Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của năm loại dịch chiết hữu cơ đến khả năng nhân chồi cây lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata.) trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy và hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân chồi cây lan gam in vitro.. DANH SÁCH BANGTrang Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS cơ bản M

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC3K 3k 3 sịk 3k zk ie 3k z

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

ANH HUONG CUA NĂM LOẠI DỊCH CHIẾT HỮU CƠ DEN

KHẢ NĂNG NHÂN CHOI CÂY LAN GAM

(Anoectochilus formosanus Hayata.)

TRONG NUOI CAY IN VITRO

SINH VIÊN THUC HIEN : NGUYEN NHAT TANNGANH : NONG HOC

NIEN KHOA : 2019 — 2023

Thanh phó Hồ Chi Minh, tháng 10 năm 2023

ANH HUONG CUA NĂM LOẠI DỊCH CHIET HỮU CƠ DEN

KHẢ NĂNG NHÂN CHOI CÂY LAN GAM

(Anoectochilus formosanus Hayata.)TRONG NUÔI CAY IN VITRO

Tac gia

NGUYEN NHAT TAN

Khóa luận đệ trình dé đáp ứng yêu cầucấp bằng Kỹ sư ngành Nông học

LOI CAM ON

Con xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Cha Mẹ đã sinh ra con, nuôi dưỡng con,

hy sinh tất cả vì con Trong suốt thời gian học tập Cha Mẹ là những người luôn tin tưởng, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để con thực hiện ước mơ của mình.

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Dai học Nông Lâm Thanh phố Hồ

Chí Minh đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị phục vụ em trong suốt quá trình

học tập và rèn luyện.

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa, quý Thầy Cô Khoa Nông học,

Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hỗ Chí Minh đã tận tình hỗ trợ, truyền đạt kiến

thức, kinh nghiệm cho em trong suốt những năm học.

Trân trọng cảm ơn Thầy Bùi Minh Trí và Cô Phan Hải Văn đã tận tình chỉ bảo,

hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em trong quá trình thực hiện nghiên

cứu khoa học Thay và Cô luôn quan tâm, động viên trong những năm học và khoảng

thời gian em thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Xin cảm ơn khu thực nghiệm Bộ môn Sinh Lý — Sinh Hóa đã hé trợ thiết bị, vật

tư giúp em thuận lợi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Cao Kiệt, anh Lê Thanh Hậu — Phòng thi

nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Bộ môn Sinh Lý — Sinh Hóa đã hỗ trợ em trong nghiên cứu và thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Cuối cùng, xin cảm ơn bạn Đinh Thái Thành Trung (K45) đã giúp đỡ tôi trong

lúc thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 10, năm 2023

Nguyễn Nhật Tân

lì

TOM TAT

Đề tai “Anh hưởng của năm loại dich chiết hữu cơ đến kha năng nhân choi câylan gam (Anoectochilus formosanus Hayata.) trong nuôi cấy in vitro” đã được thực hiệntại phòng thí nghiệm nuôi cây mô và tế bào thực vật thuộc Bộ môn Sinh Lý - Sinh Hóa,Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 05 đến tháng 11năm 2023 Hai thí nghiệm có tính kế thừa được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiênhai yếu tố với 3 lần lặp lại Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy

và hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân chồi cây lan gam in vitro Thí nghiệm 2:

khảo ảnh hưởng của bốn dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến khả

năng nhân choi cây lan gam in vitro.

Kết quả thu được cho thay ở các nghiệm thức sử dụng mẫu cấy có kích thước 1,5

cm cho tỷ lệ sống, tái sinh chồi cũng như phát sinh chồi mới tốt nhất Cùng với đó, khi

sử dụng mẫu cấy với kích thước 1,5 em kết hợp với môi trường được bổ sung 100 mlnước dừa/L cho khả năng nhân chi tốt nhất (5,10 chồi/mẫu) sau 60 ngày nuôi cấy

Các dịch chiết có tác động tích cực đến quá trình nhân chéi của lan gam in vitro

Cụ thể, khi bổ sung giá đậu xanh ở mức 100 g/L thu được số chéi nhiều nhất (6,05chồi/mẫu), các dich chiết còn lại cho số chéi ít hơn, khi bổ sung củ đậu và khoai tâycùng mức 50 g/L có số chồi là 5,74 và 4,27 chồi/mẫu Bồ sung địch chiết chuối già vớimức 150 g/L thu được 3,85 chồi/mẫu sau 60 ngày nuôi cấy

Topic “Effects of five types of organic extracts on the ability to multiply buds of Anoectochilus formosanus Hayata in vitro culture” This research, comprising two experiments, was conducted at the Department of Plant Physiology and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, from May to

November 2023 The experiments were two-factorial and arranged in Completely Randomized Design (CRD) with 3 replications The first experiment aimed to determine the optimal explant size and the appropriate amount of coconut water supplementation for enhancing the in-vitro shoot multiplication ability of Anoectochilus formosanus Hayata The second experiment aimed to examine the effects of the extracts from banana fruits, potato tuber, green bean sprouts, and jicama tuber on the shoot multiplication ability of Anoectochilus formosanus Hayata.

The results indicated that an explant size of 1,5 cm height yielded the highest survival rate and shoot multiplication ability The most favorable development occurred

in the medium supplemented with 100 ml/L of coconut water, resulting in a shoot

multiplication rate of 5,1 shoots per explant after 60 days of culture.

Furthermore, the supplementation of green bean sprout extract exhibited the highest efficiency in promoting Anoectochilus formosanus Hayata shoot multiplication The best results were achieved, with 6,05 shoots per explant, when the culture medium was supplemented with 100g/L of green bean sprout extract Under these conditions, the plant shoots also exhibited the most vigor and overall growth performance as measured

through other parameters When adding jicama tuber and potatoes tuber at the same level

of 50 g/l, the number of shoots was 5,74 and 4,27 shoots, respectively Adding 150 grams of banana resulted in 3,85 shoot per explant after 60 days of culture.

IV

CG THẾ sccscssscscansacaasvcespa acess hú nh aerate ass aa ee ab ewan kaeatoabens |Đặt vấn đề 2 s21 22 1221211212112112111212121121111112112120121101111101211211210111111211 211cc 1

II Hết 0 Serer scenes sence rere et a at at rent 2

TH E8 ee eee a ee ee ee ee ee et eee tee 2

ASTOR A cs omav inert code enssomm di ote ce sinters sts ecticnirEasthinoneteliemoniiow 2

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIBU woo cccccssesssessesssessesseessessessessesssessessnsssessessseesesaseeses 4

1.1 Giới thiệu về cây lan gấm - 22 2 ©2222222E2E12EE223122122112212712211221211221 21.2 xe 4

|3 Nưỡi nầy mỗ về | |): ee 71.3 Khái quát một số dịch chiết được sử dụng trong nuôi cấy mô -2- 1]1.4 Một số nghiên cứu về nhân giống, bao tồn va giá trị y học của cây lan gam 151.5 Một số nghiên cứu ứng dụng chất hữu cơ trong nuôi cấy in vitro - 16Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHẬT cccceceeneiniioiuesieDELg00006/50001/600g8 18

2.1 N6i dung thi nghigm 01157 18

2.2 Thời gian và Dia điểm thí mghiGmr oo cecceccecccceccecseeseesessessessesseseessesseseessesseseeeees 18

35 Wie: Kiệt ng NT secesesnenseoniesesuoskGuoinbintigtdk02n000110010810/398l0g.04335 6g 0ogi33p4210395 arrestee 18

2.4 A8 c0 0) 0n 18 P3 oi s9) 00021 1 20

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-©22222+22222E22E22212212222221222222xe 24

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến quá

trình nhân chôi của cây lan gâm in VIẨFO 2 222222 2251221123121 E53 121251121 21 2 E2 24

3.1.1 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến thời điểm hình

than ch6i lan gam in Vitro oo “ 4£Œ+ŒEŒH AH 243.1.3 Anh hưởng của kích thước mẫu và ham lượng nước dừa đến chiều cao chéi củaGhủi cy Ình 0 Fh VEO caagon nho GitdnGữnhHIEG0 Ha S08 gtghGIAN13 U28 E:EG314000.81301810358380500048gp 303.1.4 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến khối lượng tươi của

CHOI Cây lati Gah AT VÔ secre cesses 550 g3166094033164S8500123S32ERSHGDSEHEAGSESEENHEGEM.SGGSSES818388846830388 32

3.2 Thi nghiệm 2: Ảnh hưởng của bốn loại dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậuxanh, củ đậu đến quá trình nhân chổi của cây lan gam in vitro - - 343.2.1 Ảnh hưởng của bốn loại dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến

thời điềm hình thành chôi của cây lan gam nuôi cây in VItrO -.34

3.2.2 Ảnh hưởng của bốn loại dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến

số chối va sô lá của cây lan gam nuÔi cây 1n VIẨTO 7 5< +c+<c+eceereereerxerreecee.2

3.2.3 Ảnh hưởng của bốn dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến

chiêu cao chôi cây lan gam nuôi cây iN VITO - eee s5 + 5+ 2+ S+*+++vEseeeeerrrrrrrrrerre 41

3.2.4 Ảnh hưởng của bốn dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến

khối lượng tươi của chỗồi cây lan gam nuôi cấy in VitfO - 2 2522222222222 42

3.2.5 Ảnh hưởng của bốn dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến cảm

quan vé sự khác biệt của môi trường trong nuôi cây lan gam In vItrO 43

Chương 4 KET LUẬN VA KIEN NGHỊ -5 2552255112222 x6 464.1 Kết luận - +2 S1 ESEEE212E2121211212112112111211111121111112111111212111211 1121211 rreg 46

a 46

eA ee DĨ cuaansassesrsorsatpuenttstirnritsiiozgutoizcbl0ia0i4gcniuiszeadgksesiri 47

Ij51989/ ©ẮỶẮỶÃỒÃỒÃẮÃÃIÃIIIỶIĨỶĨỶÃŨÚŨŨÚŨÚÚ 53

Phu luc 1: Hình anh trong thí nghiệm -00 0 eceeceeceeeeceeceesceeceesececeeseesteeseeeeeseeneenees 53

Phụ lục 2: Xử ly số liệu thống k6 oo eccccccceccessessessessessessessessessessesseseessessessessesseseeeaee 56

