Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng trong môi trường nuôi cấy in vitro đến sinh trưởng và ra hoa của cây hoa tím ba tư (Exacum affine Balf. fF Ex Regel)

TÓM TẮTĐề tài “Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng trong môi trường nuôi cấy in vitro đến sinh trưởng và ra hoa của cây hoa tím Ba Tu Exacum affine Balf.. 121.4 Các nghiên cứu ảnh hưởn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3k 3k 3k oe 3k 24s sk

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ DUONG VÀ KHOÁNG

TRONG MOI TRUONG NUOI CAY IN VITRO DEN

SINH TRUONG VA RA HOA CUA CAY HOA

TIM BA TU (Exacum affine Balf F Ex Regel)

SINH VIEN THUC HIEN : TRAN THI SON TIEN

NGANH : NONG HOC

KHOA : 2018 — 2022

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ ĐƯỜNG VÀ KHOÁNG TRONG MOI TRƯỜNG NUÔI CAY JN VITRO DEN

SINH TRUONG VA RA HOA CUA CAY HOA

TIM BA TU (Exacum affine Balf F Ex Regel)

Tac gia

TRAN THI SON TIEN

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

năm dai học Đồng thời, em xin cảm ơn quý Thay Cô trong các bộ môn thuộc Khoa Nông

hoc đã giảng dạy những kiến thức bé ích liên quan đến ngành học cũng như những lĩnh

vực khác có liên quan.

Em xin chân thành cảm ơn đến Cô Nguyễn Phạm Hồng Lan và Cô Lê Nguyễn LanThanh, đã tận tình giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức hữu ích, góp ý và hướng dẫn emhoàn thành tốt bài khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Rau Hoa và Cây Cảnh, Ban lãnh đạo Viện cây

ăn quả Miền Nam đã hỗ trợ vật tư, hóa chất, thiết bị, tạo điều kiện để em có thể hoàn

thành khóa luận tốt nghiệp

Lời cuối cùng em xin cảm ơn đến chị Lan Hân, chị Ngọc Hà đã luôn cho em nhữnglời khuyên trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm và tao mọi điều kiện để em có théhoàn thành tốt đề tài, cảm ơn các bạn Cẩm Hương, Thanh Di đã giúp đỡ và động viên emtrong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2023

Sinh viên

Trần Thị Sơn Tiền

TÓM TẮT

Đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng trong môi trường nuôi cấy in vitro

đến sinh trưởng và ra hoa của cây hoa tím Ba Tu (Exacum affine Balf F Ex Regel)” đã được tiến hành tại Viện Cây ăn quả Miền Nam, từ tháng 11 năm 2022 đến tháng 2 năm

2023 Mục tiêu của đề tài là xác định được nồng độ đường và khoáng trong môi trườngnuôi cấy in vitro thích hợp cho sinh trưởng và ra hoa của hoa tim Ba Tu

Thí nghiệm hai yếu tố được bồ tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD-2) gồm 4nồng độ đường: 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L và 3 nồng độ khoáng trong môi trườngMS: MS, 1/2 MS, 1/3 MS với 3 lần lặp lại (LLL) Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm chiều caocây, số cặp lá trên cây, số rễ trên cây, chiều dài rễ, tỉ lệ ra hoa, đường kính hoa và màu sắc

hoa.

Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường in vitro có nồng độ đường thích hợp chohoa tím Ba Tu sinh trưởng là khi bổ sung 30 g/L đường giúp cho chiều cao cây cao nhất(4,43 em), số rễ tốt nhất (9,47 rễ/cây) Xét nồng độ khoáng, khi sử dụng môi trường 1/3

MS để nuôi cấy hoa tím Ba Tư sẽ cho chiều cao cây cao nhất (5,37 cm), số rễ tốt nhất(9,25 rễ/cây), chiều dài rễ dai nhất (15,87 cm) Môi trường in vitro có nồng độ đườngthích hợp ra hoa tím Ba Tư là khi b6 sung 40 g/L cho đường kính hoa rộng nhất là 1,68

cm và tỉ lệ ra hoa cao nhất 64,44 % Khi xét nồng độ khoáng trong MS cho đường kínhhoa rộng nhất 1,49 em và tỉ lệ ra hoa cao nhất 70 % Khi kết hợp 40 g/L đường và 1/3 MS

giúp cho hoa tím Ba Tư đạt tỷ lệ ra hoa (83,33%) và đường kính hoa (1,95 cm) vượt trội,hoa màu tím đúng với đặc trưng của giống trong số các nghiệm thức thí nghiệm.

