Các tiêu chuẩn hướng dẫn phântích mẫu thực phẩm Để xác Địnhlượng Độc tố nấm mốc aflatoxin 0

Nguyên tắc Phần mẫu thử được chiết bằng metanol và dung dịch natri bicacbonat 0,5 % trong nước 7001300, phần thẻ tích.. Dịch chiết được ly tâm và pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat nồ

TRUONG DAI HOC CONG NGHE SAI GON

KHOA CONG NGHE THUC PHAM

SAIGON TECHNOLOGY UNIVERSITY STU

BAO CAO

CAC TIEU CHUAN HUONG DAN PHAN

TICH MAU THUC PHAM DE XAC DINH

LUONG DOC TO NAM MOC

Ho va tén Mã số sinh viên

Muc luc

90/0157 .(:- 1 TCVN 12625:2019 occcccccccceceseevesssvesesessesesveresvesesssesssresesesreavsvsreavesesteseseesessatsseavsvsseavssesveeseees 2 THUC PHAM - XAC DINH HAM LUONG CAC AFLATOXIN B,, Bo, Gi, Gp,

AFLATOXIN TONG SO VA OCHRATOXIN A TRONG NHAN SAM VA GUNG - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CÓ LÀM SẠCH BẰNG COT AI LUC MIEN NHIEM 2

6.3 Tách bằng cột ái lực miễn NHIEM Looe ccccccccecscccescscsesevsescstsvevscsesevsesssesevsceseevevsvees 9

6.4 Phân tích sắc ký - T11 E1 E210 1212122121 HE 1n 1 ngu 10

8.3 Dung đường chuẩn 5s n2 1E 21211 111121121 HH1 1g n re 22

8.4 Định lượng afÏafoxim 0 221121111221 22 11125115 1121115111511 1501111 HT n HH kknnrykt 22

TCVN 10638:20l4 Q1 1n n HT 1H n g0 á ng KT kg kk HH xk CSKH k0 1kg 24

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXINN BI VÀ TÔNG AFLATOXIN

BI, B2, G1, G2 TRONG LẠC, QUÁ HỖ TRĂN, QUÁ VẢ VÀ BỘT ỚT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT VÀ LÀM SẠCH

BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM 5 c2 1 E211 1121 11 181gr 24

6.4 Lam sach bang Ot ai le MIEN NHIEM oe cc ccccccccecsescsscsesesececscesecstescsevsecsevseeees 32

6.5 Sac ky long hiéu nang cao (HPLC) cccccccccscsssescssessesvssessessestesvsvsevevscsevevseseeeeeees 33

6.7 Duong ChU an ce ceccecccccccescsscsseseesesscsvssessceessvsecsessvssesvesesevsreseseesavsusaeavevsusevevecseees 34 6.8 Quy trình thêm chuẩn 2-21 SE 12111111112 211 111111 1 E11 1 He re 34

7 Tính kết quả - - s1 1211121121111 1171111 1 1 1101221112111 1t n1 re 34

TA DO CHUM cc cccccceesssessnnsnnteccecccevsecessestttttaceeceeccecceccrsssesstttttttsseeeeesceeeeueenaa 35

7.2 DO Wap lai eee ccccceccecceescecsesssessessvessesssessesssessessissressssssesssssesssssessessssssesesesseseesesseses 35 TCVN 6685:2009 (ISO 14501:2007) cccceccccscsscessesssessesssessesssessesesessesssessesesessessressessseseseeses 41

SỮA VA SUA BOT ~ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN Mi - LAM SACH BANG SAC KY AILUC MIEN DICH VA XAC DINH BANG SAC KY LONG HIEU NANG

7 Cách tiến bana ceccccccccescescessessessessessessessessessessssessnssessssussesssssrearessessessesseseesesees 45 7.1 Chuẩn bị mẫu thử - 2-52 s2 2 921E22121211211212112121121121 21212101 ereg 45

7.2 Chuẩn bị cột sắc ký ái lực miễn dịch 5s s1 2111211211112 121 1E trrrree 46

7.3 Chiết và tính sạch mẫu thử 52: s2 EEE121711211212112121 21120210 Enn re 46

7.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao các n1 HH1 HH rung 47

8 Tính toán và biểu thị kết quả -2- + SE 112181121121211 1212111121 Err Hee 48

BL Sta cece ceccccccecccsseessessesssessesssessesssessesssessessssssesssessessusssessisssessiesseseesesansessevssessesesenees 48 8.2 BOt Sta cecceccceccecsesssessessvessssvessvssvessesvecsusssecersssessussvessvssssssisssesivsresiesseeessessesssseses 48

8.4 D6 Wap lai ce ccccceccecccessecsessssssesssessessvessessseseesssesressssssessesssessssssssesessasesesesseseesesenees 49 8.5 D6 tai LAP ccccceccccceessessesssessessvessessvessesssessessssssessssssessissssssessssssessssssesesssseseesesenees 49

9 Báo cáo thử nghiệm 2 0 1221122112211 151 115111 1111011511111 511 15 11111 gk nành kn 49

6.2 Làm sạch cột ai lực miễn nhiễm 22 2 TH TS T155 E TH HE TH Heo 57

6.3 Chuân bị dung dịch mẫu thử - 52 2E 1212112121111 2117111 1 11011 rryee 57 6.4 Quy trình thêm chuẩn - - 2 21s É 1218211111112 112111111 121101 111gr ai 58

7 Phân tích HPLC 2-52 E122EE215E11212112111221121221211211 1212111212121 ra 58 7.1 Điều kiện vận hành HPLC - 2 + S2E22E19E12E127152127171211117121110.1112 e6 58

7.2 Tạo dẫn xuất sau COt cccccccccccccccccccscscecscsvssvstevscsesescsssssesesssesessssseseseveresevevevevevsveeeevees 58

7.3 Chuân bị các dung địch hiệu chuân đối với HPLC - 25c SE E2 rxcx re 59

9 Báo cáo thử nghiệm 2 0 1221122112211 151 115111 1111011511111 511 15 11111 gk nành kn 61

TCVN 9126:201 - 5: 2S E2111211211121121112 1212 122 1 1212112112112 t ru 65 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH AFLATOXIN Bi 5 52 S22 tre 65

6.3 Làm sạch bằng ái lực miễn dịch ST n2 Eg 1151511215151 555 nen He 71 6.4 Tạo dẫn xuất sau cột ST T111 11 1151512151552 E HH HH HH HH HH ng 72

6.5 Dựng đường chuẩn 5s n2 121121211 1111212121 HH1 ng Hee 72

đi cece cceececcccccesceccccssnsecceseesesscececsssesseccssnssseceesnsssceeesssesaueseessceeeeeesenens 73

7.1 Quy trình thêm chuẩn (spiking) để xác định độ thu hồi -5-55 eee 74 7.2 Độ chụm - 1 2E 1211211 71x 11 T5 1 2t 1 1 HH HH HH 74 7.3 Độ lặp lại SH 22t H21 H2 t2 1212 212 12 tru 74 7.4 Độ tái lập SE H222 221212122212 2121121121 74

