đối của BLAST là

những cải tiến kỹ thuật quan trọng của các chương trình BLAST và những điều đó chothấy lí do vì sao công cụ này lại là công cụ tìm kiếm phô biến nhất trong tin sinh học

1.6 Cơ sở nghiên cứu về nhân sinh khối nam cộng sinh trên cây ký chủ

Yếu tố quan trọng nhất trong việc lựa chọn cây ký chủ là chọn cây hỗ trợ sự pháttriển của nắm rễ Chủ yếu các cây một lá mầm và thực vật có hệ thống rễ phát triển rộng

là vật chủ rất tốt để nhân giống nam VAM Tuy nhiên cây ký chủ có thé ảnh hưởng đến

sự đa dạng của nắm rễ trong điều kiện được kiểm soát (Franke-Synder va ctv, 2001) Mặc

dù nhiều loại nam VAM được cho là có phạm vi ký chủ rộng, nhưng các loại cây ký chủcho từng loài cần được thực hiện thí nghiệm đánh gia để đảm bảo sự tăng sinh tốt nhấtcủa các loài nắm trong các loại cây ky chủ cụ thể Cây ky chủ được sử dụng dé nhân

giống nam mycorrhiza hoặc bao tử thường được sử dụng là bắp vì có thời gian sinh trưởng

và phát triển nhanh bộ rễ bắp có thé phát triển thành nhiều nhánh nhiều lông hutva phạm

vi phát triển rộng (Sieverding, 1991)

Theo Trần Văn Mão (2004), nắm cần nhiều hợp chất cacbon trong quá trình hình

thành tế bao và trao đồi chất Do đó, nam rễ nội cộng sinh cũng cần nguồn dinh dưỡng

cacbon từ ngoài vào trong thông qua bộ rễ

Kết quả từ thí nghiệm của Atimanav va Alok (2002) về tăng sinh bào tử nam nộicộng sinh trên 5 loại cây ký chu bắp (Zea mays), cỏ định lăng (Medicago sativa), cỏ ba

14 hoa trang (Trifolium alexandrinum), yén mach (Avena sativa), va cao luong (Sorghum

vulgare) đã được cây với một số các loại nam vesicular arbuscular mycorrhizal (VAM)

Trọng lượng khô của chôi, rễ và tổng lượng hap thu P và N của tất cả các cây thử nghiệm

đã tăng lên đáng kể khi cây VAM Sự khác biệt về mức độ phụ thuộc vào nắm rễ nội cộng

sinh đã được quan sat thay giữacác loại cây thức ăn gia súc Cỏ ba lá hoa trang (Trifoliumalexandrinum) cho thấy mức độ phụ thuộc tối đa là 72% so với mức phụ thuộc 5,7% ởcao lương (Sorghum vulgare) Các loài thực vật cho thay sự khác biệt về tỷ lệ xâm lấnVAM, với tỷ lệ xâm nhiễm rễ cao được ghi nhận ở bắp (Zea mays) (76%)

Halim va ctv (2019), da thuc hién thi nghiém về nhân sinh khối 2 loài nắm rễ nội

cộng sinh trên 5 loại cây ký chủ khác nhau gồm: bắp, cao lương, và 3 loại cây thuộc họ

đậu với 10 bào tử/chậu cho thấy số lượng tăng sinh bào tử/50 g đất cao nhất trên cây đậu

ma (Pueraria javanica) với chi Glomus là 38 bào tử và thấp nhất trên đậu bướm(Centrocema pubescens) và bap (Zea mays) với chi Glomus tương ứng là 28 bào tử Tỷ lệxâm nhiễm của bao tử ở rễ của cao lương (Sorgum bicolor) và bắp (Zea mays) cũng đượcđánh giá là phù hợp sử dụng làm cây ký chủ nhân giống nắm rễ nội cộng sinh