lil

1.1 So luge vé cay hoa tim Ba 6n .

1.1.1 Nguồn gốc của hoa tím Ba Tư 2- 2 522222E22E221221232212212212212212121221221 22 X2 31.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bao thực vật -2©-2+22+E++EE+2E+2Ez22z22zzzxzrxsred 41.2.1 Khái niệm nuôi cây mô tế bảo thực vật - 2 2 2+S+222E+E22E+EE2E+EE2Ee2xzErrxzea 41.2.2 Nhân giống vô tính in vitro — ưu nhược điểm của phương pháp - 51.3.3 Sơ lược lịch sử nuôi cay mô tế bảo thực vật ‹cccssbscbE 11 H00 0210101012 k0 61.2.4 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

1.3 Điều kiện, môi trường nuôi cấy và thành phần của môi trường MS 9

1.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 2- 2+s+22+E+Ez2E+EE+E£EE2EeEEzE.rxrrrrxrer 91.3.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật -2-©22+22++2c+szrxsrrxsrrrrrrrree 10

1.3.3 Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào -2-©2¿©2222222+22E22E2E2E2EEzzxzrxcrev 111.3.4 Thành phần môi trường MS 2 2 222E2SE22E22E22E12212212212212212222222 22 cze 121.4 Các nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng trong môi trường MS đốivới sự sinh trưởng và phát triển, ra hoa trong môi trường nuôi cấy in vitro 13CHUONG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 172.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu - 2 2+2 +s+2E+SE+E2E£2E+2EE21221221212122121122222 Xe 17

2.2 Điều kiện thí nghiệm - 2 2 2 SE+SE+SE22EE2E12E1271271211211211211211211212121 2E 17

2.4.2 Quy mô thí mghiG eee cececccccceccssessssssecssessesssesssesseesssssessuessessuesseessesstssseesteeseessees 19

2.4.3 Cae chi tiểu Va †iMinig Pháp CHOW COI eccscccsssssscemssscunescsnnuncsrmnanssamnemenasas 19

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Viết tắt Viết đầy đủ (ý nghĩa)

CRD Completely Randomized Design

(Kiéu hoan toan ngau nhién)

Ctv Cong tac vién

i lễ Lan lặp lại

MS Murashige and Skoog medium

(Môi trường MS)

NT Nghiệm thức

NSC Ngày sau cấy

RHS Royal Horticutural Society

TP Thành phố

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 1.1 Liều lượng pha các loại môi trường MS nuôi cấy -2222z225z22522 14

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng đến chiều cao cây (cm) của hoa tím

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng đến số cặp lá của hoa tím Ba Tư 25Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng đến số rễ (rễ/cây) của hoa tím Ba

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng đến đường kính hoa (mm) Tím Ba

Tỉ trong mi trưng 1 eer ere ve crore reesmeeeeneremeneanenesseanenwerecemmomman: 28

Bảng 3.6 Ti lệ ra hoa (%) của hoa tim Ba Tư ghi nhận ở thời điểm 8 tuần sau cấy 29

Vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Tình 2.1 TRnh rốn GÊY sec guonkennueetotsDnoogtitixisgciinDgST0I0TND1486023053000050010238.000000301020380800⁄8 17Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Lc c2 E211 2111121111155 11 11 xe l6

Hình 2.3 Toàn cảnh khu vực thí nghiệm 28 NSC - - 19

Hình 2.4 Bình môi trường không bị nhiễm nắm + + ¿<< 22-22222222 css2 20

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Hoa tím Ba Tư (Exacum affine Balf F Ex Regel) là một trong những loại cây

trồng trong chậu có hoa màu xanh lam hiếm gặp Ngoài những bông hoa màu xanh vàtím hap dẫn, sự phổ biến của nó là do hương thơm của nó, tán lá xanh bóng, chi phí

sản xuất thấp, dễ vận chuyên và hoa lâu tàn (Riseman, 2007).

Ngày nay, cây hoa tím Ba Tư vừa có giá trị trong cảnh quan vừa là cây cung cấpnguyên liệu được phẩm nên nhu cầu ngày càng tăng Cây hoa tím Ba Tư tuy có thểnhân giống bằng phương pháp hữu tính (bằng hạt) nhưng gặp nhiều khó khăn do tỷ lệnay mam thấp, đồng thời kha năng nhân giống bằng phương pháp giâm cành cũng kém,

số lượng cây trồng bị hạn chế Do đó, việc tìm ra phương thức nhân giống mới nhằmsản xuất được số lượng lớn trong thời gian ngắn là rất cần thiết Sử dụng phương phápnuôi cay mô in vitro là một trong những phương pháp hữu hiệu có thé giải quyết

những khó khăn trên.