VI

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Viết tắt Viết đầy đủ

ANOVA Analysis of Variance

ctv Cộng tác viên

ĐC Đối chứng

LLL Lan lặp lại

LSD Least Significant Difference (test)

NSC Ngày sau cấy

MS Murashige và Skoog

NT Nghiệm thức

TN Thí nghiệm

DANH SÁCH BANG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng

trong ThÍ:TghiÊT NT sơn trogEEiTGLEEDDELDUENSBOIHISE BẠdL4E Une BON IRORHEE:-ABSEUIGHEEGNIDNdSES.SBN88 19

Bảng 22 Các nghiệm thức về kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa

¬ eee eee dene ee ea eden eee ee ede eeee ee ea eens ee eaeaeeeeseseeeneeeeseeneeeeeeeeteeeeeeneneeaeneees 21 Bảng 2.3 Cac nghiệm thức vê ham lượng dich chiét chuôi, khoai tây, gia đậu xanh, cu CHỂ go gunscbuggiit60150ERS0S50080A8840001S8BAGEISAGBIBSRESICXGIRNRGRUAGiBIGiligtišluJplIBNGGbBIEIGRINTRSRBEIBIBEIREIQRG018040006088 23 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến thời điểm hình thành chéi (NSC) cây lan gm in Vi/70 c2 111111111 215511111111 xxx ceg 24

Bang 3.2 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến số chéi (chéi/mau)

Gây lan BAM 11 VÍ HD cát sexaceeeneens eewen ee SIIS8 ne x seinen t SSISRSVS TUS6/33 oe eRe EEN 26

Bang 3.3 Ảnh hưởng của kích thước mẫu va hàm lượng nước dừa đến số lá (1a) cây lan

ID A1†N LID 0 HD se pautickaaisisuiolluisioinisuehssl3fqgiskisikSklgftiiulasisoinekgllotbidbacbikEusidiuuois Gi2ugo814/08 tồ§3sik2i ganincp Ss nici 29

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của kích thước mau và hàm lượng nước dừa đến chiều cao chéi

nec ot, ẽ“s“s“n vẽ

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến khối lượng tươi

(5) CUMChOL Cay lat gân IA VITO: «ccna ssumoerccumeaanmcn a A:080006.0i8 8IB03-4)NHISBGĐ3013i80tR0N8.S6502g818.0 0)

Bang 3.6 Anh hưởng cua dịch chiết chuối, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến thời điểm

hình thành chéi (NSC) cây lan gdm nuôi cấy i vifr0 - c2 2-2222 c S252 35

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của dịch chiết chuối, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến số chồi

(chéi) cây lan gam nuôi cấy in Viff0 - SE 2221111111111 2555511111111 xx2 36

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của địch chiết chuối, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến số lá (lá)

Cay lai Gai HUOLEAY Ti DÙHHỖ: cuaaiasptitiGEEiDRSE94 TRE enone SAIS2094225.60101939/030408024'608000.83 exes 39

Bang 3.9 Anh hưởng của dich chiết chuối, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến chiều cao

chôi (cm) cây lan gâm nuÔi cây 77 Vif7O S222 vs 41

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của dịch chiết chuối, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến khối

lượng (g) của choi cây lan gam nuôi cây 171 VifrO - 42

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của bốn dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu đến

cảm quan về sự khác biệt của môi trường trong nuôi cấy lan gam in vi/r0 43

Vill

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây lan gam A formosanus Q2 2222111111111 555511111 x%2 4Hình 2.1 Ba kích thước mẫu cay sử dụng trong thí nghiệm I - 22Hình 3.1 Chéi lan gam ở thời điểm 60 ngày sau cấy tương ứng với từng nghiệm thức

Gừa CURL AREA STILT x.esssseesseskibiiidlidengendidrgtdprainiekbslipiiviipdiadig4800101201n10214010104 mime cie S28: 30040066 28

Hình 3.2 Quy trình nhân chỗi lan gam bang mẫu có kích thước 1,5 cm kết họp bổ sung

TU Tiil 1iữ06FdÙB]orsrsneeostoistonteegitisl tunes SẺ 2018 i08EiiSibgalbit4:.NSIBIDBIDEIDSUIEIGRIIELBSEIHB 33

Hình 3.3a Số chi lan gam tại thời điểm 60 ngày sau cấy ở các nghiệm thức sử dụng

chuôi trong thí nghiệm 2 - c2 1020120110 101111111 13111111 1x 40

Hình 3.3b Số chồi lan gam tại thời điểm 60 ngày sau cấy ở các nghiệm thức sử dụng

khơai tay trong thí nghiệHLổ scm Bi sae VhiELEBGUEI tà Đh3-4Ú ees Deen? 40

Hình 3.3c Số chồi lan gam tại thời điểm 60 ngày sau cây ở các nghiệm thức sử dung giá

đầU:X8HHi HONE Hi DENI, oan asccinonac samen armen amnion Ime RRR RTI B4URNRRISG Ha 41

Hình 3.3d Số chồi lan gam tai thời điểm 60 ngày sau cấy ở các nghiệm thức sử dung củ

auzirone?Thi:np Hl©T25issrswovenogdodieuBtitoitofiionBiSIBGBISEIGSHRSGSRRGWRIGS'ght6cag38NNgtt0ltanbsgavaad 41

Hình 3.4 Sự thay đổi của môi trường có bổ sung dich chiết chuối, khoai tây, giá đậu

xanh, củ đậu sau 60 ngày nuÔi Cây c2 nent eee nh su xem 44

Hình 3.5 Một số mẫu cay phát triển bất thường khi cấy trên môi trường có bổ sung 2

f8: ĐA Ee ee 45

Hình 3.6 Quy trình nhân chồi lan gam bằng việc sử dung moi trường có bồ sung 100 g

10 0411741111 TT ayes 8000 6i2 s54: 3 angbệ kho Si 55/820 6i5eng ni hô gbyu/Su634iebA2/00 86 Sede 45

Hình PL 1 Mẫu lan gam sử dụng trong nghiÊn cứu - 53Hình PL 2a Mẫu lan gam ở các nghiệm thức của thí nghiệm . 53Hình PL 2b Mau lan gam ở các nghiệm thức của thí nghiệm I . 53Hình PL 3 Cân khối lượng tươi cụm chồÌ c c2 222112222 ses 54Hình PL 4a Mẫu lan gam tại các nghiệm thức str dung dịch chiết chuối ở thí nghiệm 2

ee SGIHIBG.3'NHIRLRR S08888853:GEGJ0BIARIIEHING HANGGHAš SD'SRE.' SHÌ80194 1831030 008 54

Hình PL 4b Mẫu lan gam tại các nghiệm thức sử dụng dịch chiết khoai tây ở thí nghiệm

"mm ÔỎ 54

Hình PL 4c Mẫu lan gam tại các nghiệm thức sử dung dich chiét giá đậu xanh ở thí

CHICO ees aren er eee ieeicar merci wee ee a 55

Hinh PL 4d Mau lan gam tại các nghiệm thức sử dung dich chiết củ đậu ở thí nghiệm

GIỚI THIỆU

Đặt vân đề

Lan gam (Anoectochilus formosanus Hayata.) là loài được liệu quý hiểm, chứamột số hoạt chất sinh học có khả năng chữa bệnh và tăng cường sức khỏe Nhiều nghiêncứu đã chứng minh lan gam có chứa các hợp chất chuyền hoá arachidonic acid liên quanđến chức năng tim mạch, kháng virus, kháng viêm, các hoạt tính bảo vệ gan và chống

tăng lipase máu (Du và ctv, 2001) Ngoài giá trị về mặt y học, lan gam còn đem lại giá

trị kinh tế cao (Phùng Văn Phê và ctv, 2010)

Chính vì những giá trị trên mà lan gam trong tự nhiên bị khai thác triệt dé, cùngvới nạn phá rừng làm nương rẫy khiến cho diện tích phân bồ của loài cây này bị thu hẹp,dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng cao Năm 2006, cây lan gam được đưa vào danh mục cácloài đang nguy cấp thuộc nhóm IA Nghị định 32/2006/CP của Chính phủ đã ban hànhqui định nghiêm cam khai thác lan gdm trong tự nhiên cho mục đích thương mại và langam đã được xếp vào nhóm thực vật rừng đang nguy cap (EN Al a,c,d) trong Sách ĐỏViệt Nam năm 2007 Nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã được thực

hiện nhằm mục đích nhân giống và bảo tồn loài cây dược liệu quý này như Nguyễn

Quang Thạch và Phí Thị Câm Miện (2012); Nguyễn Tuấn Anh (2013); Phan Xuân

Huyén và ctv (2016); Phan Xuân Huyén và Nguyễn Thị Phượng Hoàng (2017).

Hiện nay, việc sử dụng các hóa chất trong nhân giống cây trồng bằng phươngpháp nuôi cấy in vitro trên nhiều đối tượng cho thấy là việc sử dụng các hóa chất phùhợp sẽ đáp ứng được những yêu cầu về mặt kỹ thuật và đem lại lợi ích kinh tế cho nghiêncứu và sản xuất Tuy nhiên, khi sử dụng hóa chất trên đối tượng cây dược liệu thì ngoài

việc thỏa mãn hai yêu tô trên người ta cũng cân xét đên tính an toàn cho người sử dụng.

Chính vì vậy, việc sử dụng một số thành phần hữu cơ ví dụ như chuối già

(Cavendish subgroup), củ khoai tây (Solanum tuberosum), giá đậu xanh (Vigna radiata),

củ đậu (Pachyrhizus erosus), nước dita vừa thay thế các hóa chất vô cơ vừa nâng caotính an toan, vừa đáp ứng yêu cầu về hiệu quả kỹ thuật và hiệu quả kinh tế Các dịchchiết này có tác dụng thúc day quá trình phát triển của chồi in vitro ở một số cây trồngtrong đó có cây lan gam, bởi chúng là nguồn carbon tự nhiên có chứa nhiều loại vitamin,

1

chất xơ, hormone tự nhiên, protein, đường và khoáng chất Đây là nguồn vật liệu tiềmnăng cho nuôi cay in vitro bởi tinh thân thiện và mang lại hiệu quả không thua kém việc

sử dụng các hóa chat Đặc biệt là rat dé tìm thấy chúng trong các sản phẩm nông nghiệp,với giá thành thấp cho nên thỏa mãn được hai tiêu chí về hiệu quả kỹ thuật và hiệu quả

kinh tế Một số tác giả đã thành công khi sử dụng chất hữu cơ bổ sung cho môi tường

nuôi cấy trong nhân giống lan hài Da Lạt (Paphiopedilum dalatense) (Trần Thái Vinh

và ctv, 2021); lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) (Dang Thị Thanh Tâm va ctv, 2021); lan hài (Paphiopedilum bellatulum) (Kong Inthachak Maitouy va ctv, 2022).

Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu sử dung chất hữu co trong nuôi cấy lan gam invitro, cho thay sự quan tâm đến van đề nhân giống và sử dụng loài cây này còn kém,đặc biệt có khá ít nghiên cứu sử dụng các thành phan hữu cơ trong nuôi cấy in vitro đối

với loài Anoectochilus formosanus Hayata.

Xuất phát từ những van đề trên, đề tài “Anh hưởng của năm loại dịch chiết hữu

cơ đến quá trình nhân chỗi cây lan gam (Anoectochilus formosanus Hayata.) trong

nuôi cây in vitro” đã được thực hiện.

Nguồn vật liệu sử dụng phải phô biến, dé tim, dé sử dụng và chi phí đầu tư thấp

Đảm bảo khi bé sung các chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy cây không bị độtbiến, di dang và không bị thủy tinh thé

Thực hiện nuôi cây trên một loài lan gam (Anoectochilus formosanus Hayata.) in vitro

ở giai đoạn nhân chéi tại phòng thí nghiệm nuôi cay mô va tế bào thực vật thuộc Khu

thực nghiệm Bộ môn Sinh lý — Sinh hóa, Khoa Nông học, Trường Dai học Nông Lam

Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 05/2023 đến tháng 11/2023

Chương 1

TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Giới thiệu về cây lan gam

rộng thường xanh, trên vùng đất có nhiều mùn lá rụng, trên đá có phủ rêu (Amritpal và

Sanjiv, 2009) Việt Nam có 16 loài thuộc chi Anoectochilus (Nguyễn Tiến Bân, 2005;Nguyễn Trọng Quyền và ctv, 2020), Anoectochilus formosanus Hayata là một loài mới,

được Nguyễn Trọng Quyền phát hiện và bé sung vào hệ thực vật Việt Nam năm 2022

1.1.3 Phân bố

Loài Anoectochilus formosanus Hayata phân bố chủ yêu ở Thai Lan, Myanma,Malaysia, Trung Quốc, Indonesia, Lào Ở nước ta, chúng phân bố ở các tỉnh Cao Bằng,Lạng Sơn, Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Đắk Lắk, Lâm Đồng và ở chùa Hương (Hà

Nội) (Đỗ Huy Bích và ctv, 2018)

1.1.4 Đặc điểm thực vật học

Năm 2018 Đỗ Huy Bich đã mô tả cây lan gam như sau:

Rễ: rễ đơn, có nhiều lông hút, mọc ra từ các đốt thân, các rễ ở phần gốc ăn sâuvào đất; các rễ mọc ở những đốt thân có một phần cắm xuống đất, phần còn lại nhô rakhỏi mặt đất

Thân: cây thân thảo ký sinh, thân mềm mọng nước, hình dạng giống con tằm,phan trên mọc đứng hoi có lông, cao từ 15 — 25 cm, phần dưới mọc bò bén rễ ở các mau,thân cây có màu đỏ tía hay nâu giúp có thể quang hợp ngay cả trong điều kiện ánh sáng

yêu.

Lá: lá mọc so le, hình bầu dục hoặc hình trứng, dài từ 4 — 7 cm, rộng từ 2,5 — 3

cm, sốc tròn đầu tù hơi nhọn, mặt trên màu xanh lục đôi khi màu tía, mặt đưới màu hồngtím, có 3 — 5 gân chính hình cung, cuống lá đài có bẹ ở gốc

Hoa: cụm hoa mọc ở ngọn thân, phát hoa dài từ 3 — 8 cm có lông dày đặc, lá bắcmàu nâu vang, hoa màu trang, lá đài lưng dính liền với cánh hoa thành mii có 3 răng, lá

đài bên rời nhau, cánh môi màu vàng hình chữ T, trụ dài bang bao phan, bau có lông.

Quả: qua nang, mùa quả vào thang 3 — 4 Những cành trưởng thành (trên 1 năm tuôi) thường có quả hăng năm và tiép tục tôn tại đên gan 1 năm sau mới tan lu.

Lan gam là loài thực vật ưa 4m, ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành các đámnhỏ lẫn trong lớp thảm mục hoặc hốc đá dưới tán rừng kín thường xanh âm Độ cao từ

700 — 1500 m so với mực nước biển Cây sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, chịu

được thời tiết sương mù dài ngày Chúng thường mọc các chồi mới từ phan thân gia

mọc sát mặt đất Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt và được trồng bằng các đoạn thân.

1.1.5 Thanh phần hóa học của cây lan gam

Thành phan hoạt chat sinh học quan trọng nhất của hoa lan gam bao gồm:

gasrodn (4-(-D-glucopyranosyloxy) benzyl alcohol), gastrodigenisn hydroxybenzyl alcohol) và kinsenoside (3- (R)-3—B—D glucopyranosyloxy butanolide)

(P-(Yeo-Joong Yoon va ctv, 2007), những thành phan kể trên cũng có thé thu được khichiết xuất toàn bộ thân cây (Tseng và ctv, 2006)

1.1.6 Giá trị và ứng dụng

Trong dược điển Trung Hoa, lan gam là cây thuốc quý và được sử dụng dé điềutrị ung thư, tăng huyết áp, đái tháo đường và viêm thận (Liang và ctv, 1990) Tác dụng

dược lý đa dạng của lan gam đã được chứng minh bao gồm chống viêm và hoạt tính bảo

vệ tế bao (Lin va ctv, 1993), hoạt tính chống oxy hóa (Lin và ctv, 2000), kha năng chống

khối u và kích thích miễn dịch (Tseng và ctv, 2006)

Lan gam có vi nhạt, hơi chát, tinh mat; có tac dụng tư âm nhuận phê, ky ty, an

than, mát phối, mat máu, sinh tân dịch, tiêu viêm, lọc máu Lan gấắm còn được dùng déchữa lao phổi, ho ra máu, suy kinh suy nhược, chán ăn (Nguyễn Thị Thu Hương, 2018)

Năm 2020 Hoang Xuân Trung cũng đã chứng minh lan gam có tính kháng khuẩn,

dùng chữa các bệnh viêm phế quản, viêm gan mạn tính; các triệu chứng như ho khạc ra

máu, thần kinh suy nhược, mất ngủ, kém ăn; tri lao phối, tiêu hóa kém, chán ăn, phổikết hạch Ngoài ra còn chữa tăng huyết áp, suy thận, di tinh, đau lưng, phong thấp, tiêuđờm, giải độc, giải nhiệt và cho biết bộ phận sử dụng làm thuốc uống là toàn bộ cây tươihay cây khô Liều lượng trung bình cho khuyến cáo 20 g cây tươi hoặc 5 g cây khô/ngày

là Sử dụng đắp ngoài, toàn bộ cây tươi rửa sạch, giã nát đắp vào nơi vết thương sưng

đau.

Ngoài ra, lan gam có thé làm rau ăn và chữa được nhiều bệnh (tim mạch, cácbệnh sưng viêm, có hoạt chất chống oxy hóa bảo vệ gan, trị đau nhức khớp, lao phối vàtăng cường sức khỏe) (Lin va ctv, 1993) Các thành phần có hoạt sinh học quan trọngnhất chiết xuất từ lan gam đã được công bó gồm gastrodin, gastrodigenin và kinsenoside

(Tseng va ctv, 2006).

1.2 Nuôi cấy mô và tế bào

1.2.1 Khái niệm

Nuôi cay mô và tế bảo thực vật là phương pháp nuôi cay in vitro đối với mô hoặc

tế bào đã tách rời trong môi trường thích hợp dé tế bao trở lại trang thái chưa phân hóa

có khả năng phân chia tế bào và biệt hoá thành mô, cơ quan và phát triển thành cây conmới Tất cả mọi tế bào của một cơ thê thực vật đều có tính toàn năng, nghĩa là chứa bộgene giống nhau, do đó tat cả các tế bào của một cơ thể đều có khả năng tổng hợp nhữngloại protein — enzyme giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡng trong môi trường thíchhợp đều có thé phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài và ra hoa, kết quả

bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.2.2 Cơ sở của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.2.2.1 Một số khái niệm về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Năm 1902 Haberlandt là người đầu tiên cho rằng bat kỳ tế bào của một cơ thésinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng đề phát triển thành một cá thê hoàn chỉnh, đó

là tính toàn năng của tế bào Đặc tính này được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô và

tế bào thực vật, mô và cơ quan thực vật hay nuôi cấy tế bào trần trên các môi trườngnhân tao in vitro Trong điều kiện thích hợp (môi trường có bé sung chất điều hòa sinhtrưởng thích hợp), những tế bao này sẽ được kích thích dé phân hóa, phát sinh hình thái,

tái sinh phôi hoặc phát sinh cơ quan và sau cùng là thành cơ quan hoàn chỉnh.

Sự phân hóa tế bao (Differentiation) là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành

các tê bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau (George, 1993).

Sự phản phân hóa tế bào (Dedifferentiation) các tế bào khi đã được phân hóathành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau, nhưng trong điều kiện nhất địnhchúng vẫn có thé quay trở về trang thái phôi sinh dé phân chia tế bào Trong nuôi cấy

mô, quá trình này dẫn đến sự hình thành mô sẹo (George, 1993)

Sự tái phân hóa tế bào (Redifferentiation) là các tế bào ở trạng thái phôi sinh (baogồm các tế bào mô sẹo) sau khi đã trải qua quá trình phản phân hóa, nhưng vẫn có khả

năng phân chia và phân hóa hình thành các loại tế bào chuyên biệt (George, 1993)

Phát sinh cơ quan (Organogenesis) là thuật ngữ dùng dé mô tả quá trình phát triên

các chồi, rễ bat định, hoa từ các khối tế bào mô sẹo Quá trình này xảy ra sau thời điểm

mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo

(George, 1993).