8 Báo cáo thử nghiệm 2 220 1211122112211 121 115111711511 15 11111150115 111k Hà nhện 75

TCVN 8350:20110 2-1 1211221211221 1222122122212 1211212 terere 77 THUY SAN VA SAN PHAM THUY SAN - XAC DINH HAM LUONG AFLATOXIN (PHƯƠNG PHÁP SẮC KỸ LỎNG HIỆU NĂNG CAO) 2c Hee 77

1.Phạm vi áp dụng 0 1012121211111 1 11221201111 251 1811111111120 1 11H HH KH ky 77

2.Nguyên tắC - ch TH HH1 n1 HH1 n1 ng g1 ng Hee 77

5 Tih ket qua ccccccccccsccscssesscsessesscssesscsvssesscsessvsscsscsvssesecsvssesevsrssnsevsussseavevsusesevevsvsesevavevees 80

5.1 Độ lặp lại c2 ng t2 t2 1 H2 t2 tt t2 112 12tr 81 5.2 D6 thu Od cecceccccccssessessessessessessessessesecssessessesssssessnesssesssstsssessesesseseeseeees 81

LOI MO DAU

Việt Nam là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ầm, tạo điều kiện thuận lợi cho nắm mốc sinh sôi và phát triển Trong số hàng ngàn loài nấm mốc khác nhau thì có khoảng 50 loài có hại cho con người và động vật Các loài này có thể được chia thành 2 loại: gây bệnh và gây ngộ độc

Độc tố do các loài nằm mốc tạo ra được goi chung la mycotoxin Cac déc tổ vi nắm

thường được phát hiện trong thực phẩm ở nước ta bao gồm có: Aflatoxin, Ochratoxin, Zearalenon, Fumonisin Theo khuyến cáo của tô chức Y tế thế giới (WHO), các quốc gia cần phải thực hiện phân tích nguy cơ đối với các độc tố vi nắm đề làm cơ sở khoa học cho việc hoạch định các chính sách quản lý

Hiện nay, các phương pháp chuân được sử dụng chỉ xác định được riêng từng độc tô vi nấm Nêu sử dụng các phương pháp này thì việc phân tích xác định mức độ nhiễm độc tổ vi nắm trong các mẫu trên trở nên khó khăn vì số lượng xét nghiệm quá lớn, thời gian và nguồn lực không đủ để đáp ứng Do vậy, cần có phương pháp để có thê xác định đồng thời hàm lươngk các độc tố trên cùng mẫu thực pham đề giải quyết yêu cầu của thực tiến Đề thực hiện các thí nghiệm một cách chính xác và an toàn thì nên tuân thủ theo những tiêu chuẩn Việt Nam

aflatoxin (AF) là chất gây ung thư trên người (nhóm 1A) và ochratoxin (OTA) là chất có khả năng gây ung thư trên người (nhóm 2B:1) Can mac quan áo bảo hộ, đeo găng tay và kính an

toàn tại mọi thời điểm và thực hiện các thao tác chuẩn bị chất chuân và mẫu thử trong tủ hút

Cần rửa sạch các vết AF và OTA bị đánh đồ bằng chất tay rửa và đề yên 10 min Sau khi lau vùng dung dịch rửa, lau tiếp với dung dich axeton 5 % trong nước Rửa tất cả dụng cụ thủy tinh bằng chất tây sau đó rửa tiếp bằng nước Metanol và axetonitril là các chất độc và

cần được thực hiện trong tủ hút Tất cả các giai đoạn phân tích cần được thực hiện trong tủ

hút Loại bỏ các dung môi thải theo các quy định về môi trường

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng các aflatoxin AFB¡, AFB¿, AFG, va AFG», aflatoxin tong s6 va ochratoxin A (OTA) trong nhân sâm và gừng dạng bột bang sac ky long có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm

Giới hạn định lượng của phương pháp đối với AFB¡, AFB;, AFG¡ và AFG; và aflatoxin tong

số là từ 2 ng/kg đến 16 ug/kg và đối với OTA là từ l ng/kg đến 8 ug/kg

2 Nguyên tắc

Phần mẫu thử được chiết bằng metanol và dung dịch natri bicacbonat 0,5 % trong nước (7001300, phần thẻ tích) Dịch chiết được ly tâm và pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat (nồng độ 0,1 M; pH 7,4) có chứa 1 % polysorbat 20, được lọc và làm sạch qua cột ái lực

miễn nhiễm có chứa kháng thể đặc hiệu của AF và OTA Sau khi làm sạch, các độc tô được

rửa giải ra khỏi cột bằng metanol và được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector huỳnh quang

3 Thuốc thử

Tat cả các thuốc thử được sử dụng phải là loại tỉnh khiết phân tích, nước được sử dụng

là nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác

- Metanol (CH:OH)

- Axetonitril (CH3CN)

- Axit axetic (CH;COOH)

- Natri clorua (NaCI)

- Mononatri phosphat (NazHPO)

- Dinatri hydro phosphat (NazHPO¡)

- Kali đihydro phosphat (KH;PO¡)

- Natri hydroxit (NaOH)

- Kali clorua (KCI)

- Dung dịch natri hydroxit, 2 M

Hòa tan 8 g NaOH trong 100 mÏÌ nước

- Dung dich mudi dém phosphat (PBS), pH 7,4

Hoa tan 8 g NaCl; 1,2 g NaxHPO,; 0,2 g KH2PO, va 0,2 g KCI trong | L nuéc Diéu chinh vé pH 7,4 bang dung dich natri hydroxit 2 M

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các đạng PBS sẵn có ở dạng thương mại, ví dụ PBS của Sigma (P-3813)

- Polysorbat 20, ví dụ Tween-20 của Sigma (P-5927) hoặc tương đương

- Dung dịch đệm phosphat (PB), 0,1M

Hoa tan 8,69 g NaxHPO, khan va 4,66 g NaH2PO, khan hoặc 5,36 g NaH2PO,.H20 vao

800 ml nước, điều chỉnh vé pH 7,4 bang dung dịch natri hydroxit 2 M, thêm 10 ml

polysorbat-20 và pha loãng đến 1 L

- Dung môi chiết, hỗn hợp metanol và natri bicacbonat 0,5 % (700+300, phan thẻ tích) Trộn và đề cân bằng về nhiệt độ phòng Chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng

- Dung dịch chuẩn AF

- Dung dịch chuẩn gốc của từng loại ÁF, 10 pg/ml

Cân 10 mg mỗi chất chuân AFB¡, AFB;, AFG¡, AFG; (ví dụ: Sigma A 6636, A 9887,

A 0138 và A 0263 hoặc tương đương) cho vào các bình định mức 100 mÏÌ riêng biệt Thêm

50 ml axetonitril, trộn, pha loãng đến vạch bằng axetonitril và trộn đều Hút 10 ml dung dịch

này vào bình định mức 100 ml khác và pha loãng đến vạch bằng axetonitril Đo phô UV của

mỗi dung dich aflatoxin

Xac dinh néng d6 cua dung dich aflatoxin, C, tinh bang microgam trén mililit (ug/ml), theo Céng thite (1):

\

:

Trong đó:

A: là độ hấp thụ đo được ở bước sóng có độ hấp thụ cực đại gan 360 nm

AI: là khôi lượng phân tử của Aflatoxin

ø: là hệ số hap thy mol (xem Bang 1)

Bang 1 - Khối lượng phân tử và hệ số hấp thụ mol của các aflatoxin

Nong d6 cua aflatoxin phai xap xi 10 pg/ml

- Dung dịch chuẩn AE trung gian, 400 ng/ml (hỗn hợp của AFB, AFB, AFG,, AFG) 6

nồng độ lần lượt 200, 50, 100 và 50 ng/m])

Thêm một lượng tương ứng thích hợp của các dung địch chuân gốc vào bình định mức

và pha loãng đến vạch bằng axetonitril

Dùng dung dịch chuẩn AF trung gian 400 ng/ml làm dung dịch thêm chuẩn trong nghiên cứu độ thu hồi Bảo quản các dung dịch chuẩn gốc ở âm 18 °C Đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

- Dung dịch AF chuẩn làm việc

Chuan bị sáu dung dịch chuẩn làm việc trong bình định mức I0 mÏ theo Bảng 2 Pha

loãng với hỗn hợp metanol - nước (1+1, phần thê tích) Bảo quản trong tủ lạnh và đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc trong ngày sử dụng Bảng 2 - Chuẩn bị các dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc

- Dung dich chuẩn OTA

Dung dịch chuẩn gốc OTA, 30 ug/ml

Cân 10 mg chất chuân OTA (ví dụ: Sigma 01877 hoặc tương đương) vào bình định

mức 100 mÏÌ Thêm 50 mÏ metanol, trộn, pha loãng với metanol đến vạch và trộn đều

Lay 1 ml dung dich OTA 100 ug/ml vừa chuẩn bị, cho vào bình định mức 3 mĨ và pha

loãng đến vạch bằng metanol Xác định độ hấp thụ ở 333 nm Sử dụng hệ số hấp thụ mol là

6 330 để tính nồng độ tương tự Nồng độ của dung dịch phải xấp xi 30 ug/ml Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở -L8 °C Đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

Dung dịch chuẩn OTA trung gian, 200 ng/ml

Thêm một lượng thích hợp dung địch chuẩn gốc OTA vào bình định mức 25 mÍ và pha

loãng đến vạch với metanol

Dung dịch chuẩn OTA làm việc

Chuan bi 6 dung dịch chuẩn làm việc trong bình định mức 10 ml theo Bảng 3 Pha

loãng với metanol- nước (I + I, phần thể tích) Bảo quản trong tủ lạnh và đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Chuẩn bị dung địch chuẩn làm việc trong ngày sử dụng

Bảng 3 - Chuẩn bị dung dịch ochratoxin A chuẩn làm việc

- Pha động của AE cho dẫn xuất sau cột với bộ PHRED

Hỗn hợp nước - metanol - axetonitril (600+250+150, phan thé tich) Dang dong, toc độ 0,8 ml/min

- Pha động của AE cho dẫn xuất sau cột với bộ Kobra

Pha I L hỗn hợp gồm nước - metanol - axetonitril voi 350 pl dung dich axit nitric 4 M

(nồng độ axil nitric đặc là 15,9 M) và 120 mg kali bromua, trộn đều Đăng dòng, tốc độ 0,8

ml/min

- Pha dong cia OTA

Axefonitril - nước - axit axetic (500+500+10, phan thé tich) Dang dong, téc dé 1,0

ml/min

4, Thiét bi, dung cu

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Máy lắc ngang, có thẻ lắc đến 400 rímin, ví dụ sử dụng loại VWR DS-500E (VWR

International, Bridgeport, NJ, Hoa Ky) hoac tuong duong

- Ống ly tâm bằng nhựa polypropylen, dung tích 50 ml

- Máy ly tâm, ví dụ: loại Allegra X-22R (VWR International) hoặc tương đương

- Giấy lọc vi sợi thủy tỉnh, ví dụ: loại Whatman số 934AH, 11 cm (Whatman, Inc., Clifton, NJ) hoặc tương đương

- Cột ái lực miễn nhiễm, ví dụ cột AflaOchraTest (G1017: Vicam, Watertown, MA) hoặc tương đương

Cột ái lực miễn nhiễm AF/OTA có chứa các kháng thể đơn dòng liên kết được với aflatoxin Bị, B;, G¡, G› và các kháng thể đơn dòng liên kết được với OTA Các cột ái lực miễn nhiễm cần có dung lượng tối thiêu không nhỏ hơn 100 ng đối với aflatoxin tông số và

100 ng đối với OTA và cần cho độ thu hồi của aflatoxin Bị, B;, G¡, G¿ và OTA không nhỏ

hơn 80 % khi thêm 5 ng của mỗi độc tô vi nắm vào 10 ml dung địch metanol 10 % (thê tích) trong PBS Các cột cần có hạn sử dụng là 18 tháng ở 4 °C và 12 tháng ở nhiệt độ phòng

- Phễu cột băng polypropylen, có dung tích 50 ml với đầu gắn vào cột hoặc bơm thủy tỉnh

25 ml có đầu gắn với cột, hoặc tương đương

- Giá cột, ví dụ Vicam G1 104 có 12 vị trí hoặc tương đương

- Hệ thống LC, hé thong Waters 2690 Alliance Separation (Waters, Milford, MA), voi detector huỳnh quang Waters 2475 hoặc các hệ thông LC tương đương

Điều kiện phân tích như đưới đây cho thấy thích hợp:

Bảng 4 - Điều kiện phân tích cac aflatoxin va ochratoxin A

Biopharm Inc., Marshall, MI hoặc tương đương)

CHÚ THÍCH: Đặt dòng điện ở 100 A, không bật điện trước khi bơm LC hoạt động để

tránh quá nhiệt

- Bình định mức, dung tich 3 ml, 10 ml, 25 ml va 100 ml

- Ong dong, dung tich 25 ml

- Can phan tich, co thé can chinh xac dén 0,1 mg

- May lac xoay

5 Lay mau

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyên

6 Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu sơ bộ

Mẫu được xay nhỏ, trộn đều Nên xay lượng mẫu đủ lớn (tối thiểu 0,5 kg) đê đảm bảo tính đồng nhất

6.2 Chiết

Cân 5 g mẫu thử vào ống ly tâm 50 ml Thêm | g NaCl va 25 ml dung mdi chiét Lac

bang may lắc xoáy đến khi mẫu và dung môi được trộn đều Sau đó, lắc bằng máy lắc ngang

với tốc độ 400 r/min trong 10 min Ly tém trong 10 min & tốc độ 7 000 r/min hoặc ở tốc độ

có thê thu được cặn chắc Hút ngay 7 ml cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm 28 ml dung dịch

PB 0,1 M, lac va loc qua giấy lọc vi sợi thủy tính Thu lấy 25 mI dịch lọc (tương đương với

1 g mẫu thử) vào ông đong 25 ml và thực hiện ngay sắc ký ái lực miễn nhiễm (IAC) 6.3 Tách bằng cột ái lực miễn nhiễm