Mặt khác, giá trị cây cảnh cao bản thân cây hoa in vitro đã thu hút sự chú ý Tuy

nhiên, nghiên cứu về sự ra hoa trong ống nghiệm nhằm mục dich phát triển các loạicây trồng trong nhà mới chỉ được giới hạn ở một số loại cây sự ra hoa trong ốngnghiệm của nhiều loài thực vật đã được báo cáo (Van Staden và Dickens, 1991) Ví dụ,hạt tiêu (Tisserat và Galleta, 1995), hạt đậu (Fujioka va ctv, 1999) và mướp đắng(Wang và ctv, 2001), rau muống Nhật Bản (Ishioka và ctv, 1991), hoa hồng (Wang

và ctv, 2002).

Duong Tấn Nhựt (2011) đã trích dẫn nhiều nghiên cứu cho thấy các yếu tố tác

động đến sự hình thành hoa in vitro như cytokinin, gibberellin, đường và các chất

khác; ngoài ra, đường được xem là nguồn carbon quan trọng trong môi trường nuôi

cây có vai trò cảm ứng sự hình thành và phát trién của hoa in vitro.

Và nuôi cấy trong ông nghiệm ra hoa hàng năm hoa tím Ba Tư được đánh giá làhấp dẫn về mặt thâm mỹ, do đó đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ đường và khoángtrong môi trường nuôi cấy in vitro đến sinh trưởng và ra hoa của cây hoa tím Ba Tư

(Exacum affine Balf F Ex Regel)” đã được thực hiện.

1

Mục tiêu

Xác định được nồng độ đường và khoáng trong môi trường nuôi cấy in vitro thích

hợp cho sinh trưởng và phát triển của hoa tím Ba Tư

Yêu cầu

Bồ trí thí nghiệm chính quy theo dõi các nhóm chỉ tiêu sinh trưởng và ra hoa củacây hoa tím Ba Tư gồm chiều cao cây, số cặp lá trên cây, số rễ trên cây, tỉ lệ ra hoa,đường kính hoa, màu sắc hoa

Giới hạn của đề tài

Thí nghiệm chỉ tiến hành nghiên cứu ở 4 nồng độ đường, 3 nồng độ khoáng khácnhau đối với sự sinh trưởng va ra hoa của cây hoa tím Ba Tư (Exacum affine Balf F

Ex Regel) nuôi cấy in vitro tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Rau, Hoa

và Cây cảnh, Viện cây ăn quả Miền Nam, tỉnh Tiền Giang từ tháng 11 năm 2022 đến

tháng 2 năm 2023.

CHƯƠNG 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây hoa tím Ba Tư

1.1.1 Nguồn gốc của hoa tím Ba Tư

Hoa tím Ba Tư (Exacum affine Balf F Ex Regel) là một loài thực vật thuộc

họ Long Đởm (Gentianaceae), chi Exacum Đây là loài đặc hữu của quần daoSocotra của Yemen (Miller và Morris, 2004) Môi trường sống tự nhiên của chúng làvùng nhiều đá Day là một cây thân thảo nhỏ mọc hai năm một lần cao 20 — 30 cm với

lá màu lục đậm và có hình trứng Hoa nhỏ màu tím với nhị màu vàng và có hương

thơm Hoa được trồng rộng rãi như một loại cây trồng trong nhà ở châu Âu dưới nhiềutên khác nhau bao gồm tim Ba Tu, tim A rap, tím Đức nhưng thường được biết đếnvới tên thương mại là hoa tím Ba Tư.

1.1.2 Phân bố của hoa tím Ba Tư

Loài này phân bố rộng rãi, điển hình là ở các bãi cỏ dưới nước hoặc trong các

khe và hốc đá lấy nước, trên cả đá granit và đá vôi Nó hiện diện ở độ cao từ mực nướcbiển đến 1.050 m với 40 loài đã biết của chi Exacum (Cronquist A., 1988) phân bố trênmột phạm vi rộng từ khu vực trung tâm của Châu Phi, bao gồm cả Madagascar, đếnbán đảo A Rap, Đông An Độ, dãy Himalaya và Sri Lanka, Malaysia, phần phía đôngcủa New Zealand (Riseman va Craig, 1995), Châu Au, Nhat Ban, Hoa Ky (Serek vaTrolle, 2000) Các thành phần của Exacum affine là axit p-coumaric, affinoside vaglucozit (Kuvajima và ctv, 1996) Ngoài công dung làm cảnh, một số nghiên cứu cũng

đã chứng minh cây hoa tím Ba Tư còn là nguồn chuyên hóa thứ cấp đặc biệt trong sảnxuất acid phenolic và dau bay hơi (Skrzypczak-Pietraszek và ctv, 2014, 2015) và cũng

là nguồn tiềm năng phát triển thuốc kháng vi rút (Mothana và ctv, 2006)

Chủ yếu, tím Ba Tư được bán cho người tiêu dùng dưới dạng cây trồng trongchậu thông qua những người bán hoa và nhà kính Đan Mạch sản xuất khoảng 65%nguồn cung của thé giới, trong khi Hà Lan bé sung thêm 20%.