Trong một nghiên cứu khác, Nguyễn Văn Hòa và ctv (2019) đã thực hiện thí

nghiệm nhân nuôi nắm rễ cộng sinh trên 2 loại ký chủ là bắp và cao lương trong điều kiện

nhà lưới Kết quả nhân nuôi ở thời điểm 30 ngày cho thấy ký chủ cây bắp và giá thê đất,

cát, than bùn với tỉ lệ 1:1:1 là môi trường nhân nuôi cộng đồng nắm rễ đạt số lượng bào

tử cao nhất (371 bào tử/50 g giá thé) và tỷ lệ bào tử xâm nhiễm nội sinh bên trong rễ bap

là 91%/1 g rễ cao hơn rất nhiều so với ký chủ cây cao lương và giá thé đất, cát với tỉ lệ1:1 với số lượng bao tử (306 bào tử/50 g giá thé) và tỷ lệ bao tử xâm nhiễm nội sinh bên

trong rễ cây cao lương là 77%/1g rễ.

Ugyen và ctv (2022) đã thực hiện thí nghiệm về nhân giống nắm rễ nội cộng sinhchi Glomus trên cây ky chủ bắp (Zea mays L.) và cao lương trong điều kiện nhà màng,

dé xác định khả năng tương thích của cây ký chủ và nam nội sinh bản địa bao gồm VAM

trong môi trường nuôi nhân giống mới, sự xâm nhiễm của nam VAM được xác định trong

rễ của cây sau 10 tuần trồng Kết quả cho thấy rằng việc trồng bắp (Zea maysL.) và caolương (Sorghum bicolor (L.) Moench) xen canh, làm tăng đáng ké mật độ bao tử so vớiphương pháp trồng riêng lẻ bap (Zea mays L.) va cao lương (Sorghum bicolor (L.)

Moench) Sự hiện diện của các cấu trúc VAM trong rễ cây ký chủ trongvòng 10 tuần đã

chứng minh rằng bắp (Zea mays L.) và cao lương (Sorghum bicolor (L.) Moench) có thé

bị VAM xâm chiếm và sử dụng làm cây ký chủ để nhân giống nắm rễ nội cộng sinh

(VAM).

Như vậy dựa trên kết qua các nghiên cứu về nhân sinh khối VAM trên các cây ký

chủ khác nhau cho thấy hiệu quả của các cây ký chủ khác nhau khi nhân sinh khối cácchi VAM khác nhau Cho đến hiện tại chưa tìm thấy những nghiên cứu về nhân sinh khốiVAM trên cây sau riêng Chính vì vậy, nghiên cứu đã được tiến hành

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu đề tài

Nội dung 1: Định danh nam rễ nội cộng sinh hiện diện pho bién trong dat trongsau riêng tại Cai Lay, Tiền Giang bằng kỹ thuật sinh học phan tử

Nội dung 2: Nhân sinh khối nắm rễ nội cộng sinh bằng 3 loại cây ký chủ khác

nhau

2.2 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ thang 8 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023, tại phòng thinghiệm và nhà màng Trại thực nghiệm của khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâmthành phố Hồ Chí Minh

2.3 Nội dung 1: Dinh danh nam rễ nội cộng sinh hiện diện phổ biến trong đất trồngsầu riêng tai Cai Lay, Tién Giang bang ky thuat sinh hoc phan tt

2.3.1 Vat liệu thí nghiệm

2.3.1.1 Mau dat vùng rễ đất trồng sầu riêng

Mẫu đất vùng rễ sầu riêng có nguồn gốc tại Cai Lậy, Tiền Giang được cung cấpbởi bộ môn Cây lương thực — Rau hoa quả, Khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm

TP.HCM.

2.3.1.2 Các cặp mỗi được sử dung trong nghiên cứu

Phan ứng Nested PCR được sử dụng trên 2 cặp mỗi gồm NSI/NS4 và

AML1/AML2, LSU059/LSU061 và LSU4ØLSU7r Phản ứng PCR lần một sử dụng mồiNS1/NS4 hoặc LSU059/LSU061 sau khi có kết qua PCR lần một tiếp tục sử dụng lượngDNA của sản phản lần một pha loãng 10 lần và sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứngPCR lần 2 với cặp mỗi AMLI/AML2 hoặc LSU4fLSU7r