1.2.2.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Văn Ay (2019) phương pháp nhân giống in vitro có ưu và nhược

điêm như sau:

1.2.2.2.1 Ưu điểm

Giúp nhân nhanh các giống cây trồng với quy mô công nghiệp, đạt được hệ số

nhân cao mà vẫn giữ được đặt tính giống với cây bố mẹ.

Chọn lọc được các đối tượng thực vật có tính trạng tốt nhằm phục sản xuất dược

nuôi cay, có thé tiễn hành cung cấp cây giống quanh năm nhờ vào không bị ảnh hưởng

bởi điều kiện thời tiết

Tạo điều kiện nuôi cấy phôi của một số loài cây khó phát triển và sinh trưởng

trong điều kiện tự nhiên góp phần bảo tồn các giống cây quý hiếm có nguy cơ tiệt chủng

Cây nuôi cấy mô chưa hoàn thiện về mặt cấu trúc nên trong giai đoạn thuần đưỡng(in vitro) kha năng sống sót còn giới hạn.

1.2.3 Các bước trong nhân giống vô tính in vitro

1.2.3.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cần thận các cây mẹ (câycho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giaiđoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp vớichế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệmẫu nhiễm, tăng kha năng sống và sinh trưởng của mau cấy in vitro (Mai Xuân Lương,

2005).

1.2.3.2 Tạo vật liệu khởi đầu

Giai đoạn khử trùng mẫu dé đưa vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảmbảo các yêu cau: ty lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Về mặtnguyên tac thì các tế bào sống đã phan hóa đều có khả năng phản phân hóa dé trở lại

trạng thái trẻ hóa và tái lập khả năng phân chia (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy

Tiên, 2006) Các mô thực vật thường được sử dụng dé nuôi cấy là:

— Đỉnh sinh trưởng thân, rễ

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy và xử lý mẫu Ngoài

ra còn tùy thuộc vào mục đích đối với từng loại cây khác nhau dé nuôi cấy cho phù hợp.Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là

đỉnh chéi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh

lá Kohter (1975) đã kết luận rằng sử dụng chổi ngọn dé nhân nhanh in vitro đối vớimăng tây là thích hợp Trong khi đó, Morel và ctv (1952) cho rằng sử dụng mầm đối với

khoai tây hay chdi nách, chéi đỉnh ở đứa là tối ưu cho kỹ thuật nhân nhanh in vitro Mẫucần phải khử trùng trước khi đưa vào nuôi cấy dé loại bỏ các vi sinh vật bám trên và bêntrong bề mặt mẫu cay Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lai ty lệ sống cao, đồngthời chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ giúp đạt được tốc độ tăng trưởng nhanh.

Các chất khử trùng thường sử dụng là: HgCh 0,1% xử lý trong 5 - 10 phút, NaOCl hoặcCa(OCD; 5 - 7% xử lý trong 15 - 20 phút, H2O2, dung dich Br (Duong Công Kiên, 2003).

1.2.3.3 Giai đoạn nhân chồi

Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát sinh hình thái và tăng nhanh sốlượng chỗi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con

đường: hoạt hóa chéi nach, tạo chéi bat định và tạo phôi vô tính (Somatic embryo) Vật

liệu khởi dau in vitro được chuyên sang môi trường nhân nhanh thường có bé sung chấtđiều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin dé tái sinh nhiều chỗồi từ một phần mô bandau Van đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp dé cóhiệu quả cao nhất Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 27°C và 16 giờ chiếu sáng/ngày,

cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux, ánh sáng tím là thành phan quan trọng dé kích thích

phân hóa chồi (Weiss và Jaffe, 1969)

Ở giai đoạn này mẫu cấy chịu tác động bởi nhiều yếu tố đến khả năng nhân chồinhư môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng của từng loại dịch chiết hữu cơ,

lượng đường, lượng agar bé sung Bên cạnh đó, một yếu tố quan trọng khác cũng cầnđược quan tâm chính là mẫu cấy ban đầu Kích thước của mẫu ban đầu cũng ảnh hưởngđến khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chỗi của cây lan gam trong nuôi cấy

in vitro Điều này đã được chứng minh qua các nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch

và Phí Thị Cẩm Miện (2012) khi thiết lập quy trình nhân giống in vitro cây lan gam(Anoectochilus setaceus Blume.) với việc sử dụng vật liệu là chổi và mắt đốt ngang thân,kết quả số chéi thu được là 6,55 chồi/mẫu Năm 2017 Phan Xuân Huyên và Nguyễn ThịPhượng Hoàng đã kết luận là mẫu mang | đốt thân ở vị trí thứ 2 đến thứ 6 trên chồi lànguồn vật liệu tốt nhất cho nhân giống in vitro loài Anoectochilus formosanus Hayata

1.2.4 Một số kiểu tái sinh trong nuôi cấy in vitro

Nhờ vào tính toàn năng, khả năng phân hóa và tái phân hóa của tế bảo mà mỗi

bộ phận (rễ than, lá, hoa, cuống hoa, chồi nách), ké cả tế bào đơn bội (hat phấn, noãn

chưa thụ phan) của cây đều có thé tái sinh thành cây mới hoàn chỉnh Sau đây là một sốkiểu tái sinh trong nuôi cấy in vitro mà hiện nay đã được áp dụng rộng rãi và mang lạinhiều thành công cho công tác giống cây trồng (Vũ Văn Vụ, 2009).

— Nuôi cấy tái sinh cơ quan

— Nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng

— Nuôi cấy tái sinh thông qua con đường tạo mô sẹo

— Nuôi cấy lớp mỏng tế bào

— Nuôi cấy tạo phôi vô tính

— Nuôi cấy tế bào đơn bội

— Nuôi cấy tế bao tran (Protoplast)

1.3 Khái quát một số dịch chiết được sử dụng trong nuôi cấy mô

Khi bé sung các chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy thì tỷ lệ tai sinh chôi, hệ

số nhân chồi của một số loài là cao hơn hắn so với môi trường không bổ sung các hợp

chất hữu cơ Mặt khác, việc bồ sung các chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro

còn thúc đây quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, đặc biệt ở các cây sinh trưởng

chậm và khó nhân giống do các chất hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả thông qua việccung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần cótác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Phạm Thụy Ngọc Trân, 2016)

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, ngoài chất điều hòa sinh trưởng, thành

phan vô cơ, nguồn nitrogen, nguồn carbon, hàm lượng agar, pH môi trường, sự pháttriển của tế bào thực vật còn có thé được tăng cường nhờ các chất hữu cơ bồ sung vàdịch chiết (Trần Văn Minh, 2006)

1.3.1 Chuối già được sử dụng trong nuôi cấy in vitro

Dịch chiết chuối gia đã được thêm vào môi trường dé thúc đây tăng trưởng trongnuôi cấy hoa lan Do trong quả chuối có hàm lượng fructose, glucose và nitrate cao, khi

bố sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng hàm lượng dam và đường (Aktar và ctv,2008) Chuối gia còn có tác dụng 6n định pH của môi trường nuôi cấy, thúc đây sự pháttriển của cây con sau khi nảy mầm (Pierik và ctv, 1988)

lãi

Khi hàm lượng chuối già được bồ sung tăng từ 50 đến 100 g/L thì sự hình thành

và phát triển chồi tăng lên Đặc biệt, sự hình thành và phát triển chồi cây tốt nhất trênmôi trường nuôi cấy bé sung chuối già với mức 100 g/L thu được 4,6 chồi/mẫu, trungbình 4,3 lá, chồi cao 18 mm và 90% chồi sống Tuy nhiên, khi hàm lượng dịch chiết

chuối tăng lên đến 150 g/L các chỉ tiêu theo dõi có xu hướng giảm (Trần Thái Vĩnh vàctv, 2021).

1.3.2 Khoai tây được sử dụng trong nuôi cấy in vitro

Trong khoai tây có chứa protein, vitamin, khoáng có khả năng thúc đây quá trìnhnay mam của một số loài lan như: Paphiopedilum bellatulum, Paphiopedilum delenatii

và Paphiopedilum primulinum (Lee và ctv, 1999).

Năm 2005 Tran Văn Minh đã công bố thành phan có trong khoai tay bao gồm:

75% nước, 21% glucid, 2% protein, 1% cellulose Khoáng chất trên 100 g địch chiết có

10 mg Canxi, 50 mg Photpho, 1,2 mg sắt, 15 mg acid acsobic Năng lượng bổ sung 92

Keal/100 g.

Mohamed va ctv (2010) đã sử dung khoai tây như một chất làm đông thay choagar, khi b6 sung vào môi trường nuôi cay 50 hoặc 60 g/L khoai tây + 1 g/L agar đã làmtăng số lượng chồi, số chéi trên mẫu đạt cao nhất là 6,8 chồi trên đối tượng khoai tây.Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng khoai tây lên từ 150 đến 200 g/L thì sự hình thành vàsinh trưởng chéi giảm xuống Kết quả này chứng minh, khi bổ sung hàm lượng khoaitây quá cao làm cho môi trường nuôi cấy bị đông cứng dẫn tới giảm sinh trưởng cũngnhư ty lệ sống của chéi (Trần Thái Vinh va ctv, 2021)

Norhayati va ctv (2011) bổ sung dich chiết khoai tây ở mức 100 g/L đã gia tăng

hệ số nhân lên 3 lần trên đối tượng hoa Mao Ga (Celosia sp) Phùng Văn Phê va ctv(2010) bồ sung dịch chiết khoai tây mức 100 g/L trong nuôi cấy lan Kim Tuyến, kết quảthu được hệ số nhân tăng lên gap 5,5 lần so với đối chứng sau 8 tuần nuôi cấy

1.3.3 Đậu xanh được sử dụng trong nuôi cay in vitro

Theo Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam, trong 100 g đậu xanh có chứa 23,4 gdam, 1,2 g protein, 53,1 g tinh bột, 4,8 mg sat, 377 mg phosphorus, 0,7 mg vitamin B1,

0,2 mg vitamin B2, 4 mg vitamin C, 2,4 g vitamin PP, 30 mg B-caroten, 4,7 g chất xơ,

1,132 mg potassium, 6 mg sodium.