Ra hoa in vitro là một hiện tượng độc quyền trong công nghệ nuôi cấy mô thựcvật Sự có nhân tạo này cho thay quá trình chuyên đổi từ tăng trưởng sinh dưỡng sang

sinh sản có thể xảy ra trong điều kiện vô trùng và hoàn thành vòng đời của thực vật

Nhiều cây trồng có thé tạo ra những bông hoa in vitro hap dẫn Do đó, điều này đã dẫnđến việc du nhập các loại cây nở hoa trong các bình nuôi cấy kín, chẳng hạn như câytím Ba Tư, hiện đang được bán trên nhiều nền tảng ở Thái Lan Nhà ở ở nhiều khu đôthị đã được chuyên thành chung cư, thường sử dụng chậu cây để trang trí Hoa tím Ba

Tư được nuôi trồng trong in vitro có thé dùng dé trang trí văn phòng và thay thế những

chậu cây trang trí nhà cửa mà không cân tưới nước, bón phân.

Ở Việt Nam hoa tím Ba Tư trồng chậu chưa phô biến chỉ giới hạn ở các thí

nghiệm nghiên cứu in vitro.

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng(thân, lá, vỏ, củ ) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép vả nuôicấy in vitro Trong đó nuôi cấy in vitro được coi là phương pháp hữu hiệu nhất Nhângiống vô tinh in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chéi

ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vôtrùng của ống nghiệm Phương pháp nhân giống in vitro được bổ sung cho các kỹ thuậtnhân giống vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tach dòng một kĩ thuật tiến bộ vớinhững ưu điểm như:

Tốc độ nhân giống cao

Chủ động sản xuat, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ Có khả

năng công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinhdưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân câygiống với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới

Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện ditruyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh họcthực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý

1.2.2 Nhân giống vô tinh in vitro — ưu nhược điểm của phương pháp

Theo Ngô Xuân Bình và ctv (2000) "Nhân giống vô tinh in vitro là phươngpháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bảo) bằngcách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trườngnuôi cấy thích hợp và được kiểm soát"

1.2.2.2 Ưu điểm của nuôi cấy mô in vitro

Nuôi cay mô in vitro có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quankhác nhau của cây như long thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chỗồi phat hoa, hạt phan

Được nuôi cay trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus thông qua

xử lí nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Có thể sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnhnhư nhiệt độ, ánh sáng, độ am

Hệ số nhân giống cao

Nhân được số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ

Dé dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyền gen

1.2.2.2 Nhược điểm của nuôi cấy mô in vitro

Quá trình nuôi cấy mô in vitro phức tap và cần khoảng thời gian dài trước khicây có thê thích ứng trồng ngoài vườn ươm

Dễ xuất hiện các biến đị soma trong quá trình nuôi cay đặc biệt tai sinh qua mô seo.Chi phi dau tư cho dụng cụ, thiết bị và phòng thí nghiệm nuôi cấy mô rat cao.1.2.3 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật đư trải qua một lịch sử phát triển lâu dài và đượcđánh dấu bằng những sự kiện chính sau:

Năm 1902, Harberlandt lần đầu tiên đưa ra các lý thuyết và Schneider vàButschli (người mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào) vào thực nghiệm nuôi cấy

mô cây 1 lá mầm nhưng không thành công

Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành côngtrong việc nuôi cay một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh

Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hooc môn

thực vật đầu tiên thuộc nhóm Auxin có khả năng kích thích sự phát triển tăng trưởng

và phân chia tế bào thực vật

Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thànhcông trong thời gian dài từ mô tượng tầng, Nobetcourt nuôi cấy củ Cà rốt và nhậnđược sự phân bào tạo ra khối tế bào phân chia

Năm 1941, Overbeek và cộng sự đư sử dụng nước dừa trong nuôi cay phôi non

ở cây cà rốt Patura

Năm 1955, Miller và cộng sự phát minh ra cấu trúc và sinh tổng hợp Kinetin là

1 cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hóa chéi ở mô nuôi cấy

Năm 1957, Skoog va Miller tạo ra được chéi từ mảnh mô thân cây thuốc láđồng thời khám phá vai trò của ty lệ nồng độ các chất Auxin/ Cytokinin, nồng độ

auxin/ nồng độ cytokinin < 1 có xu hướng tạo ra chồi Ngược lại khi nồng độ auxin/

nồng độ cytokinin >1 mô có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin va cytokinin thíchhợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh

Năm 1958, Keinert và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bàotượng tang tách từ cây ca rốt được nuôi cấy một dạng huyền phù

Năm 1960, Morel đư thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuậtnuôi cay đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan cymbidim.