Ôn định cột ái lực miễn nhiễm ở nhiệt độ phòng ít nhất 15 min trước khi sử dụng

Tháo nắp đầu cột và nồi với phễu Tháo nắp cuối cột và nối với bộ hứng (phần nối phải chặt) Đề chất lỏng trong cột chảy qua đến khi còn khoảng 2 mm đến 3 mm phía trên lớp

nhỏi cột Cho 25 ml dịch lọc vào phéu Dé địch lọc tự chảy qua cột đến khi cót khô Để quá

trình chảy qua cột đễ dàng, cần bỏ cột ra, thêm khoảng 2 ml dung dịch PBS 10 mM vào cột,

9

gan lai phéu, rtra cét voi 3 ml dung dich PBS 10 mM nita va sau do rtra voi 5 ml nude (co

thé cho 5 ml dung dịch PBS 10 mM trực tiếp vào phéu néu dùng kỹ thuật khác để loại bỏ bọt

khí ở đầu cột cho dòng chảy dé đàng) Đề cột khô, sau đó đây 3 ml không khí qua cột bang kim tiêm Đặt bình định mức 3 ml phía đưới cột Rửa giải va thu lay AF, OTA vào bình 3 ml

với | ml metanol loai ding cho HPLC Dé cét chay tu do đến khô Đề yén | min và rửa giải thêm với | ml metanol, sau đó thu dịch vào cùng bình định mức trên Để cột chảy đến khô

vá đây 10 ml không khí qua cột Pha loãng dịch rửa giải đến thể tích bằng nước và phân tích

AF ngay bằng LC Sau đó phân tích OTA bằng LC

hoặc Kobra, AFG, va AFB, duoc dan xuat tao thanh AFG (dan xuất của AFGi) và

AFB;, (dẫn xuất của AFB,) Cầu trúc hóa học của các dẫn xuất do quá trình brom hóa điện hóa và quá trình quang hóa là khác nhau Thời gian lưu của AFG;, AFG›,, AFB; và AFB›; từ

14 mm đến 27 min nếu dùng bộ PHRED và thời gian lưu ngắn hơn nều dùng bộ Kobra Cac píc cần phân giải khỏi nhau đến đường nên

Dựng đường chuẩn cho từng aflatoxin theo điện tích pic (trục Y) của mỗi độc tổ (từng AF) so với nỗng độ (trục X, tính bằng ng/ml), sử dụng các dung dịch chuẩn aflatoxin làm việc Đường chuân được dựng trước khi phân tích trên mẫu thử, sau đó kiêm tra lại độ tuyến tính Nếu các tín hiệu điện tích nằm ngoài (cao hơn) dải hiệu chuẩn thì pha loãng địch chiết

đã làm sạch với hỗn hợp metanol- nước (1 + 1, phan thê tích) và bơm lại vào cột LC

6.4.2 Phân tích ochratoxin

Bơm 50 ul mẫu trắng thuốc thử (dung dịch hiệu chuẩn 1), các dung dịch chuân làm

việc hoặc mẫu thử vào cột LC Xác định píc OTA trong dịch chiết mẫu bằng cách so sánh

thời gian lưu với chất chuân OTA rửa giải từ 10 min đến II min Có 1 píc nhỏ trước pic OTA khoang 0,5 min trong nhân sâm

Dung đường chuẩn từ các dung dịch chuẩn OTA làm việc theo điện tích pIc (trục Y)

của OTA so với nồng độ (trục X, tính bằng ng/ml) Đường chuẩn được dựng trước khi phân

tích mẫu thử, sau đó kiểm tra lại độ tuyến tính Nếu các tín hiệu diện tích nằm ngoài (cao hơn) dải hiệu chuẩn thì thực hiện pha loãng dịch chiết đã làm sạch với metanol-nước (+1, phan thé tich) va bom lai vao cét LC

10

6.4.3 Định lượng các aflatoxin và ochrafoxin

Định lượng AF và OTA bằng cách đo các diện tích tại thời gian lưu của từng AF và OTA và so sánh với thời gian lưu của đường chuẩn tương ứng

R: là diện tích píc thu được từ dung dich mẫu thử

S: và a tương ứng là độ đốc và hệ số chặn của các đường chuẩn đã dựng

Ƒ: là thể tích cuối của dung địch mẫu thử, tính bằng mililit (ml)

E: là hệ số pha loãng # = 1 khi ý = 3 ml

WỨ: là khối lượng mẫu thử cho qua cột ái lực miễn nhiễm (1 g)

Ham lượng AF tổng số là tông của các hàm lượng AF Go, Gi, Bo va Bi

8 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây

a) mọi thông tin cần thiết đề nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết:

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

đ) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bắt thường có thê ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được

Phu luc A (Tham khao) Kết quả thử nghiệm liên phòng

II

Bang A.1 - Két qua thir nghiém lién phong thir nghiém déi véi cac aflatoxin va ochratoxin A trong mau bot nhan sam bang sac ky long c6 lam sach bang cột ái lực

mién nhiém

AF| 16 | 11,27] 71 10,49] 2,29 | 4,31 |20,29]0,65]2,48] 0,92 | 10 1 OT] 8 | 699 | 87 |0,25| 0,63 | 3,56 | 8,99 10,2711,54] 0.41] 11 0

s, la d6 1éch chuan lặp lại;

sp la độ lệch chuân tái lập:

RSD, là độ lệch chuân tương đối lặp lại:

RSD¿ là độ lệch chuẩn tương đối tái lập:

° được tính dựa trên độ lệch chuẩn ước định của 0,22c

CHÚ THÍCH: Mẫu trắng được thấy có chứa < 0 1 pg/kg AF va OTA

® AF =aflatoxin (tông của AFB¡ AFB; AFG¡ AFG;¿); OTA = ochratoxin A

Độc tố|Nồng eee a one hah ®" Is, tse, HIRSD,,|RSDa| Hor| 0,22) Hor hag, shiz ° kết ÍT hồi Số phòng |Số phò

21 J9 HR/PIRNI HTMPEIv/kglg/kgÍ % |,% |Rat] c |Rap|PPVPEPWI €0 se

% AFB.L L | 0,88 | 88 [0,06]0,07| 6,39 | 7,71 ]0,17]0,19]0,35] 10 1 AFB, | 0,25 | 0,22 | 90 |o.02|0,02{ 7.55 | 7.94 |0.14|0.05|0.36| 10 1 AFG,| 0.5 | 0,41 | 82 |0,03]0,09] 6,46 |21,80]0,42]0,09]0,99] 11 0 AFG] 0,25 | 0.22 | 86 |0,01]0,03] 4,79 |12,30]0,22]0,05]0,56] 10 1

14

AF 16 | 12,85 | 80 0,29 ]0,74 | 2,22 | 5,74 |0.19 2.53 |0.26 2 2 2 2 2 9

OTA] 8 9,02 | 113 |0,46]0,93] 5,15 ]10,31]0,32]1,99]0,47 2 2 2 2 10

P AF = aflatoxin (t6ng cla AFB; AFB) AFG, AFG); OTA = ochratoxin A

° được tính dựa trên độ lệch chuẩn ước định của 0,22c

P NC - Nhiễm tự nhiên

NA - Không áp dụng

s, là độ lệch chuân lặp lại;

sx là độ lệch chuân tái lập;