Nam 1998 Tran Lưu Vân va ctv đã xác định trong vo hạt đậu xanh có chứa nhiều

vitamin và isovitamin Sau đó, năm 1999 Trịnh Văn Bảo và ctv đã chứng minh về thành

phần của đậu xanh rõ hơn như sau: vỏ và nhân hạt đậu xanh chứa 14 nguyên tố, trong

đó Kali chiếm tỷ lệ lớn nhất (5% trong vỏ hạt và 10% trong nhân hạt) Các nhóm chấtflavonoid, ancaloid, glycosid, coumarin, saponin, antraglycosid, tanin, acid hữu cơ, chat

béo, tinh bột và protein cũng được xác định.

Đậu xanh là một trong các nguồn protein từ thực vật tốt cho con người với 20 24% protein, 60% globulin và 25% albumin Lượng glucid trong đậu xanh chiếm khoảng

-50 — 60%, do có ham lượng tinh bột cao nên nhiều quốc gia đã sử dung đậu xanh dé làmmién (Việt Nam, Hàn Quốc) Ngoài ra trong hạt đậu xanh còn chứa các acid amin thiếtyếu (phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, lysine, arginine) Cac oligosaccharide vàpolyphenol đã được một số nghiên cứu chứng minh có vai trò trong quá trình chống oxyhóa, kháng khuẩn, kháng viêm và kháng ung thư, tham gia vào điều hòa sự chuyền hóa

lipid trên thực nghiệm Mặc dù có nhiều protein và glucid nhưng năng lượng cung cấp

bởi đậu xanh lại thấp hơn nhiều so với các loại ngũ cốc khác nên rất thuận lợi cho bệnhnhân béo phì hoặc đái tháo đường (Báo sức khỏe và đời sống, 2021)

Phạm Thụy Ngọc Trân (2016) kết luận rằng, khi bé sung bột đậu xanh mức 6 g/L

vào môi trường nuôi cấy cây Bạc Hà A là thích hợp nhất cho quá trình nhân chdi từ đốtthân Điều này cho thấy việc sử dụng môi trường có nguồn carbohydrate tự nhiên là khả

thi cho quá trình nhân giống in vitro

1.3.4 Củ đậu được sử dung trong nuôi cấy in vitro

Thành phần dinh dưỡng trong củ đậu được báo cáo gồm: 26,2% protem, 27,3%lipid, 20,0% carbohydrate, 7,0% chất xơ và 3,6% các chất khác (Duke, 1981) Nghiêncứu đầu tiên ứng dụng dịch chiết hữu cơ từ củ đậu (Pachyrhizus erosus) trong môitrường nuôi cấy mô và tế bào thực vật là của Đặng Thị Thanh Tâm và ctv (2021) Kếtquả công bồ rang, dịch chiết hữu co từ củ đậu làm tăng khối lượng cụm chồi lớn nhất sovới các dịch chiết khác trong cùng một thí nghiệm Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra

13

trong dịch chiết hữu cơ từ củ đậu chứa nhiều protein, chất béo, carbohydrate, chất xơ,các chất chống oxy hóa và chất làm tăng cường hệ thông mạch máu ở người, điều hòa

đường huyết ở chuột (Kim và ctv, 2009; Park và ctv, 2015)

Đặng Thị Thanh Tâm và ctv (2021) còn cho rằng dịch chiết hữu cơ từ khoai tây,đậu xanh nảy mầm, chuối, củ đậu cho tác động tích cực đến sự phát triển chiều cao củachéi lan Hoang Thao Kén (Dendrobium lituiflorum) Sau 8 tuần nuôi cấy, môi trườngkhông bồ sung dịch hữu cơ (đối chứng) cho cây có chiều cao trung bình 4,35 + 0,23 cm

Ở các công thức thí nghiệm môi trường có bồ sung địch nghiền khoai tây, chuối, đậuxanh nảy mam và củ đậu, chỉ tiêu chiều cao chéi lại tăng lên lần lượt là 7,61 + 0,36 cm;

6,64 + 0,40 cm; 6,05 + 0,30 cm; 6,75 + 0,29 cm.

Tran Thái Vinh va ctv (2021) công bố rang, trong môi trường nuôi cấy bổ sungkết hợp dịch chiết chuối và khoai tây thì khả năng hình thành và phát triển chồi được

cảm ứng mạnh, có sự gia tăng rõ rệt ở các chỉ tiêu theo dõi.

1.3.5 Nước dừa được sử dụng trong nuôi cay in vitro

Nước dừa được sử dụng nhiều trong nuôi cấy in vitro và đã đem lại hiệu quả nhângiống trên nhiều loài cây Bên cạnh những giá trị đinh dưỡng, việc sử dụng nước dừamang lại tính an toàn cho mẫu cấy và con người, giá thành thấp, dé tìm va dé sử dụng.Môi trường bồ sung nước dừa đã được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân giống hầu hếtcác loài lan Năm 2004 Phan Xuân Huyén và ctv đã sử dụng môi trường bồ sung 100 mlnước đừa/L trong nghiên cứu nhân giống địa lan

Năm 2015, trong nghiên cứu của Phạm Thị Lệ Huyền cho biết công bố đầu tiên

về việc sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là của Van Overbeek và

ctv trong những năm 1941, 1942 Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi

trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa chứa

94% là nước và một số thành phần như acid amin, acid hữu cơ, acid nucleic, vitamin,

đường đơn alcohol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucose của cytokinin, chấtkhoáng và các chất khác thúc đây sự tăng trưởng, sinh trưởng của tế bào nuôi cấy (Yong

và ctv, 2009) Trong | lít nước dừa có chứa 40 g carbohydrate, 2 — 3 g acid amin, 4 g

khoáng chất (48 meq potassilum, 2 meq sodium, 45 chlorur, 7 meq calcium, 6 meq

magnesium và các yêu tô vi lượng như sắt, mangansene, lithtum), vitamin va không có

lipide hoặc có rất ít (Phạm Thụy Ngọc Trân, 2016)

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chấtkích thích sinh trưởng (George, 1993), đã được sử dụng dé kích thích phân hóa và nhânnhanh chéi ở nhiều loại cây, thường được lay từ qua của các giống và cây chọn lọc dé

sử dụng tươi hoặc sau bao quản (Trần Văn Minh, 2002) Nước đừa được ứng dụng rộngrãi trong nuôi cấy in vitro nhằm mục đích tăng hệ số nhân chỗồi cũng như thúc đây quá

trình tái sinh ch6i diễn ra mạnh mẽ (Nguyễn Thị Cúc va ctv, 2013) Nước dừa thường

được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (Lê Văn Hoàng, 2008) Nghiên cứu của Đỗ Thị

Hương (2015) cho rằng, trong nước dừa zeatin, có cau trúc gần giống kinetin nhưng hoạt

lực cao hơn 10 lần Zeatin trong nước dừa thuộc nhóm cytokinin, làm tăng hoạt động

phân chia tế bào trong điều kiện có thêm auxin đi kèm, giúp gia tăng kích thước tế bào

và tổng hợp protein

Ngoài những thành phần dinh dưỡng trên, trong nước dừa còn chứa một sốphytohormones như cytokinin, kinetin đều có khả năng kích thích quá trình nhân chồitrong nuôi cấy in vitro (Jean và ctv, 2009)

1.4 Một số nghiên cứu về nhân giống, bảo tồn và giá trị y học của cây lan gam

1.4.1 Nghiên cứu ngoài nước

Vi là loài thực vật quý hiếm, có giá trị dược liệu cao nên vấn đề nuôi cấy, bảo tồn

và thu hoạch sinh khối của loài cây này rất được quan tâm Chow và ctv (1982) đã thựchiện nghiên cứu nhân giống vô tính loài cây này Năm 2007, Yeo và ctv đã công bốnghiên cứu nuôi cấy sinh khối lan kim tuyến (Anoectochilus fomosanus Hayata.) bằng

hệ thống phan ứng sinh học Sau đó một năm, Du va ctv (2008) đã tiến hành vi nhângiống và nghiên cứu lý, hóa học được tính của loài cây này Tiếp theo đó, nghiên cứubảo tồn in vitro và sử dụng loài Anoectochilus fomosanus Hayata trong y học của Shiau

Ngoài ra, các nghiên cứu về sinh trưởng và phân bồ của loài cây này cũng đãđược các nhà khoa học tiến hành như: Chang va ctv (2007), Cheng va ctv (2009) Năm

2020, Kumar va ctv đã thực hiện nghiên cứu nhằm đánh giá sự phân bố của loàiAnoectochilus fomosanus Hayata ở Hồng Kông

1.4.2 Nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu trong nước cũng tiên hành xoay quanh các vân đê bảo tôn, nhân

giống và sử dụng loài dược liệu quý này

Nguyễn Thị Hồng Gam va ctv (2010) nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi trên

đối tượng cùng chi (A roxburghii) Kết quả chỉ ra, khi sử dụng môi trường Knud + 100

ml nước dừa/L + 100 g khoai tây/L + 0,5 mg BAP/L + 0,3 mg Kinetin/L cho hiệu qua

nhân chồi tốt nhất

Đỗ Mạnh Cường và ctv (2015) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yêu tố

đến quá trình sinh trưởng và phát triển của loài cùng chi (A sefaceus) Kết quả cho thay

sử dụng môi trường SH lỏng có bông gòn + 1 mg BA/L cho hiệu quả nhân chồi tối ưu,mẫu không có hiện tượng hóa nâu, cây khỏe, rễ phát triển mạnh, số đốt trên chéi đạt6,33 dot

Phan Xuân Huyén và Nguyễn Thị Phượng Hoang (2017) đã nghiên cứu khả năng

tai sinh chồi và nuôi trồng loài Anoectochilus fomosanus Hayata Kết quả của nghiêncứu cho thấy, sử dung môi trường MS + 50 g chuối/L + 1 mg BA/L + 1 g than hoạt tínhthích hợp nhất cho quá trình nhân chồi với số chéi là (5,20 chổi), chiều cao chéi (3,38cm) Cùng năm này cũng có nghiên cứu của Nguyễn Thị Lệ Hà và ctv thu được kết quả

là môi trường MS + 1 mg/L BA cho kha năng nhân chỗi cao nhất (23,90 chải)

Nguyễn Trọng Quyền và ctv (2022) công bố nghiên cứu khai thác và phát triểnnguồn gen dược liệu lan gam (Anoectochilus formosanus Hayata.) tai Thanh Hóa và một

số tỉnh Bắc Trung Bộ Theo kết quả của nghiên cứu này, loài Anoectochilus fomosanus

Hayata đã được bồ sung loài vào hệ thực vật ở Việt Nam

1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng chất hữu cơ trong nuôi cấy in vitro

Vũ Quốc Luận và ctv (2014) đã sử dung nước dita non, nước vo gạo, bột khoaitây, bột chuối va peptone nuôi cây lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) Kết quả công

bố rang, sau 90 ngày nuôi cấy nghiệm thức được bổ sung 200 ml nước vo gạo/L có sựphát triển mạnh nhất (6,10 chồi và khối lượng chỗi 2,10 g) Song đó, nghiên cứu còn chỉ

ra rằng có thay thế nước đừa non bằng các chất hữu cơ như: bột khoai tây (100 - 200g/L), bột chuối 100 g/L hoặc peptone 1 g/L sẽ làm giảm chi phí đầu tư nhưng hiệu qua

cũng không kém.