Năm 1960, Cooking lần đầu tiên sử dụng enzim phân giải thành tế bào và đưtạo ra số lượng lớn tế bảo trần ở những cây trồng khác nhau

Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy thé đơn bội ở cà độcdược từ bao phan

Năm 1967- 1968, lần lượt Nichkoi Nakato va cộng sự tạo được cây đơn bội từbao phan thuốc lá

Năm 1971, Takeb tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần

Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạođược cây từ dung hợp tế bao trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N langsdorfi

Năm 1977, Chers lai thành công tế bào soma cây cà chua và cây khoai tây

Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật đư có những bước tiễn vượtbậc với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọn tạo giống cây trồng như: đột biến

tế bao soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bao trần, tạo dòng kháng thé, nuôi cấy baophan, hạt phan trên nhiều đối tượng cây trồng Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ

tư của nuôi cấy mô tế bào, đây là giai đoạn nuôi cay mô tế bào được ứng dụng mạnh

mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinhhọc và nghiên cứu lý luận di truyền ở thực vật bậc cao

1.2.4 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.4.1 Tính toàn năng (Totipotence ) của té bào

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôicấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rang mỗi tế bào của bat kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năngtiềm tang dé phát triển thành một cơ thé hoàn chỉnh Mỗi tế bao của cơ thé da bào đềuphát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa làmỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ

thé hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát

triển thành một cơ thé hoàn chỉnh

Miller và Skoog (1953) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tếbảo lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào Thành công trên đã tạo ra côngnghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng

và dòng chống chịu

1.2.4.2 Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Theo Nguyễn Quang Thạch và ctv, 2003 cơ thể thực vật trưởng thành là mộtchỉnh thê thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiềuloại tế bào thực hiện các chức năng khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đềubắt nguồn từ tế bao phôi sinh Sự phân hoá tế bào là sự chuyên các tế bảo phôi sinhthành các tế bảo của mô chuyền hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thê

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, phân hoágen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đượchoạt hoá (mà trước đây bị ức chế) dé cho biểu hiện trang thái mới, một số gen khác lại

bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trongcau trúc phân tử AND của mỗi tế bao Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơthé thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện

thuận lợi cho các gen được hoạt hoá Quá trình phân hoá được xảy ra theo một chương

trình định sẵn

1.2.4.3 Cơ chế di truyền thông qua các hệ tế bào

Theo Nguyễn Hồng Minh (2002) cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bàobao gồm các công đoạn:

Trong nội bộ từng cơ thể được diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là cơ chếphân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con có bộ NST giốngnhau và giống tế bao mẹ ban đầu Như vậy qua nguyên phân bộ NST của tế bao me duchuyên nguyên vẹn sang tế bao con

Giữa 2 thế hệ cơ thé được hình thành thông qua cơ chế giảm phân du làm cho

ở thế hệ đời sau có hiện tượng phân ly tính trạng, do bộ NST của thế hệ sau khônggiống nhau và không giống bố mẹ Vì vậy việc duy trì các tính trạng mong muốn ở bố

mẹ sang thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính sẽ không thể đảm bảo hoàn toàn chắc chắn.Đây là một trở ngại lớn trong sinh sản hữu tính Ngày nay bằng phương pháp sinh sản

vô tính người ta đã khắc phục được nhược điểm này Đặc biệt là nhân giống vô tính in

vitro.

Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống in vitro khi lay các bộ phansinh dưỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông tin di truyềngiống nhau và tạo nên các cơ thể mới có thông tin đi truyền giống nhau và giống cơ

thé me Như vay nếu cơ thé me có các tinh trạng đi truyền tốt thì các tính trạng đó sẽ

được thê hiện ở mọi cơ thê con cái.

1.2.4.4 Cơ sở hóa học của nuôi cấy mô, tế bào

Môi trường nuôi cấy được coi là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trìnhnuôi cấy

Theo Street (1973) môi trường nuôi cấy như là phần “đệm” để cung cấp cácchất cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấyinvitro Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng

đa lượng, vi lượng, nguồn cacbon, các chất điều hoà sinh trưởng và một số phụ gia khicần, tuỳ vào từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cay, cơ quan khác nhau trên cùng cơ thé

mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau

Lựa chọn môi trường là phải thích hợp với sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ởtừng giai đoạn của mô nuôi cấy, thành phần và hàm lượng các chất phải thật chính xác

và phù hợp với từng đối tượng cụ thể Môi trường MS là môi trường chủ yếu được lựachọn trong nhân giống in vitro

1.3 Điều kiện, môi trường nuôi cấy và thành phần của môi trường MS

1.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân

hoá tê bào và cơ quan nuôi cây.