RSD, là độ lệch chuẩn lương đối lặp lại:

IRSDx là độ lệch chuân tương đôi tái lập;

CHÚ THÍCH: Mẫu trắng được thấy có chứa < 0.1 ng/kg AF và OTA

16

TCVN 11516:2016

DAU THUC VAT - XAC DINH HAM LUOQNG AFLATOXIN TONG SO VA CAC

AFLATOXIN B1, B2, G1, G2 - PHUONG PHAP SAC KY LONG CO LAM SẠCH

BANG COT AI LUC MIEN NHIEM

CANH BAO - Khi ap dung tiéu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu và các thao tác

nguy hiểm Tiêu chuẩn này không đề cập đến tat cả các vấn đề về an toàn có liên quan trong việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thực hành liên quan đến sức khỏe và an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử đụng tiêu chuẩn

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin tổng số (AF: tổng của AFB¡, AFBa, AFG; và AFG?›) và các aflatoxm Bị, Bạ, G¡, G› trong dầu thực vật Phương pháp này đã được đánh giá liên phòng trên đầu ôliu, dau lac va dau vig voi giới hạn xác định của AF là 2 ug/kg đến 20 wg/kg va giới hạn xác định của AFB; là 1 ug/kg đến 10 ug/kg trong nền mẫu

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dân sau rât cân thiết cho việc áp dụng tiêu chuân này Đôi với các tài

liệu viện dân ghi năm công bô thì áp dụng phiên bản được nêu Đôi với các tài liệu viện dân không ghi năm công bô thì áp dụng phiên bản mới nhật, bao gôm cả các sửa đôi, bô sung (nêu có)

TCVN 485I (ISO 3696) Nước dùng đề phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu câu kỹ

thuật và phương pháp thủ

3 Nguyên tắc

Phần mẫu thử được chiết bằng hỗn hợp metanol và nước (55:45, phần thê tích) Sau khi lắc và ly tâm, mẫu chiết được lọc, pha loãng bằng nước và cho vào cột ái lực (LAC) chứa các kháng thê đặc hiệu đối với aflatoxin Sau khi rửa bằng hỗn hợp metanol và nước (10:90, phân thê tích), aflatoxin được rửa giải khỏi cột bằng metanol và xác định bằng sắc ký lỏng

có detector huỳnh quang (LC-FLD) Đối với dẫn xuất sau cột aflatoxin, sử dụng thiết bị dẫn xuất quang hóa hoặc cuvet Kobra

4 Thuốc thử

Chi sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác

17

- Nuc, theo loai | cua TCVN 4851 (ISO 3696)

- Dung môi metanol và axetonitril, loại dùng cho sắc ký

CANH BAO - Metanol va axetonitril 1a cac chất độc, cần phải tiến hành rót trong tủ hút

- Dung môi chiết, hỗn hợp metanol và nước (55:45, phần thé tích), dạng hỗn hợp, cân bằng đến nhiệt độ phòng

- Dung dịch rửa, hỗn hợp metanol và nước (10:90, phần thể tích), dạng hỗn hợp, cân bằng đến nhiệt độ phòng

- Aflatoxin, chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc của bốn aflatoxin & 10 ug/ml trong axetonitril CANH BAO - Co quan nghiên cứu ung thư quốc tế (LARC) đã phân loại aflatoxin là chất gây ung thư cho người (nhóm IA:1) Phải mặc quần áo bảo hộ, găng tay và kính an toàn vào

mọi lúc và phải tiễn hành tất cả các giai đoạn chuẩn bị mẫu và chuẩn bị các chuẩn trong tủ

hút Làm sạch các vién aflatoxin bang dung dich tay trang da pha loãng (độ pha loãng 1:10)

và để yên trong 10 min Sau khi lau hết dung dịch tẩy trắng, lau bằng axeton loãng 5 % Tráng tat cả các dụng cụ thủy tinh bang dung dich tay trăng đã pha loãng trước khi rửa Quá trình phân tích phải được tiễn hành trong tủ hút Thái bỏ các dưng môi rửa giải phù hợp với quy định về môi trường

Chuẩn bị từng dung dịch chuẩn gốc aflatoxin 10 ug/ml

Cân 10 mg mỗi aflatoxin cho vào các bình định mirc 100 ml riéng ré Thém 50 ml axefonitril, trộn, thêm tiếp axefonitril đến vạch và trộn lại Dùng pipct lấy 10 ml đung dịch

này cho vào các bình định mức 100 ml khác, thêm axetonitril đến vạch và trộn Ghi lại phổ

UV của từng dung dich aflatoxin

Xác định nồng độ của dung địch aflatoxin, tính bằng ug/ml, bằng cách đo độ hấp thụ (A) ở bước sóng xác hấp thụ tối đa ở khoảng 360 nm và sử đụng Công thức:

Nông độ của đung dịch aflatoxin phải xấp xi 10 ug/ml

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc aflatoxin thứ hai 400 ng/ml (hén hợp của AFBi, AFB», AFG), va AFG) & néng dé tuong ung 200 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml va 50 ng/ml)

18

Cho một lượng thích hợp từng chuẩn gốc aflatoxin vào cùng một bình định mức va pha loãng bằng axetonitrol đến vạch Sử dụng dung địch chuân gốc thử hai 400 ng/ml làm dung

dịch thêm chuân đề tính độ thu hồi Bảo quản dung địch chuân gốc ở nhiệt độ - 18 °C Cân

bằng đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn làm việc aflatoxin

Hàng ngày chuẩn bị sáu dung dịch hiệu chuẩn vào bình định mức 5 ml riêng rẽ theo

Bang I Pha loãng bằng hỗn hợp metanol và nước (1:1, phần thể tích) Bảo quản trong tủ lạnh và cân bằng đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn làm việc hàng ngày

Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn làm việc aflatoxin

- Pha dong, dang dong, toc dé dong 0,8 ml/min

Đối với dẫn xuất sau cột aflatoxin có cuvet PHRED hoặc dụng cụ UVE, sử dụng hỗn hợp metanol-axetonitril-nước (25:17:60, phần thê tích)

Đối với dẫn xuất sau cột aflatoxin có cuvet Kobra, sử dụng I lít hỗn hợp metanol- axetonitril- nước (25:17:60, phần thê tích), 350 wl dung dich axit nitric 4 M (nồng độ của axit nitric dac la 15,9 M) va 120 mg kali bromua, tron ky

- Natri clorua

- Dung môi muối đệm phosphat (PBS)

19

- May Lic, co kha nang lac 400 r/min

- Ống ly tâm, làm bằng polypropylen, dung tich 50 ml, có nắp vặn kín

- Máy ly tâm

- Giấy lọc, gấp nếp, hạng 597 1⁄2, 185 mm hoặc loại tương đương

- Giấy lọc sợi bông thủy tỉnh, Whatman 934-AH, GF/B tròn, 90 mm hoặc loại tương đương

- Cột ái lực miễn nhiễm (LAC), cột [AC chứa kháng thê đơn đòng phản ứng chéo với AFBi,