Đỗ Thị Hương (2015) đã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa, dịch

chiết từ mầm ngô, dịch chiết từ quả táo đến sinh trưởng và phát triển của cây hoa cúcNhật Kết quả cho thấy, khi bồ sung 10% nước dừa vào môi trường nuôi cấy có hiệu quatốt nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của hoa cúc sau 40 ngày nuôi cấy

Nguyễn Thị Huyền Trang và ctv (2019) đã thực hiện nghiên cứu ứng dụng cáchợp chất hữu cơ dé thay thé nguồn nitrate vô cơ trong môi trường nuôi cấy và đánh giáhoạt tính của lan gam (Anoectochilus formosanus Hayata.) Kết quả cho thay, trên môi

trường Albert’s khi giảm 50% nitrate + 7 g nấm men/L cho hiệu quả tốt nhất với chiều

cao chéi đạt 6,4 cm, khối lượng tươi đạt 1,82 g/mẫu và khối lượng khô đạt 0,18 g/mau

sau 6 tuân nuôi cây.

La Việt Hồng và ctv, (2022) đã sử dụng tinh bột san dây như một chất làm đôngcho môi trường nuôi cấy hoa cúc đại đóa (Chrysanthemum grandiflorum) Kết quả thuđược cho thấy, sau 8 tuần sử dụng môi trường có bổ sung 7 g bột sắn dây/L thích hợpnhất với các chỉ tiêu đều vượt trội

Nguyễn Tiến Đạt (2019) sử dụng dịch chiết khoai tây, nước dừa trong nhân giốngcây hoa chuông (Sinningia speciosa) Kết quả thu được cho thấy bổ sung dịch chiết

khoai tây với mức 100 ml/L và nước dừa mức 200 ml/L thích hợp cho sự sinh trưởng

của cây hoa chuông, các chỉ tiêu cao nhất gồm chiều cao chéi (31,81 mm), số lá (14,28

lá).

L7

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nội dung thí nghiệm

Dé tài bao gồm 2 thí nghiệm được tiến hành có tính kế thừa:

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến quátrình nhân chéi của cây lan gam in vitro

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của ham lượng bốn dịch chiết chuối gia, khoai tây, giá

đậu xanh, củ đậu đến quá trình nhân chỗi của cây lan gam in vitro

2.2 Thời gian và Địa điểm thí nghiệm

Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2023 đến tháng I1 năm 2023 tại Phòng thínghiệm nuôi cay mô và tế bào thực vat thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh Lý — SinhHóa, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

2.3 Điều kiện thí nghiệm

Điều kiện tại phòng nuôi cấy:

— Cường độ chiếu sáng: 46,25 umol.m7.s!+ 3,75, chiếu bằng đèn huỳnh quang,

2.4.2 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng

trong thí nghiệm.

Thành phần Khôi lượng (mg/L)

NH4NO3 1.650 KNO3 1.900

Nicotine acid 0,5

Thiamine HCl 0,1

Môi trường dùng trong thi nghiệm là môi trường MS cơ ban (Murashige va

Skoog, 1962), có bổ sung thêm 30 g đường/L, 6,5 g argar/L và nước dừa cho thí nghiệm

1, bồ sung dich chiết chuối già, củ khoai tây, giá đậu xanh và củ đậu cho thí nghiệm 2.Môi trường được điều chỉnh pH ở mức 5,7 Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ121°C, áp suất 1 atm và duy tri trong 20 phút Môi trường được phân phối 50 ml cho

mỗi chai tam giác có dung tích 250 ml.

19

2.4.3 Các dịch chiết hữu cơ bé sung, thiết bị, dung cụ, hóa chất

- Dịch chiết bố sung (được mua tại các chợ trong khu vực Tp Thủ Đức, Tp Hồ Chi

Minh):

+ Nước dừa: sử dụng giống dừa xiêm xanh Bến Tre (Cocos mucifera), chọn lay nước từ

những quả non có pH khoảng 5,6 — 5,8.

+ Chuối già (Cavendish subgroup): chọn những quả chín vàng đều từ giống chuối giả

Nam Mỹ, trồng tại Khu thực nghiệm của Bộ môn Sinh Lý — Sinh Hóa, Khoa Nông học,Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

+ Khoai tây (Solanum tuberosum)

+ Giá đậu xanh: là cây giá sau 2 ngày nảy mam từ hạt đậu xanh (Vigna radiata)

+ Củ đậu (Pachyrhizus erosus)

- Thiết bị: Tủ cay vô trùng (Việt Nam), nồi hấp khử trùng Tomy SS — 325 (Nhật), may

đo pH của Takemuara DM — 15 (Nhat), cân phân tích của Ohaus (Mỹ), máy xay sinh tố,

2.5.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến

quá trình nhan chôi của cay lan gầm in vitro

Mục tiêu: Xác định được kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa thích hợp cho

quá trình nhân chôi của cây lan gam nuôi cây in vitro.

2.5.1.1 Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm hai yếu tố được bồ trí theo kiểu hoàn toànngẫu nhiên với 12 nghiệm thức va 3 lần lặp lại.

- Yếu tố K (kích thước mẫu): 1,0 em; 1,5 em; 2,0 em

- Yếu tố D (hàm lượng nước dừa): 50 ml/L; 100 m1/L; 150 ml/L (Kong va ctv, 2022)

Bang 2.2 Các nghiệm thức về kích thước mẫu va ham lượng nước dừa

` Yếu tô D (ml/L)Yêu tô K (cm) 0 50) 100 150

1,0 K1D0 (DC) KIDI KID2 KID3 1,5 K2D0 K2DI K2D2 K2D3 2,0 K3D0 K3DI K3D2 K3D3

Quy mô thí nghiệm

Thí nghiệm có 12 nghiệm thức, 3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 5 chai, trongmỗi chai chứa 3 mẫu Tổng số mẫu sử dụng là 540 mẫu

2.5.1.2 Cách thức thực hiện

Mau cấy là các đốt thân 2 và 3 của cây lan gam được nuôi cấy in vitro với 3 kíchthước (chiều cao) 1,0; 1,5; 2,0 cm, cay vào bình tam giác có chứa môi trường MS được

bổ sung nước dừa với các hàm lượng khác nhau

2.5.1.3 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Theo dõi quá trình sinh trưởng chéi của lan gam trong vòng 60 ngày, 15 mẫu/ô

cơ sở các chỉ tiêu:

- Thời điểm xuất hiện chỗi (NSC): tính ở thời điểm khi cay đến khi 50% số mẫu

cấy xuất hiện chéi

- Chiều cao trung bình của chéi (cm): dùng thước chia vạch đo chiều cao củachỗi, đo từ gốc thân đến đỉnh chéi cao nhất, đo 1 lần ở thời điểm 60 ngày sau cấy

- Số chồi/mẫu (chéi): đếm tất cả số chồi hình thành trên mẫu ban dau, đếm 3 lần,

20 ngày đếm 1 lần

- Số lá/mẫu (1a): đếm số lá phát sinh trên chdi, đếm 3 lần, 20 ngày đếm 1 lần

- Khối lượng tươi của chồi (g): cân vả tính khối lượng trung bình của 5 mẫu/ô cơ

sở, được ghi nhận tại thời điểm 60 ngày sau cấy

21

2.5.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của hàm lượng bốn dịch chiết chuối già, khoai tây,

giá đậu xanh, củ đậu dén quá trình nhân choi của cây lan gam in vitro.

Mục tiêu: Xác định được hàm lượng dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậuxanh, củ đậu thích hợp cho quá trình nhân chổi của cây lan gam nuôi cấy in vitro

2.5.2.1 Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm hai yếu tố được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫunhiên với 15 nghiệm thức và 3 lần lặp lại

- Đối chứng sử dụng môi trường không bổ sung chất hữu cơ

- Yếu tô L (loại chất hữu cơ): chuối già, khoai tây, giá đậu xanh, củ đậu

- Yếu tố H (hàm lượng chất hữu co): 50 g/L; 100 g/L; 150 g/L

(tham khảo có cải tiến từ Đặng Thi Thanh Tâm va ctv, 2021)

2.5.2.2 Cách thức thực hiện

Mau cấy là các đốt thân thứ 2 và 3 của cây lan gam được nuôi cấy in vitro từ thínghiệm 1, được cắt với kích thước (chiều cao) 1,5 cm, cay vào bình tam giác có chứamôi trường MS được bồ sung các dịch chiết hữu co với các ham lượng khác nhau

Chat hữu cơ bồ sung:

Chuối lột vỏ, cân lượng xác định, xay nhuyễn

Giá đậu xanh (cây giá sau hai ngày nảy mầm), cân lượng xác định, xay nhuyễn

Củ khoai tây và củ đậu sẽ được rửa sạch, cân lượng xác định, nâu đên khi mêm,

lọc lấy nước

Bảng 2.3 Các nghiệm thức về hàm lượng dịch chiết chuối già, khoai tây, giá đậu xanh,

củ đậu

Yếu tổ H (g/L)Yếu tô L (loại) 50 100 150

Chuối già LIHI LIH2 L1H3

Cu khoai tay L2H1 L2H2 L2H3

Giá đậu xanh L3HI L3H2 L3H3

Củ đậu L4HI L4H2 L4H3

Quy mô thí nghiệm

Thí nghiệm có 15 nghiệm thức, 3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 5 chai, mỗi chaichứa 3 mẫu Tổng số mẫu sử dụng 720 mẫu

Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi (tương tự thí nghiệm 1)

2.6 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu

Số liệu được ghi nhận và được tính trung bình bằng phần mềm Excel 2019, phântích phương sai (ANOVA), trắc nghiệm phân hạng Duncan trên phần mềm R studio ởmức ý nghĩa 0,001; 0,01 hoặc 0,05 So sánh bắt cặp giữa các nghiệm thức với đối chứng

ở thí nghiệm 2, sử dụng trắc nghiệm T-test

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hướng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến qua

trình nhân chồi của cây lan gấm in vitro

Thí nghiệm này được thực hiện nhằm khảo sát hiệu quả của sự kết hợp giữa yếu

tố kích thước mẫu cấy và hàm lượng nước diva trong môi trường nuôi cấy đến khả năngnhân chỗi từ mẫu đốt thân cây lan gam nuôi cấy in vitro

3.1.1 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến thời điểm hìnhthành choi lan gam in vitro

Bang 3.1 Anh hưởng của kích thước mau và hàm lượng nước dừa đến thời điểm hìnhthành chồi (NSC) cây lan gam in vitro

Kích thước Hàm lượng nước dừa bồ sung (D) (ml/L) `

mẫu (K) (cm) 0 50 100 iso Lime bin)

1,0 17,04a 15,00b-e 13,56ef 1420def 1495AB L5 16,03abe 1471cf 1321f 1428 def 14,56B

2,0 15,96 abc 15,24bed 14,19def 16,44 ab 15,46A Trung binh (D) 16,36A 14,98B 13,65C 14,97B

CV (%) = 4,07; Fx = 6,56**; Fp = 29,27***; Fx xp = 3,99**

Ghi chí: Trong cùng một nhóm giá tri trung bình, các SỐ có cùng ký tự theo sau thể hiện sự khác biệt không có ý

nghĩa trong thông kê; **: sự khác biệt rat có ý nghĩa trong thông kê (a=0,01); ***: sự khác biệt rat có ý nghĩa

trông thông kê (œ=0,001).

Kết quả ở Bang 3.1 cho thấy số ngày hình thành chỗi chịu sự tác động bởi cả yếu

tố kích thước mau cấy và yêu tố hàm lượng nước dừa Xét yếu tố kích thước mau, khi

sử dụng mẫu cấy với kích thước mẫu ban đầu 1,5 em đã cho khả năng hình thành chồimới sớm nhất (14,56 NSC), sự khác biệt giữa các kích thước rất có ý nghĩa trong thống

kê Xét theo yếu tố hàm lượng nước dừa, sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thông kê giữacác mức nước dừa bé sung Việc bỗ sung nước dita với mức 100 ml/L đã giúp hình thành

chỗồi sớm nhất, sau 13,65 NSC các mẫu đã bắt đầu phát sinh chéi Tuy nhiên, ở cả hai

mức 50 ml/L và 150 ml/L khả năng phát sinh chồi đều chậm Sự khác biệt giữa hai mứchàm lượng trên không có ý nghĩa trong thống kê, chéi đã xuất hiện sau 14,97 hoặc 14,98

NSC đối với hai mức nước diva này Ở nghiệm thức đối chứng khi không bồ sung nướcdừa thì khả năng phát sinh chồi chậm nhất (16,36 NSC) Xét sự tương tác giữa hai yếu

tố kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thông kê

Cụ thé ở nghiệm thức kết hợp giữa mẫu cấy có kích thước 1,5 cm kết hợp bổ sung 100

ml nước dừa/L cho số ngày phát sinh chồi sớm nhất (13,21 NSC)

Kết quả trên cho thấy, kích thước mẫu cấy có tác động lớn đến khả năng tái sinhchéi in vitro cây lan gam Khi cắt mẫu cấy quá ngắn sẽ gây tổn thương đến mầm ngủ,

làm kéo dai thời gian phục hồi của mau, khiến cho mẫu phân hóa chậm, tái sinh chéi

chậm Nếu mẫu cay được cắt quá dài sẽ gây ra hiện tượng chết ngược, vì thế phần mẫuphía trên mầm ngủ được cắt ngắn đi, phan mẫu dưới mam ngủ có thé dé dài phục vụ choviệc cắm mẫu vào môi trường và giữ lại một phần dinh dưỡng cung cấp cho mẫu tiếptục sử dụng sau khi cấy Việc bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy ở hàm lượngthích hợp đã làm tăng khả năng phát sinh chồi Điều này cũng đã được Maddock và ctv(1983), Mathias và ctv (1986) và Nasib và ctv (2008) đúc kết và cho rằng, quá trình táisinh chéi được tăng cường bằng cách bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy Từkết quả Bảng 3.1 cho thay, sử dụng mẫu cấy với kích thước 1,5 em kết hợp bé sung 100

ml nước dừa/L đã kích thích sự phục hồi và rút ngắn thời gian tái sinh chéi của cây langam (Anoectochilus formosanus Hayata.) trong nuôi cay in vitro

3.1.2 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến số chồi và số lá

cây lan gam in vitro

Két qua Bang 3.2 cho thay:

Xét theo yếu tố kích thước mẫu cấy, với mau cấy có kích thước 1,5 cm đã thuđược số chéi nhiều nhất (1,92 chéi/mau), sự khác biệt không có ý nghĩa với các mẫu cấy

có kích thước 2,0 cm (1,81 chồi/mẫu) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê sovới mức kích thước 1,0 em (1,54 chồi/mẫu) Xét yếu tố hàm lượng nước dừa, khi bổsung 100 ml nước dừa/L đã thu được số chồi nhiều nhất (2,70 chồi/mẫu), sự khác biệt

về số chồi hình thành giữa bốn mức nước dừa rất có ý nghĩa trong thống kê Xét sựtương tác giữa hai yếu tố kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa cho thấy, đã có sựkhác biệt rất có nghĩa trong thông kê giữa các nghiệm thức Ở nghiệm thức kết hợp giữa

2)

mẫu cay có kích thước 1,5 cm va được bé sung 100 ml nước dừa/L cho s6 chéi nhiéunhất (3,02 chồi/mẫu).

Bang 3.2 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến số chôi (chồi/mẫu)cây lan gam in vitro

Ngàysau Kich thước Hàm lượng nước dừa bồ sung (D) (ml/L) Trung

cay mẫu (K) (cm) 0 50 100 150 binh (K)

1,0 1,00 d 118d 2,26be 1,71cd 1,54B

20 1,5 118d 2,20be 3,02a 1,29 d 1,92A

2,0 110d 2/15be 2,84ab 1,17d 1,81AB Trung binh (D) 1,10C 184B _2,70A 1,39C

CV (%) = 16,27; Fx = 5,76**; Fp = 54,12**; Fxxp= 5,13**

1,0 1,11 2,31 3,96 2,62 2,50

40 12 1,37 3,53 4,43 2,42 2,94

2,0 1,34 3.22 4,21 215 2,73 Trung binh (D) 127C 3,02AB 420A 2.40BC

CV (%) = 35,18; Fx = 0,621: Fp = 14,63**; Fx xp = 0,371 1,0 121g 240e 443ab 2,92de 2,74B

60 1,5 1,54 fg 3,80 be 5,10a 2,63 e 3,27A

2,0 135g 3,63cd 453ab 2,24ef 2,94AB Trung binh (D) 1,37D 328B 4,69A 2,60C

CV (%) = 14,89; Fx = 4,32*; Fp = 87,54***; Fe xp = 2,90*

Ghi chi: Trong cùng một nhóm các giá trị trung bình, các số có cùng ký tự theo sau thé hiện sự khác biệt không

có ý nghĩa trong thong kê; ns: sự khác biệt không có ÿ nghĩa; *: sự khác biệt có ý nghĩa (a=0,05); **: sự khác biệt rat có ý nghĩa (a=0,01); ***: sự khác biệt rất có ý nghĩa (a=0,001).

Ở thời điểm 40 ngày sau cấy số chéi hình thành tiếp tục tăng Tuy nhiên, xét theo

yếu tô kích thước mẫu cấy cho thấy sự khác biệt giữ ba mức kích thước mẫu cay không

có ý nghĩa trong thống kê Mặc dù vậy, số chồi nhiều nhất vẫn ghi nhận khi sử dụngmẫu cấy với kích thước 1,5 cm (2,94 chồi/mẫu) Xét về yếu tổ hàm lượng nước dừa, khi

bồ sung 100 ml nước dừa/L môi trường cho số chéi nhiều nhất (4,20 chồi/mẫu), sự khác

biệt giữa các mức nước dừa bồ sung rất có ý nghĩa trong thống kê Xét sự tương tác giữa

hai yếu tô kích thước mẫu cấy và hàm lượng nước dừa cũng cho thấy sự khác biệt giữacác nghiệm thức không có ý nghĩa trong thống kê Số chéi ở thời điểm này dao động từ1,11 đến 4,43 chồi/mẫu

Tại thời điểm 60 ngày sau cấy, xét yếu tố kích thước mẫu cấy, khi sử dụng mẫucây với kích thước 1,5 cm đã thu được số chéi nhiều nhất (3,27 chồi/mẫu), sự khác biệt

không có ý nghĩa trong thống kê so với mẫu cấy ở kích thước 2,0 cm (2,94 chồi/mẫu)

nhưng sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê so với mẫu cấy có kích thước 1,0 em(2,74 chồi/mẫu) Xét yếu tổ ham lượng nước dừa, khi bé sung 100 ml nước dừa/ L cho

số chéi nhiều nhất (4,69 chồi/mẫu), sự khác biệt giữa bốn mức hàm lượng nước dừa rất

có ý nghĩa trong thống kê Xét sự tương tác giữa hai yếu tô kích thước mẫu cấy và hàm

lượng nước dừa cho thấy sự khác biệt giữa các nghiệm thức có ý nghĩa trong thống kê