1.3.1.1 Điều kiện vô trùng

Theo Nguyễn Quang Thạch (2003): Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điềukiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môitrường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết đến sự

thành bại của của nuôi cây mô in vitro.

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóahọc, tia cực tim có khả năng diệt nam và vi khuẩn Vô trùng ban đầu là một thao táckhó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thờigian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chấtnhư HgCI2 0.1%, NaHCI 10%, nước Clolox, cồn 76°, clorox, dé khử trùng.

Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng,

phòng nuôi cây.

1.3.1.2 Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trìnhsinh trưởng của mô nuôi cấy

Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tốnhư: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếusáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợpvới đa số các loài cây là 12 — 18 h/ngay

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Hiệnnay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô dé cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ

2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ

1.3.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng phải có day đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiếtcho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật,cho đến nay đư có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đíchnày, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phô biến như MS, LS,WP, và môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng

rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cảthực vat I lá mam, 2 lá mầm.

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cây mô tế bào thực vật nhưng đều gồmmột số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Nguồn cacbon

- Các vitamin và amino axIt.

- Chất bồ sung, chất làm thay đổi trạng thai môi trường

- Các chất điều hòa sinh trưởng

1.3.3 Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào

Theo Ngô Xuân Bình và ctv (2000): Nuôi cấy mô tế bao gồm 5 giai đoạn sauGiai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

- Day là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống invitro.Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng dé đưa vàonuôi cây Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ

lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh

- Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian

xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng,chéi nách, hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

- Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của

mô nuôi cay Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinhtrưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy

- Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi

cấy Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đưchuyên hoá

Giai đoạn 3: giai đoạn nhân nhanh chéi

- Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Chính vì thế giai đoạn nàyđược coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cay Dé tăng hệ số người ta thườngđưa vào môi trường nuôi cây các chât điêu hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, ), các

11

chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nắm men, , kết hợp với các yếu tô ánh

sáng, nhiệt độ thích hợp Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân

nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chéi (nhân cụm chi), hay kích

thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

- Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyên sang môi trường ra rễ.Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ nay sẽ ra rễ va trở thành cây hoàn chỉnh Ở giaiđoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng

thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô

nuôi cấy

- Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụngnhiều nhất dé tạo rễ cho chdi

Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất

- Day là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng dụngcủa quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Day là giai đoạn chuyên cây

từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các

điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũngnhư trong ruộng sản xuât.

1.3.4 Thành phần môi trường MS

Môi trường MS là tên của loại môi trường tổng hợp được pha sẵn có chứa đầy

đủ khoáng đa lượng, vi lượng, vitamins Môi trường rất giàu dinh dưỡng dành cho cácgiai đoạn nuôi cấy mô thực vật, là tên viết tắt của Murashige and Skoog medium, được

phát minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige và Skoog Folke K vào năm

1962 khi Murashige đang tìm kiếm một loại hormone mới

Môi trường MS pha sẵn có 2 dang đó là bột và nước Ở dang bột mỗi lần phachỉ cần lay 4,4 g cho 1 L nước, 6 dang nước mỗi lần lay lmL MS cho 1 L môi trường

Môi trường MS được coi như là một môi trường cơ bản, được sử dụng phổ biến

trong nuôi cây mô thực vật.

Bảng 1.1 Thành phần của môi trường MS được pha sẵn

Nhóm Tên gọi Muối khoáng Nồng độ mg/L

Đa lượng Ammonium nitrate NH,NO; 1650

Potassium phosphate KH,PO, 170

Potassium nitrate KNO;3 1900

Magnesium sulphate MgSO,.7H,O 370

Calcium chloride CaCl,.2H,O 440

Vi luong Manganese sulphate MnSO,.4H,O 22,3

Boric acid H;BO; 6,2

Zinc sulphate ZnSO¿.4H;O 8,6

Potassium iodide KI 0,83

Sodium molybdate Na,MoQ,.2H,O 0,25

Cupric sulphate CuSO,4.5H2,0 0,025

Cobalt chloride CoCl,.6H,O 0,025

1.4 Các nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường và khoáng trong môi trường

MS đối với sự sinh trưởng va phát triển, ra hoa trong môi trường nuôi cấy in vitro

Sự ra hoa 1n vitro bị ảnh hưởng bởi nồng độ và tỷ lệ của 2 thành phần chính:

nguồn cacbon và vi chất dinh dưỡng

Đường được coi là một thành phần quan trọng nguồn carbon trong môi trườngnuôi cấy dé kích thích và phát triển hoa thành công Theo Vu và ctv (2006) báo cáo

rang sucrose chỉ cân thiệt cho việc cảm ứng va sự phat triên sớm cua nụ hoa.