AFB;, AFGi, và AFG; Cột phải có khả năng liên kết tối thiểu không nhỏ hơn 100 ng aflatoxin tông số và có độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % đối với AFB¿, AFB;, AFGi, và

AFG;, khi một đung địch chuẩn trong 10 ml hỗn hợp metanol và dụng môi PBS (£ỷ lệ 10:90, phan thê tích) thì có chứa 5 ng aflatoxin riêng rẽ

Cột có hạn sử dụng 18 thang khi được bảo quản ở 4 °C hoặc 12 tháng khi được bảo quản

ở nhiệt độ phòng

- Cật phần phối, ví đụ: cột VICAM GI194; bơm tĩnh 12-vỊ trí, hoặc loại tương đương

- Hệ thống sắc ký lỏng, có điều kiện vận hành như sau:

Tốc độ dòng: 0,8 ml/min

Detector: cài đặt ở bước sóng kích thích là 362 nm và bước sóng phát xạ là 440 nm

Cột: cỡ hạt nhồi 3 um, đài 150 mm, đường kính trong 4,6 mm

- Hệ thống dẫn xuất sau cột đối với aflatoxin

Thiết bị tạo dẫn xuất sau cột, dẫn xuất sau cột quang hóa của aflatoxin trong vòng phản

ứng đặc biệt bằng tia UV, thê tích phản ứng chuẩn là I,0 ml

- Cuyet PHRED (cuvet dẫn xuất quang hóa sau cột)

CANH BAO - Tránh sự phơi nhiễm ánh sáng của tia UV

- Cuvet Kobra, cuvet điện hóa, cuvet dẫn xuất brom hóa sau cột

20

CANH BAO - Cai dat & 100 pA Khéng duge bat cuvet cho dén khi van hanh bom LC dé

tranh mang cuvet bi qua nhiét

- Ống ly tâm, dung tich 50 ml

- May tron Vortex

- Ong dong chia độ, dung tich 25 ml

Can 5,0 g phần mẫu thử cho vào ống ly tâm 50 ml Thêm 1,0 g NaCI và 25 ml dung

môi chiết Đồng hóa hỗn hợp trong máy trộn Vortex cho đến khi đồng nhất Lắc trong máy lắc ở téc d6 400 r/min trong 10 min Ly tam & 7000 r/min (g = 5323 mm/s”) trong 10 min Hút và loại bỏ lớp dầu phía trên Cho lớp metanol lỏng phía dưới qua giấy lọc gấp nếp Dùng

ống chia d6 25 ml lay 15 ml dich loc va dua vao éng ly tam 50 ml Thêm 30 mÏ nước, trộn

và lọc qua giấy lọc sợi bông thủy tinh Thu lấy 30 ml địch lọc (tương đương với 2 g mẫu thử) cho vào ống ly tâm 50 ml và tiền hành chạy ngay sắc ký AC

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng lọ đã silan hóa để bảo quản các dung dịch chuẩn gốc aflatoxin Tất cả các dụng cụ thủy tinh khác sử dụng không được silan hóa

8 Cách tiến hành

8.1 Làm sạch bằng cột miễn nhiễm

Sau khi lấy ra từ nhiệt độ bảo quản 4 °C, cột miễn nhiễm được cân bằng đến nhiệt độ

phòng ít nhất 15 min trước khi sử dụng Bỏ nắp đậy cột và nối với bề thu nhận của cột phân phối Tháo nắp đưới cột và dé chất lỏng trong cột chảy qua cho đến khi chất lỏng đạt mức 2

mm trên bề mặt cột Thêm 30 ml dich loc vao bau thu nhận Để dịch lọc tự chảy qua cột

miễn nhiễm cho đến khi chất lỏng đạt mức 2 mm trên bề mặt cột Thêm 10 ml dung dich rửa

vào bầu thu nhận Đề cột chảy đến khô và sau đó dùng xyranh thôi 10 ml không khí qua cột Đặt bình định mức 2 ml đưới cột Rửa giải tiếp bằng 0,6 ml metanol và thu lay aflatoxin vao bình định mức 2 ml, đề chảy nhỏ giọt, chảy đến khô Rửa giải bằng 0,6 mÍ metanol và thu

21

lay dịch rửa giải vào cùng bình định mức Đề cột chảy đến khô và théi 10 ml khong khi qua cột Pha loãng địch rửa giải bằng nước đến vạch và tiền hành phân tích sắc ký lỏng

8.2 Phan tích sắc ký lỏng

Bơm 50 ul thuốc thử trắng (hiệu chính 1), chuẩn làm việc aflatoxin hoặc mẫu thử lên cột sắc ký lỏng Nhận diện pic aflatoxin trong mẫu thử bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của chuẩn Rửa giải aflatoxin theo trinh ty G2, Gi, Bo, va By Sau khi

cho qua thiết bi dẫn xuất sau cột, cuvet PHRED hoặc cuvet Kobra, aflatoxin G¡ và aflatoxin

Bị được dẫn xuất thành Gạa (dẫn xuất của G¡) và B;a (dẫn xuất của Bị) Thời gian lưu của aflatoxin G2, Goa, Bo, va Bra trong khoang tir 11 min dén 21 min, str dung cuvet PHRED CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng cuvet Kobra thì thời gian lưu sẽ ngắn hơn

8.3 Dựng đường chuẩn

Các pic phải được nhận biết rõ trên đường nền Dựng đường chuẩn của từng aflatoxin Dựng đồ thị diện tích pic (độ đáp ứng, trục Y) của từng aflatoxin chuân so với nồng độ (ng/ml, trục X) và xác định độ dốc (S) và điểm giao với trục Y (hệ số chặn đ)

8.4 Dinh long aflatoxin

Xác định nồng độ của từng aflatoxin trong dung dịch thử từ đường chuẩn, sử dụng

dung dịch hiệu chuẩn làm việc chứa bốn aflatoxin Các dung dịch này nằm trong dai ttr 0,4

ng/ml dén 10,0 na/ml déi véi aflatoxin By; 0,1 ng/ml dén 2,5 ng/ml d6i voi aflatoxin Bo, 0,2 ng/ml dén 5,0 ng/ml d6i voi aflatoxin G, va 0,1 ng/ml dén 2,5 ng/ml déi véi aflatoxin Go Dựng đường chuân trước khi phân tích theo Bảng I và kiểm tra độ tuyến tính Nếu điện tích phần thử phản ứng nằm ngoài (cao hơn) dải hiệu chuân thì mẫu chiết đã tinh sạch phải được pha loãng bằng hỗn hợp metanol và nước (50:50, phân thê tích) va bơm lại lên cột sắc

Trong do:

R: diện tích pie của dung dich thử

a: điểm giao của đồ thị với trục Y

%: độ dốc của đồ thị

V: thé tích cuối cing cua dung dich thir duoc bom, tinh bang mililit (ml)

F: hé số pha loãng (# = I khi ƒ= 2 ml)

WỮ: khôi lượng mẫu thử cho qua cột miễn nhiễm (J = 2 g)