Bảng 2.1 Các cặp primer được sử dụng trong phản ứng PCR nam VAM

Nhiệt

Kích 7

; độ Nguôn

Trình tự nucleotide 5’ - 3’ thước Primer nóng tham

dự

chảy “4 khao kién

moi NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC 53°C Resi

NS4 CTTCCGTCAATTCCTTTAAG 54,3 °C Lee va ctv,

AML1 ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA — 58°C Scat 2008

P AML2 GAACCCAAACACTTTGGTTTCC 60°C

LSU0061 AGCATATCAATAAGCGGAGGA 60°C

700 bp Kjoller va LSU0599 TGGTCCGTGTTTCAAGACG 56°C

Rosendahl, LSU4f GGGAGGTAAATTTCTCCTAAGGC 68°C

300 bp 2000 LSU7r ATCGAAGCTACATTCCTCC 56°C

2.3.1.3 Hóa chat

Hoa chat ding trong ly trich DNA: PCI (Phenol Chloroform: Isoamyl Alcohol

25:24:1), CI (chloroform isoamylalcolhol 24:1), Lysis buffer (Tris - HCL 200 mM, NaCl

250 mM, EDTA 25 mM, SDS 0,5%,pH =8), TE 1X (Tris -HCL 10 mM, EDTA 1 mM,

pH =8), Isopropanol, Ethanol 70°

Phan tng PCR: moi, master mix 2X, nước DEPC

Hóa chat dùng trong điện di: agarose 1%, TAE 1X, 6XGelred DNA Loading buffer

tricolor, Ladder 1k bp

2.3.1.4 Trang thiết bị và dung cu thí nghiệm

Dụng cụ: Dia petri, kẹp gấp, giấy lọc, viết, giấy, eppendorf 1,5 ml, eppendorf 0,2

ml, đầu tuýp 10 — 200 — 1000ul, Micropippet, bình thủy tinh, lam kính, lame, găng tay,ống phancon 50 ml, ray 38 — 50 — 100 — 250 — 1000 pm

Thiết bị: Kính hién vi soi nỗi, kính hiền vi quang hoc Olympus BX40 (Nhật Bản),máy PCR, máy ly tâm, hệ thống chụp gel UVP, tủ ủ nhiệt (hoặc tủ định ôn), tủ lạnh -20°C, nồi hấp khử trùng, tủ cấy vi sinh, lò vi sóng, máy điện di, may vortex

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Đặc điểm hình thái

Bao tử nam nội cộng sinh có trong dat vùng rễ sầu riêng được ly trích bằng phươngpháp sảng ướt ly tâm nỗi theo TCVN 12560-1:2018 Dựa trên các đặc điểm về mặt hìnhthái theo tiêu chuẩn phân loại của INVAM và kết quả nghiên cứu của Nguyễn ThànhLộc (2023), chon 1 loài phô biến trong chi Glomus và 1 loài phổ biến thuộc chiAcaulospora đề quan sát các đặc điểm về mặt hình thái mỗi loài 30 bào tử:

- Mau sắc bào tử: quan sát qua kính hién vi khi nhuộm PVLG và một giọt PVLG

+ Melzer.

- _ Số vách tế bao: dùng lamen ép vỡ bào tử sau khi nhuộm PVLG và PVLG +

Melzer sau 24 tiếng và quan sát qua kính hiển vi

- _ Kích thước (um): đo qua kính hién vi trên lam kính có chứa 1 giọt PVLG

2.3.2.2 Định danh nắm VAM bằng sinh học phân tử

Bao tử sau khi thu thập được ly trích DNA theo phương pháp của Manian va ctv.

(2001) có sửa đồi

Ly trích DNA từ bào tử nam:

Bước 1: Nghién mẫu rồi cho 100ul dd Lysisbuffer vào tube và nghiền tiếp

- Thêm 200 ul dd Lysis buffer vào và nghiền tiếp

- Ủ mẫu ở 65°C trong | giờ

Bước 2: Bồ sung thêm 300 L dd PCI (chloroform isoamylalcolhol 24:1) và vortex

10s.