Môi trường MS, nồng độ nito cao thường ức chế sự ra hoa và thúc day tăngtrưởng sinh dưỡng, đồng thời giảm một nửa hàm lượng khoáng chất trong môi trường

MS hoặc giảm nồng độ nito tăng cường sự ra hoa in vitro ở Cymbidium niveo

martatum (Kostenyuk và ctv, 1999)

Sự ra hoa là một quá trình chuyên tiếp từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sanggiai đoạn sinh trưởng sinh sản, nó được điều khién bởi cả yếu tố nội sinh va ngoại sinh

Ra hoa in vitro có thể cung cấp một mô hình lí tưởng dé nghiên cứu cơ chế sinh lí của

sự nở hoa, ứng dụng trong công tác chọn tạo giống Ra hoa in vitro có thể cung cấpmột mô hình lí tưởng để nghiên cứu cơ chế sinh lí của sự nở hoa, ứng dụng trong côngtac chọn tạo giống Thêm vào đó, việc điều khiển sự ra hoa in vitro góp phần thúc đâyquá trình chon tạo các giống hoa mới cũng như làm đa dang sản phẩm hoa trang trí

Theo Lê Thị Thùy Linh và ctv (2020) làm thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của

nồng độ khoáng lên sự hình thành hoa Forget-me-not in vitro trên các môi trường 2MS,

1/5MS, MS, 1/2 MS, 1/4 MS, có bồ sung 30 g/L sucrose và 8 g/L agar trong đó: môitrường 2MS, 1/5MS tăng thành phan da lượng theo tỉ lệ tương ứng: 1/2 MS, 1/4 MSgiảm thành phần đa lượng theo tỉ lệ tương ứng thì cho kết quả tỉ lệ hình thành nụ hoaForget-me-not (Browallia americana L.) trong điều kiện in vitro phụ thuộc lớn vàohàm lượng các chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy Tỉ lệ ra nụ đạt kết quả

cao nhất (87,22%) trên môi trường 1/4 MS sau 45 ngày nuôi cấy Tuy nhiên, cũng trên

môi trường này, chiều cao cây lại thấp nhất (8,74 cm), trong khi đó ở môi trường1/5MS, chiều cao cây lên tới 12,69 cm

Trên giống hoa hồng Tường Vi (Rosa damascena Mill.) sử dụng đường ở nồng

độ 50 g/L là thích hợp cho sự hình thành hoa in vitro hon 30 g/L khi nuôi cấy trên môitrường MS bồ sung BA 3,0 mg/L và NAA 0,5 mg/L Và tỷ lệ cây ra hoa khi nuôi cấy ởnồng độ đường 50 g/L đạt 6,25% trong khi ở nồng độ đường 30 g/L không có sự hình

thành hoa (Lê Nguyễn Lan Thanh và ctv, 2018)

M Shimizu và W Amaki (2016) hoa Baby (Gypsophila muralis L.) tỷ lệ ra hoa

là 100% khi bổ sung hơn 30 g/L đường sucrose là cao nhất và số lượng hoa được quansát trên môi trường 1/2 MS bồ sung 40 g/L đường sucrose BA và 0,1 mg/L NAA làthích hợp nhất cho sự ra hoa Sự phát triển sinh dưỡng, đặc biệt là các chồi bên, mạnh

mẽ hơn khi MS cao hơn và sự xuất hiện của nụ hoa và sự ra hoa là 100% trong tất cảcác lô Số lượng bông hoa cao nhất được quan sát thấy trên môi trường 1/2 MS và thấpnhất trên MS-NH,NO3 ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đối với sự sinh trưởng

và ra hoa đã được kiểm tra Các cây con đã chọn được cấy vào môi trường 1/2 MS có

bổ sung các nồng độ khác nhau của sucrose (0, 10, 20, 30, 40 và 80 g/L)

M Shimizu và Wakanori Amaki (2016) hoa Baby (Gypsophila muralis L.) được

cấy sang môi trường 1/2 MS bồ sung 40 g/L saccarozo và 8 g/L agar (pH = 5,8) Việc

đóng bình cấy được thay đôi dé tăng khả năng thông gió từ 2 — 4 tuần sau khi cấy Sửdụng quy trình này, cảm ứng 100% sự ra hoa trong ống nghiệm của hoa Baby(Gypsophila muralis L.) hàng năm thu được trong vòng 50 — 60 ngày sau khi gieo hạt vớihơn 100 bông hoa va thời kỳ hoa nở kéo dai trong môi trường in vitro là ít nhất 50 ngày