Ở nghiệm thức sử dụng mẫu cấy với kích thước 1,5 em kết hợp bổ sung 100 ml nước

dừa/L môi trường thu được số chéi nhiều nhất (5,10 chồi/mẫu), sự khác biệt không có ýnghĩa với hai nghiệm thức sử dụng mau có kích thước 1,0 em và 2,0 cm kết bé sung 100

ml nước dừa/L (4,43 và 4,53 chồi/mẫu) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê

so với các nghiệm thức còn lại Nghiệm thức sử dụng mẫu cấy với mức 1,0 cm và không

bổ sung nước dừa cho số chéi thấp nhất (1,21 chồi/mẫu)

Kết quả trên đã chứng tỏ, kích thước mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong nuôicấy cây lan gdm in vitro Kích thước mẫu cấy ảnh hưởng rat lớn đến quá trình phục hồi

và phát sinh chồi mới Kết luận này tượng tự như nghiên cứu của Nguyễn Thị HồngGam (2010) trên đối tượng lan gam (A roxburghii), khi sử dụng mẫu cấy ban đầu có sựkhác nhau về kích thước hoặc loại mẫu đã có tác động đến quá trình phục hồi và pháttriển của mẫu trong nuôi cấy Khi bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy với hàmlượng thích hợp vừa nâng cao hàm lượng một số khoáng chất cho môi trường nuôi cấy,

vừa nâng cao lượng đường, giúp giải phóng carbon cho quá trình quang hợp, từ đó thúc

day sự sinh trưởng và phát triển chồi mạnh, cho kha năng nhân chi hiệu quả trên câylan gam nuôi cấy in vitro Ngược lại, khi không bổ sung nước dừa thì số chỗồi hình thành

it (1,37 chồi/mẫu) và khi thay đổi hàm lượng nước dừa ở mức là 50 ml/L và 150 ml/Lthì số lượng chổi dat lần lược 2,60 chồi/mẫu và 3,28 chéi/mau Kết quả này tương tựvới nghiên cứu của Abdullahil và ctv (2011) cho rằng khi bố nước dừa với hàm lượngcao sẽ làm giảm sự tăng trưởng và gây ra sự bất thường về hình thái của chồi

Từ những kết quả thu được cho thấy môi trường MS + 100 ml nước dừa/L + 30

g đường/L + 6,5 g agar/L kết hợp sử dụng mẫu cấy có chiều cao 1,5 cm sẽ cho hiệu quả

nhân chồi tốt nhất trên đối tượng lan gdm trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí

nghiệm.

Tu

(Anoectochilus fomorsanus Hayata.), chỉ tiêu số lá được mô tả ở Bảng 3.3.

Kết quả Bảng 3.3 cho thấy:

Tại thời điểm 20 ngày sau cấy hầu hết các nghiệm thức đã hình thành lá hoànchỉnh Xét yếu tố kích thước mẫu cấy, khi sử dụng mẫu cấy với kích thước 1,5 em thuđược số lá nhiều nhất (1,79 lá), sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so vớimức kích thước 2,0 cm (1,70 lá) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với mứckích thước 1,0 em (1,50 lá) Xét yếu tố hàm lượng nước dừa, khi b6 sung 100 ml nướcdừa/L cho số lá nhiều nhất (2.38 lá), sự khác biệt giữa các mức hàm lượng rất có ý nghĩatrong thống kê Xét sự tương tác giữa hai yếu tố kích thước mẫu và hàm lượng nướcdừa, cho thấy các nghiệm thức có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê Cụ thể, ởnghiệm thức sử dụng mẫu cấy với kích thước 1,5 cm và hàm lượng nước dừa bồ sung là

100 m1/L đạt số lá nhiều nhất (2,46 lá), sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so vớihai nghiệm thức sử dụng mau cấy với mức kích thước 1,0 và 2,0 cm có bổ sung 100 mlnước đừa/L (2,33 và 2,35 lá) cũng như hai nghiệm thức sử dụng mẫu cấy với kích thước

1,5 và 2,0 cm kết hợp bổ sung 50 ml nước dừa/L (2,29 và 2,17 lá) Tuy nhiên, sự khác

biệt rất có ý nghĩa thống kê khi so sánh với các nghiệm thức còn lại

Bang 3.3 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến số lá (1a) cây lan

gam in vitro

Ngày sau Kích thước _ Hàm lượng nước dừa bô sung (D) (ml/L) Trung bìnhcây mẫu (K) (cm) 0 50 100 150 (K)

1,0 107b 1,25b 233a 132b 1,50B

20 1,5 115b 229a 2,46a 1,27b 1,79A

2,0 114b 217a 235a LI5b 1,70A Trung binh (D) 112C 190B 238A L25C

CV (%) = 10,98; Fx = 8,28**: Fp = 93,58**: Fkxp= 7,28**

1,0 112d 155d 3,06a 2,30be 2,01B

40 L5 116d 3,03a 3,55a 1,69cd 2,36A

2,0 113d 293ab 3,22a 151d 2,20AB Trung binh (D) LI4D 250B 328A L%3C

CV (%) = 13,71; Fx = 4,05*; Fp = §4,05***: F xp= 8,79**

1,0 169e 333c 536ab 3,52c 3,47B

60 1,5 224de 480b 6lla 3,46c 415A

2,0 213de 462b 592a 2,82cd 3,87AB Trung binh (D) 202C 425B 580A 326C

CV (%) = 9,60; Fx = 10,33**; Fp = 169,43**; Fgxp= 4,19*%

Ghi chí: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các số có cùng ký tự theo sau thé hiện sự khác biệt không có ÿ nghĩa trong thông kê; *: khác biệt có ý nghĩa (a=0,05); **: khác biệt rất có ý nghĩa (œ=0,01); ***: khác biệt rat

có ý nghĩa (a=0,001).

Tại thời điểm 40 ngày sau cấy, xét yếu tô kích thước mẫu cho thấy, khi sử dụng

mẫu cấy có kích thước 1,5 cm cho số lá nhiều nhất (2,36 lá), sự khác biệt không có ýnghĩa so với mức kích thước 2,0 cm (2,20 lá) nhưng khác biết có ý nghĩa trong thống kê

so với mức kích thước 1,0 cm (2,01 lá) Xét yếu tố hàm lượng nước dừa, khi bổ sung

100 ml nước dita/L vẫn ghi nhận số lá nhiều nhất (3,28 lá), sự khác biệt giữa bốn mứchàm lượng nước diva rất có ý nghĩa trong thông kê Xét sự tương tác giữa hai yếu tố, sựkhác biệt giữa các nghiệm thức rất có ý nghĩa trong thống kê Ở nghiệm thức sử dụngmẫu cấy có kích thước 1,5 em kết hợp bổ sung 100 ml nước dừa/L đã thu được sé lánhiều nhất (3,55 lá) Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với hai nghiệm thức sửdụng kích thước mau 1,0 và 2,0 em kết hợp bổ sung 100 ml nước dừa/L (3,06 và 3,22lá) và hai nghiệm thức sử dụng mau cấy có kích thước 1,5; 2,0 cm kết hợp bé sung 50

ml nước dừa/L (3,03 và 2,93 14) Tuy nhiên, sự khác biệt rat có ý nghĩa thống kê khi so

với các nghiệm thức còn lại.

Từ những kết quả trên cho thay, không những nước dừa mà kích thước mẫu cấy

cũng có tác động đến sinh trưởng và phát triển của mẫu trong quá trình nuôi cấy, số liệu

29

ở thời điểm này đã ghi nhận mẫu cay ở mức chiêu cao 1,5 cm có sự sinh trưởng và phát

triên vượt trội hơn các mức chiêu cao khác.

Tại thời điểm 60 ngày sau cay, xét về yếu tô kích thước mau, khi sử dụng mẫu

cấy có kích thước 1,5 cm đã đạt được số lá nhiều nhất (4,15 14), sự khác biệt không có

ý nghĩa thống kê so với mức kích thước mẫu 2,0 em (3,87 lá) nhưng khác biệt rất có ýnghĩa thống kê so với mức kích thước 1,0 em (3,47 lá) Xét yêu tổ hàm lượng nước dừa,khi bổ sung mức nước dừa là 100 ml/L van thu được số lá nhiều nhất (5,80 lá), sự khác

biệt giữa bốn mức hàm lượng nước dừa rất có ý nghĩa trong thông kê Xét sự tương tác

giữ hai yếu tố kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa, ở nghiệm thức sử dụng mẫu cấy

có kích thước 1,5 cm kết hợp bổ sung 100 ml nước dừa/L thu được số lá nhiều nhất (6,11lá), sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức sử dụng mẫu cay ở haimức kích thước 1,0 và 2,0 em kết hợp bổ sung 100 ml nước dừa/L (5,92 lá) Tuy nhiên,

sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê khi so sánh với các nghiệm thức còn lại

Kết quả trên cho thấy, bố sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy giúp cho chồisinh trưởng mạnh, vừa phát triển chỗi chính, vừa tạo chéi bat định từ đó số lá cũng tăngtheo Khi so sánh kết qua này với kết quả Bang 3.2 nhận thấy, khi số chi tăng lên thì

số lá cũng theo đó tăng lên Yếu tố kích thước mẫu cũng có tác động đến chỉ tiêu số lácủa cây lan gam in vitro, tuy nhiên yếu tố hàm lượng nước dừa có sự tác động đến số lá

rõ rệt hơn so với yêu tô kích thước mẫu cây.

Từ những kết quả thống kê trên cho thấy, việc sử dụng mẫu cấy có kích thước

1,5 cm kết hợp bồ sung 100 ml nước dừa/L vào môi trường nuôi cấy cho kết quả tốt nhất

đôi với sô lá hình thành của cây lan gam nuôi cây in vitro.

3.1.3 Ảnh hưởng của kích thước mẫu và hàm lượng nước dừa đến chiều cao chồi

của choi cây lan gam in vitro

Kết quả Bang 3.4 cho thấy, khi xét theo yếu tố kích thước mẫu, việc sử dung mẫucay có kích thước 1,5 em cho chiều cao chéi cao nhất (3,12 em), sự khác biệt tạo ra giữacác mức kích thước mau cấy rất có ý nghĩa trong thống kê Xét yếu tố hàm lượng nướcdừa, cho thấy khi bổ sung 100 ml nước đừa/L sau 60 ngày nuôi cấy thu được chiều caochổi cao nhất (3,10 cm), sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so với việc không