Bước 3: Ly tâm 14.000 vòng/phút (5 phút) rồi hút 200 ul dịch nổi sang tube mới.Bước 4: Thêm 200 uL CI Buffer và ly tâm 13.000 vòng /phút (5 phút) rồi hút dich

nôi sang tube mới Dịch nổi lúc này là nước chứa DNA, protein bị biến tinh sẽ nằm giữa

bề mặt phân cách giữa 2 lớp Vì vậy, khi hút dịch nổi cần lưu ý không hút phan nam giữa

Bước 5: Thêm 100 pL Isopropanol + 3 uL sodium acetat vào va đảo nhẹ, ủ ở - 20

độ C trong 30’ (càng lâu càng tốt) dé tủa DNA

- Ly tâm 12.000 vòng/phút (10 phút)

- Loại bỏ dịch nồi sau ly tâm

Bước 6: Cho 500 pL Ethanol 70° vào hỗn hợp Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 3

Bước 7: Phơi ống đến khi khô cồn.

Bước 8: Thêm 30 uL TE vào Nếu không tan, có thé cho dung dich buffer ủ ấm khi

cho vào Nếu vẫn không tan thì cho vào máy ủ 65°C và ủ trong 10 phút Lưu ý: không đảo

khi cho TE vảo.

Sau đó khuyéch đại DNA bằng phương pháp nested PCR với các cặp primer

LSU059/LSU061, LSU4f/LSU7r, NS1/NS4 va AML1/AML2

Thành phan va chu trình nhiệt sử dung cho từng cặp primer được trình bày ở Bang

Primer xuôi 10uM 0,25uM 0,5

Primer ngược 10HM 0,25uM 0,5

H20 8,5

DNA mau - - 3

Tổng thể tích 25

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Hậu kéo dài 72°C (10 phú 72°C (10 phut) 72°C(10phú) 72°C (10 phút)

Các mẫu DNA sau khi được khuyếch đại bằng phương pháp Nested PCR được

điện di bằng máy điện di trên gel agarose 1% với hiệu điện thế 97V trong 30 phút Sau

điện di sẽ được đưa vào hệ thống chụp gel UVP dé kiểm tra kích thước sản phẩm Các

sản phẩm đạt yêu cầu là những sản phẩm có băng rõ, sáng, đẹp, đúng kích thước

Sản phâm PCR sau khi tinh sạch bằng MicoElute DNA Clean/Extraction kit theo

quy trình của nhà sản xuất được gửi đi giải trình tự hai chiều tại công ty Nam Khoa Sau

khi có kết quả, các trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit 7.2 và phân tích bằng

công cụ online NCBI BLAST để so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank trên NCBI

2.3.3 Xử lý số liệu

Dữ liệu giải trình tự được phân tích bởi chương trình BioEdit 7.2, công cụ online

Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) va BLAST

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

2.4 Nội dung 2: Nhân sinh khối bao tử nắm nội cộng sinh trên 3 loại ký chủ khác nhau

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu

- Chi Glomus phô biến trong đất trồng sầu riêng tại Cai Lay Tiền Giang

- Hạtgiống:

+ Bắp: giống Syngenta NK7328

+ Cao lương: OPV 88 Super BMR là giống cao lương thức ăn chăn nuôi xanh

chín muộn do Trung tâm nghiên cứu cây trồng Việt Nam và Nhật Bản - Học viện Nôngnghiệp Việt Nam lai tạo kết hợp với nguồn vật liệu trong nước

+ Sau riêng: hạt được lấy từ qua sầu riêng trồng bằng hạt kích thước hạt sau

riêng đồng đều các hạt có đường kính dao động từ 3,0 — 3,5 em

- Chau nhựa (18x15x14 cm) được lau sạch bằng cồn, dĩa nhựa có đường kính 18

cm.

- Gia thé bao gồm: 1 xơ dừa: 1 cát: 1 phân bò (phối trộn theo thể tích)

+ Xo dừa: ngâm từ 5 — 7 ngày bang nước vôi dé xử ly lignin, sau đó rửa lại bằngnước Xơ dừa với tỷ lệ 60% mụn dừa và 40% xơ dừa.