9,2 Tính hàm lượng aflatoxin tông số

Hàm lượng aflatoxin tông số là tổng của các aflatoxin Bị, B;, G¡ và Go

23

TCVN 10638:2014

THUC PHAM - XAC BINH HAM LUONG AFLATOXIN B1 VA TONG

AFLATOXIN BI, B2, G1, G2 TRONG LAC, QUA HO TRAN, QUA VA VA BOT OT -

PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO CO TAO DAN XUAT SAU

COT VA LAM SACH BANG COT AI LUC MIEN NHIEM

CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thê liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuân này không thể đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuân này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuân

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng để xác định các aflatoxin Bị, B;, G¡ và G; trong quả vả, quả hỗ trăn, quả lạc và bột ớt Giới hạn định lượng của phương pháp là 0,8 ng/g đối với từng loại

aflatoxin hoac tét hơn (các giá trị nhận được từ nghiên cứu liên phòng và nội phòng

thí nghiệm), tùy thuộc vào thiết bị sử dụng

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn nay Đối với các tài

liệu viện dẫn ghi năm công bồ thì áp đụng phiên bản được nêu Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bồ thì áp đụng phiên bản mới nhất, bao gồm cá các sửa đôi, bô sung (nêu có)

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thứ

3 Nguyên tắc

Phân mẫu thử được chiết bằng dung môi (metanol/nước) hoặc dung môi có thêm hexan (hoặc xyclohexan) Dịch chiết mẫu được lọc, pha loãng với dung địch nước muối đệm

phosphat (PBS) rồi đưa lên cột ái lực miễn nhiễm (LAC) chứa các kháng thê đặc hiệu đối với

timg loai aflatoxin By, Bo, G; va G2 Các aflatoxin được rửa giải ra khỏi cột ái lực miễn nhiễm bằng metanol Định lượng các aflatoxin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP- HPLC) có tạo dẫn xuất sau cột (PCD) bằng brom hóa sau đó bằng detector huỳnh quang Cũng có thể tạo dẫn xuất sau cột bằng brom được tổng hợp bằng phương pháp điện hóa hoặc bằng pyridini hydrobromua perbromua (PBPB)

24

4 Thuốc thử

Yêu cầu chung: Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) trừ khi có quy định khác

- Dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS)

Hòa tan 0,20 g kali clorua, 0,20 g kali dihydro phosphat, 1,16 g dinatri hydro ortophosphat (hoặc 2,92 ø hydrophosphat ngậm 12 phân tử H;O) và 8,00 g natrI clorua trong

0,9 lít nước Sau khi hòa tan, chỉnh pH đến 7,4 bằng HCI (0,1 mol/1) hoặc NaOH (0,1 mol/l)

- Axetonitril, loại dùng cho HPLC

- Metanol, loại dùng cho HPLC

- Metanol, loại kỹ thuật

- Toluen

- Hỗn hợp dung môi metanol và nước: Trộn 8 thẻ tích metanol với 2 thê tích nước

- n-Hexan, xyclohexan, loại kỹ thuật

- Axit nitric, cCHNO3) = 4 mol/l

- Cột ái lực miễn nhiễm

Cột ái lực chứa các kháng thể có thể hấp thu các aflatoxin Bị, B;, G¡ và G¿ Cột có khả

năng tách tối đa không nhỏ hơn 100 ng và có độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % đối với các

afatoxm Bị, B›, G¡và không nhỏ hơn 60 % đối với aflatoxin G; khi sử dụng dung dịch

chuẩn nước (10 % metanol) chứa 5 ng mỗi loại độc tô Nong độ dung môi tôi đa của các dung dịch đưa lên cột không được quá L2 % metanol

- Dung môi pha động HPLC (A), sử dụng với PBPB

Trộn 6 thê tích nước với 2 thê tích axetonitril và 3 thê tích metanol Khử khí của dung dịch trước khi sử dụng Pha động không được chứa hạt và phải được lọc trước khi sử dụng

25

- Dung môi pha động HPLC (B), sử dụng với brom được tổng hợp bằng phương pháp điện hóa

Trộn 6 thê tích nước với 2 thể tích axetonitril và 3 thé tích metanol Thêm 120 mg kali

bromua và 350 HỈ axit nitric trên lít pha động Khử khí của dung dịch trước khi sử dụng

- Thuốc thử sau cột

Hoa tan 50 mg PBPB trong 1 lít nước Dung dịch này có thê sử đụng trong 4 ngày nếu được bảo quản ở nhiệt độ phòng đề ở nơi tối

- Hỗn hợp toluen và axetonitril: Trộn 98 thé tích toluen với 2 thê tích axetonitril

hoặc ở dạng dung địch aflatoxin ban san trên thị trường

CANH BAO 1: Cac quy trình khử nhiễm đối với chất thai aflatoxin phong thử nghiệm do Cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung thư (IRAC) [1], [2] xây dựng

CANH BAO 2: Cac aflatoxin dé bi phan hủy bởi ánh sáng Nơi phân tích aflatoxim trong phòng thử nghiệm phải tránh ánh sáng ban ngày Có thể sử dụng màng mỏng hấp thụ tia cực tím (UV) đề che các cửa số kết hợp với ánh sáng địu (không phải ánh sáng trực tiếp mặt trời) hoặc dùng rèm cửa hoặc mành che kết hợp với ánh sáng nhân tạo (có thê sử đụng đèn ống huỳnh quang)

Bảo vệ các dung dịch chứa aflatoxin càng tránh ánh sáng càng tốt (giữ ở nơi tối, sử dụng màng nhôm hoặc thủy tinh màu hỗ phách) và bảo quản ở nhiệt độ theo khuyến cáo của

nhà sản xuất (vi du - 18 °C)

- Dung dich gốc aflatoxin

Hòa tan từng aflatoxin Bị, Bạ, G¡ị và G; trong hỗn hợp toluen và axetonitril để thu được các dung dịch có nỗng độ 10 ng/ml đối với từng loại aflatoxin Bọc các bình kín trong màng

nhôm và bảo quản ở nhiệt độ nho hon 4 °C

Để xác định nồng độ chính xác các aflatoxin trong từng dung dịch góc, ghi lại đường hấp thụ của các dung địch ở bước sóng từ 330 nm đến 370 nm trong cuvet thủy tính thạch anh | cm cia may đo phô, dùng hỗn hợp toluen và axetonitril trong cuvet so sánh Tính nồng

độ khối lượng của từng aflatoxin, ø¡, bằng microgam trên mililit, sử dụng công thức:

— AwxxM,100

a z,xd

Trong đó:

26

Amax: 46 hap thụ xác định được ở điểm hấp thụ cực đại trên đường hấp thụ;

A4: khối lượng phân tử của từng aflatoxin, tính bằng gam trén mol (g/mol);

ø¡: khả năng hấp thụ phân tử của từng aflatoxin trong hỗn hợp của toluen và axeftonitril, tính

bằng mét vuông trên mol (m°/mol);

đ: chiều đài đường quang của cuvct, tinh bang xentimet (cm)

M, va & cha aflatoxin Bi, B2, Gi va Go duge néu trong Bang 1

Bảng 1 - Khối lượng phân tử và độ hấp thụ phân tử của các aflatoxin Bị, B;, G¡ và G; [trong hỗn hợp của toluen và axetonitril]