Tổng trọng lượng tươi và số nhánh bên lớn hơn khi đường sucrose nồng độ caohơn nhưng chiều cao cây thấp hơn ngoại trừ 0 g/L sucrose Tỷ lệ ra hoa là 100% khi

bổ sung hơn 30 g/L sucrose Cao nhất số lượng hoa được quan sát trên môi trường 1/2

MS bồ sung 40 g/L sucrose Hoa Baby (Gypsophila muralis L.) trồng trong nồng độđường 80 g/L héo sớm vì áp suất thâm thấu cao (M Shimizu và W Amaki, 2016)

Zeng và ctv (2013), nồng độ đường sucrose 50 g/L thích hợp nhất cho sự ra hoa

in vitro của giống hoa hồng Rosa hybrida L cv Fairy Dance

Lượng chat dinh dưỡng da lượng va vi chat dinh dưỡng, nồng độ sucrose, chatđiều hòa sinh trưởng, than hoạt tính và điều kiện ánh sáng ảnh hưởng đáng kế đến khanăng ra hoa Chéi hoa mõm chó (Torenia fournieri L.) được nuôi cay trên môi trường1/4 MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung 60 g/L sucrose và

1 g/L than hoạt tính trong các bình được bao phủ bang bọc nhựa với bộ lọc miliporehoặc phích cắm bông gòn không thấm nước dưới ánh sáng 10 giờ (45 pmol.m-2.s-1)/14 giờ quang chu kỳ tối dẫn đến sự hình thành chéi ra hoa tốt nhất của chồi hoamom chó (7orenia fournieri L.) nuôi cay in vitro (89,18%, 2,80 chỗồi hoa/mẫu) Hoa in

15

vitro và hoa ex vitro không có sự khác biệt dang kể về hình thái và màu sắc (Lê Văn

Thức và ctv, 2012).

Lượng đường thích hợp cho môi trường nuôi cấy cây hoa Lay ơn là 60 g/L chocây tốt khỏe, củ to và đẹp (Huỳnh Thị Ngọc Thảo, 2001)

Nông độ khoáng 32 mL/L thích hợp cho 3 giống lan Dendrobium, Cattleya, Vũ

Nữ phát triển tốt cây to, khỏe, tốc độ tăng trưởng nhanh (Huỳnh Thị Ngọc Thảo, 2001)

Theo Lê Thị Thùy Linh và ctv (2020) làm thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của

nồng độ đường lên sự hình thành hoa Forget-me-not in vitro nồng độ đường sucrosekhảo sát ở các mức 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70 và 90 g/L Các cây ở thí nghiệm sử dụngđường sucrose có chiều cao tương đối đồng đều, cây đạt chiều cao cao nhất 14,64 em

ở nồng độ 40 g/L và thấp nhất 10,43 cm ở nồng độ 20 g/L Khi tăng nồng độ đườngtrong môi trường, cây sẽ rút ngắn thời gian sinh trưởng sinh dưỡng và bước vào giaiđoạn sinh sản sớm tỉ lệ ra hoa cao nhất khi sử dụng sucrose ở nồng độ 90 g/L (52,46%)

Nhìn chung, các nghiên cứu về nồng độ đường và khoáng trong môi trường MStrên hoa tím Ba Tư còn hạn chế Nhằm xác định ảnh hưởng của nồng độ đường vàkhoáng trong môi trường MS đến quá trình sinh trưởng và ra hoa tim Ba Tư (Exacumaffine Balf F Ex Regel) làm co sở để hoàn thiện quy trình kĩ thuật, chủ động điềukhiến ra hoa in vitro góp phan thúc đây quá trình chon tạo các giống hoa mới cũng nhưlàm da dang sản phẩm hoa trang trí

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện tại Phòng thí nghiệm nuôi cay mô của Bộ môn Rau,Hoa và Cây cảnh, Viện Cây ăn quả miền Nam từ tháng 11/2022 đến tháng 2/2023.2.2 Điều kiện thí nghiệm

Thí nghiệm nuôi cấy được bố trí trong điều kiện phòng thí nghiệm với nhiệt độ

26 + 2°C, cường độ ánh sáng 2.000 — 2.500 lux, âm độ phòng nuôi cấy 60 — 80 %, thờigian chiếu sáng 16 giờ /ngày Bình cấy sử dụng cho thí nghiệm là bình thủy tinh danghình trụ tròn có dung tích 250 mL và chứa 40 mL môi trường nuôi cấy

2.3 Vật liệu thí nghiệm

2.3.1 Giống hoa tím Ba Tư trong nuôi cấy mô

Giống hoa tím Ba Tư được sử dụng làm thí nghiệm là giống nuôi cấy mô trongmôi trường MS 1,5 tháng tuổi Mẫu cấy là mẫu ngọn có 3 cặp lá, cao 1 cm

17