+ Cát: Cát sử dụng là cát xây dựng va qua quá trình ray sảng ở mức ray l mm,

loại bỏ các tạp chất và rửa nhiều lần (10 lần) bằng nước sạch đến khi nước rửa không còn

màu vàng Mẫu cát sau khi rửa được phơi khô trong không khí

+ Phân bò: sử dụng phân bò đã ủ hoai

Xo dừa: cát: phân bò sau khi xử lý được phối trộn theo tỷ lệ 1:1:1 (theo thé tích)

và hap tiệt trùng ở 121°C trong 30 phút bang Autoclave Giá thé sau hap được dem đi phântích một số chỉ tiêu: Độ xốp (%), độ thoáng khí (%), khả năng giữ nước của giá thể (%),

pH, EC, CHC, N tổng sé, P tổng số, N dễ tiêu, P dễ tiêu, K dễ tiêu

Bảng 2.4 Đặc điểm giá thé sử dụng (1 xơ dira:1 cat:1 phân bò)

Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả Phương pháp phân tích

Phương pháp chưng cắt trong bộ

NH¿' mg/100g đất 4,31 cat micro Kjeldahl (TCVN

Kha nang giữ nước % 11,10 Phuong phap cua Gessert (1976)

Từ kết qua phân tích giá thé cho thay giá thé được sử dung trong thi nghiệm có độ

chua trung bình và không bị nhiễm mặn (EC<4 mS/cm) (Slavich & Petterson, 1993) hàm

lượng chất hữu cơ trong giá thể cao (15,7%), hàm lượng đạm (0,27%) và lân tổng sé

(0,12 %) ở mức cao, hàm lượng dam dé tiêu ở mức trung bình, lân dé tiêu ở mức nghèo

(Rayment & Lyons, 2011), độ xốp (độ rỗng >50%), độ thoáng khí và khả năng giữ nướcphù hợp với một tiêu chuẩn giá thể lý tưởng Nhiệt độ trung bình nhà màng trong quátrình thực hiện thí nghiệm là 32,42+2,7°C và độ ầm trung bình là 50,91+5,5 %

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm đơn yếu tô được bồ trí trong nhà mang theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiêngồm 4 NT, 3 LLL, mỗi ô thí nghiệm gồm 5 chậu (Halim và ctv, 2019) 4 NT tương ứng

với 3 loại cây ký chủ khác nhau dé nhân sinh khối VAM và NT đối chứng không sử dụng

ký chủ.

NTI: Sau riêng (Durio zibethinus L.)

NI2: Bắp (Zea mays L.)

NT3: Cao lương (Sorghum bicolor)

Xử lý hạt giống: Hạt giống thí nghiệm được khử trùng bằng cồn, NaOCl 1% trong

5 phút và rửa lại bằng nước cất, sau đó ủ hạt cho đến khi hạt nhú mầm

Chậu nhựa được khử trùng bằng cồn Dé tránh thất thoát bào tử, các chậu nhựa

được đặt trên | dĩa nhựa va có kê gạch phía dưới.

Gieo hạt đã nhú mầm vào chậu giá thể, gieo 2 — 3 hạt/chậu tiễn hành tia chỉ dé lại

1 cây sau khi gieo 2 tuần

Bào tử nam thu thập bằng phương pháp sang ướt ly tâm nồi theo TCVN 1:2018 được cho trực tiếp vào chậu chứa 1,1 kg giá thể, sau đó gieo hạt đã nhú mam rồi

12560-phủ lớp giá thể mỏng Số lượng bào tử sử dụng: 15 bào tử/chậu Riêng nghiệm thức đối

chứng vẫn chủng 15 bào tử/chậu và phủ một lớp giá thể mỏng lên trên

QCVN 01-56:2011.)

Lượng bón: 2,1 gN + 1,05 g PzOs + 1,05 g K2O/chau, tương đương với 4,6 g Ure

+ 6,56 g lân + 2,1 g KCI/chậu, chia làm 3 lần bón, bat đầu bón lúc 12 ngày sau gieo, định

kỳ 10 ngày/lần

Phân bón và nước tưới được sử dụng như nhau ở các chậu (kế cả đối chứng), trung

bình khoảng 200 mL/chậu.

Nước được tưới mỗi ngày và cắt nước trước khi thu hoạch 10 ngày

2.4.4 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Phương pháp thu thập rễ: Dùng khoan có đường kính 2 cm, khoan cách gốc 3 - 5

cm tại 3 vi trí trong chậu, tách bỏ đất, giữ lại phần rễ non, rửa sạch dưới vòi nước Sau

đó xử lý rễ dé quan sát sự xâm nhiễm theo tiêu chuẩn TCVN 12560-2:2018 Quan sátqua kính hiển vi khi nhuộm bang trypan blue

Chỉ tiêu tỉ lệ rễ có nắm cộng sinh được theo dõi ở giai đoạn 30, 45, 60, 90 ngày

sau chủng Các chỉ tiêu còn lại được theo dõi ở giai đoạn thu hoạch (90 ngày sau chủng):

- Tỉ lệ rễ có nắm cộng sinh (%): (Tổng số rễ có sự cộng sinh/Tổng số rễ quan

sát) x 100

- _ Kích thước rễ (cm): đo chiều dài rễ

- _ Trọng lượng ré tươi (g/cây): trọng rễ tươi được tính sau khi thu hoạch và làm sạchđất

- Trọng lượng rễ khô (g/cây): sấy khô rễ ở nhiệt độ 70°C đến khi có trọng lượngkhông đổi

- Tilé chất khô (%) = (Trọng lượng rễ khô/ Trọng lượng ré tươi) x 100

- Mật độ bào tử (bào tử/chậu): Trộn toàn bộ giá thể của 5 chậu/ô sau đó chọn ngẫunhiên 3 mẫu đơn, mỗi mẫu 100 g giá thể để phân lập, đếm số lượng bào tử đã phân lập

trong giá thê dưới kính soi Kỹ thuật phân lập bào tử theo TCVN 12560-1:2018

Mật độ bào tử (bào tử/chậu) = mật độ bào tử 3 lần đếm/100 g x trọng lượng giá

thé/ chậu

- Khả năng tăng sinh bào tử (lần) = (mật độ bào tử thu được — mật độ bào tử ban

dau)/mat độ bao tử ban đầu

- Đặc điểm bao tử: chọn ngẫu nhiên 10 bào tử/ô để quan sát các đặc điểm hình

dạng, màu sắc, đường kính bào tử, số vách tế bào theo phương pháp như đã mô tả ở mục

233.21

2.4.5 Xử lý số liệu

Số liệu được ghi nhận và tính toán, xử lý phân tích ANOVA và trắc nghiệm phânhạng kiêu LSD ở mức ý nghĩa ø = 0,05 hoặc a = 0,01 bằng phần mềm DSAASTAT ver1.101, vẽ đồ thị, bang phần mềm Excel, dùng hàm Descriptive Statistics dé thống kê mô ta

số liệu, phép thử t-test để so sánh hai giá trị trung bình

CHƯƠNG 3 KET QUA VA THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Dinh danh nam rễ nội cộng sinh hiện diện phổ biến trong dat trồngsầu riêng tại Cai Lậy, Tiền Giang bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3.1.1 Đặc điểm về hình thái của loài VAM phố biến trong dat trồng sầu riêng

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của 2 loài VAM hiện diện phổ biến trong đất trồng sầuriêng tại Cai Lậy, Tiền Giang

Đặc điểm Glomus sp Acaulospora sp

Số vách (lớp) 2 3

Kích thước (wm) 80,5 — 112,0 90,0 — 130,5

Màu sắc Màu vàng nhạt, màu Màu nâu cam nhạt, nâu

vàng đậm cam đậm, bắt màu nâu

đỏ với melzer

Qua khảo sát loài Glomus sp hiện điện phổ biến trong đất trồng sau riêng tại CaiLay, Tiền Giang có kích thước 80,5 — 112 um, bao tử có dang hình cầu, có thé mọcthành chùm (Hình 3.1B) hoặc rời rạc, cuống bào tử thắng nói liền từ thành bào tử, bề

mặt bào tử trơn nhăn, có màu vàng nhạt (0/10/60/0) đến vàng đậm (0/10/100/10) (Hình

3.1A), Bào tử có 2 lớp, bên trong có các hạt dau, lớp vách bên ngoài mỏng không bắtmàu với Melzer.

A) Bào tử hình cấu, màu vàng rơm, Đên trong bào tử có các hat dau, vách bên ngoài mỏng trong PVLG, B) Bào tử hình cấu, màu nâu cam và bắt màu nâu đỏ trong thuốc

nhuộm Melzer

Hình 3.2 Bao tử loài Acaulospora sp (xem ở vật kính 40X)

3.1.2 Định danh nắm rễ nội cộng sinh mẫu GLOI.

3.1.2.1 Kết quả và hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu GLOI

Dựa vào đặc điểm hình thái, tiến hành ly trích DNA của 100 bào tử đơn loài chỉ

Glomus (GLO1) và khuyếch đại lần 1 bằng phản ứng PCR với cặp mỗi NS1/NS4 Kết

quả điện di từ Hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR lần 1 (giếng P1) cho băng sáng, rõ với

kích thước 1100bp Kích thước này phù hợp với nghiên cứu của Lee (2003) khi sử dụng

cặp primer NS1/NS4 dé khuyếch đại vùng DNA của VAM Hình 3.3 cũng cho thấy khi

nested PCR sản phẩm lần 1 bằng đoạn mồi AML1/AML2 băng ở giếng P2 cũng sáng rõ

và có kích thước ~800bp, phù hợp với kích thước dự kiến theo nghiên cứu của Lee(2003) Như vậy, sản phẩm PCR phù hợp dé tiến hành giải trình tự Các sản phẩm PCRsau khi được tinh sạch được gửi giải trình tự theo phương pháp Sanger Trình tự củađoạn DNA mẫu GLOI được xử lý bằng phần mềm Bio Edit 7.2

M: maker 1k bp, P1: sản phẩm PCR lần 1 với primers NS1/NS4, P2: sản pham PCR lần

2 với primers AML1/AML2.

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR của Glomus sp được khuyếch đại dựa trên kỹ

thuật Nested PCR.

3.1.2.2 Kết quả BLAST trình tự mẫu GLOI.

Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng và bao phủ trình tự mẫu GLOI so với các nghiên cứu trênthế giới

Độ bao phủ

2022

Klinnawee OP060857.1 Glomus sp Thai Lan va Tenzin, 97,97 100

2022

Uncultured Haug va KX108502.1 EcuadorGlomeromycotina ctv, 2016 “hạng LỒN

Klinnawee OP060902.1 Glomus sp Thai Lan va Tenzin, 97,83 100

2022

Klinnawee

OP060858.1 Glomus sp Thai Lan va Tenzin, 97,83 100

2022

JX296918.1 Uncultured Eeuador 42 ONE Glomeromycotina ctv, 2016 Mới kế

Kết quả so sánh trình tự mục tiêu (mẫu GLOI) với 10 trình tự khác trên thế giớicho thay mức độ tương đồng (dao động trong khoảng 97,83 — 97,97%) giữa trình tự mụctiêu với các trình tự trên Genbank khá cao Độ bao phủ của trình tự mục tiêu so với trình

tự mẫu Glomus sp khá cao (100%).

Tuy nhiên, kết qua cũng cho thấy việc giải trình tự vùng 18S định danh chiGlomus chỉ xác định mẫu nắm này là chi Glomus mà không định danh được đến loài.Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Trần Thị Dạ Thảo (2011) khi định danh chi

Glomus.

3.1.2.3 So sánh sự khác biệt các nucleotide của mẫu GLOI so với các mẫu nghiên

cứu trên thế giới

Bang 3.3 Các vị tri nucleotide sai khác đặc trưng của mẫu GLOI so với các mẫu nghiên

cứu trên thê giới

Vi tri nucleotide sai khác

Mau

19 303 305 354 356 363 724

GLOI G A G C T A C

Glomus sp T G A A C C T Glomus sp T G A A C C T Glomus sp T G A A C C T Glomus sp T G A A C C T

Uncultured

; T G A A C C T Glomeromycotina

Glomus sp T G A A C C T Glomus sp T G A A C C T Glomus sp T G A A C C T Glomus sp T G A A C C T

Uncultured

; T G A A C C T Glomeromycotina