Dùng pipet lấy chính xác 2,0 m1 dung địch này cho vào bình định mức 20 ml đã hiệu chuẩn, thêm hỗn hợp toluen và axetonitril đến vạch, trộn kỹ để thu được dung dich gốc aflatoxin hỗn hợp đã pha loãng chứa nồng độ aflatoxin B¡ và G¡ 100 ng/ml, aflatoxin B; và G; 20 ngml

Bọc kín bình trong màng nhôm và bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn 4 °C Trước khi sử

dụng, không mở bình cho đến khi lượng chứa trong bình đạt đến nhiệt độ phòng đề tránh hấp thụ nước đo ngưng tụ

- Dung dịch chuẩn aflatoxin hỗn hợp

Dùng pipet lấy các thê tích nêu trong Bảng 2 dung dịch gốc aflatoxin hỗn hợp đã pha loãng chứa 100 ng/ml aflatoximn Bị và G¡, 20 ng/m]l aflatoxim B; và G¿ cho vào một dãy các

27

bình định mức 10 ml Làm bay hoi dung dich toluen/axetonitril đến khô bằng dòng khí

nitơ ở nhiệt độ phòng Thêm 4 ml metanol vào từng bình để các aflatoxin hòa tan, thêm nước đến 10 ml và lắc kỹ

Khi trộn metanol và nước dễ bị ngót thể tích, vì vậy điều chỉnh lại thể tích đến thê tích

quy định

Bảng 2 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn aflatoxin hỗn hợp

Lấy từ dung dịch Nông độ khôi lượng của dung dich chuan

Dung dịch gốc đã pha loãng (ng/ml)

- Dung dịch thêm chuẩn

Chuẩn bị dung dịch thêm chuẩn bang cach dung pipet lay 2 ml dung dich géc aflatoxin hỗn hợp (chia néng dé aflatoxin B, va G, 1000 ng/ml, aflatoxin B va G2 200 ng/ml, cho

vào bình định mức 10 ml đã hiệu chuẩn Làm bay hoi dung dich toluen/axetonitril dén khé

bằng dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng Thêm metanol đến vạch và trộn kỹ Nồng độ của dung dịch thêm chuẩn là: aflatoxin Bị và G¡ 200 ng/mIl, aflatoxin B; và G›; 40 ng/mI

Bọc kín bình trong màng nhôm va bao quan ở nhiệt độ nhỏ hơn 4 °C Trước khi sử

dụng, không mở bình cho đến khi lượng chứa trong bình đạt đến nhiệt độ phòng đề tránh hấp thụ nước đo ngưng tụ

5 Thiết bị, dụng cụ

Yéu cau chung

Tất cả các dụng cụ thủy tinh tiếp xúc với các dung dịch aflatoxin phải được rửa sạch bằng dung dịch axit trước khi sử dụng Có nhiều máy rửa phòng thí nghiệm có cài đặt

28

chương trình này Nếu không, ngâm dụng cụ thủy tinh trong axit sulfuric (2 mol/1) trong một thời gian (ví đụ: 15 h qua đêm), sau đó rửa sạch (ví du: ba lần) với nước đề loại bỏ hết axit Kiểm tra bằng giấy pH đề chắc chắn đã hết axit

Việc xử lý này là cần thiết, vì khi sử dụng các dụng cụ thủy tính không được rửa bằng axit có thê gây thất thoát aflatoxin, cụ thê với các bình cầu đáy tròn, bình định mức, ống

đong, lọ hoặc ống nghiệm được sử dụng cho các dung dịch hiệu chuẩn và các dịch chiết

cuối cùng (đặc biệt là lọ lấy mẫu tự động) và pipet Pasteur, được dùng đề chuyên các dung

dịch hiệu chuẩn hoặc dịch chiết

Các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và cụ thê như sau:

- Máy nghiền phòng thử nghiệm

Hoặc máy nghiền tốc độ cao chống cháy nô, đề tạo và chiết hồ nhão từ lạc, quả hồ trăn

và quả vả, có bình trộn thích hợp

- Máy lắc ngang hoặc máy lắc đứng có thể điều chỉnh được, đề phân tích bột ớt

- Giấy lọc gấp nếp, ví dụ đường kính 24 cm

- Bình nón, có nắp thủy tinh hoặc nắp vặn

- Giấy lọc thủy tỉnh mịn, giữ được cỡ hạt I,6 tm hoặc nhỏ hơn

- Bầu chứa, dung tích 75 ml có đầu nối với cột ái lực miễn nhiễm (AC)

- Bom tay, dang xyranh 20 ml có khóa hoặc nắp cao su dùng cho cột ái lực miễn nhiễm (IAC)

- Bình định mức thủy tỉnh, ví dụ các binh dung tich 5 ml, 10 ml va 20 ml, co độ chính xác

ít nhất là 0,5 %

- Hệ thống HPLC, gồm có:

Bơm HPLC, thích hợp với tốc độ dòng là 1,0 ml/min

Hệ thống bơm, có thể bơm một vòng đầy Nên dùng vòng bơm 200 ul

Trong trường hợp đùng vòng bơm có kích cỡ khác với khuyến cáo thì phải đảm bảo rằng giới hạn phát hiện của hệ thống (LOD) < 0,2 ng/g (tỷ lệ tín hiệu/nhiễu = 3) và giới hạn định lượng (LOQ) < 0,5 ng/g (tỷ lệ tín hiệu/nhiễu = 6) đối với từng aflatoxin (sử dụng các dung dịch chuẩn)

- Cot HPLC pha dao, vi du Cis hoac ODS-2 (dài 25 cm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt

5 um), đảm bảo phân giải đường nền của các pic aflatoxin Bị, Bạ, G¡ và G; ra khỏi các pic

29

khác Sự chồng lấn tôi đa của các pic phải nhỏ hơn 10 % (có thể cần điều chỉnh pha động để

có độ phân giải đường nên tốt) Nên sử dụng tiền cột thích hợp

- Hệ thống tạo dẫn xuất sau cột, với PBPB (chí sử dụng với pha động A)

Gồm có bơm không xung dùng cho HPLC, chỉ tiết chữ T thể tích chết bằng zero, Ống nối phản ứng bằng PTFE kích thước tối thiểu 45 cm x 0,5 mm đường kính trong

pháp điện hóa, ví dụ: cuvet KOBRA (chỉ sử dụng với pha động B)

- Detector huỳnh quang, với bước sóng kích thích À = 360 nm và bước sóng phát xạ À >

420 nm hoặc tương đương (ví dụ: đetector với bộ đơn sắc có thê điều chỉnh được)

Nên cài đặt detector có thê điều chỉnh được ở bước sóng 365 nm (bước sóng kích thích), 435 nm (bước sóng phát xạ) và chiều rộng băng là 18 nm

- Dụng cụ lọc dùng một lần, cỡ lỗ 0,45 pum

Trước khi sử dụng, kiểm tra để chắc chắn rằng aflatoxin không bị thất thoát trong quá

trình lọc (phép thử độ thu hồi)

CHÚ THÍCH Các vật liệu lọc có khả năng giữ lại aflatoxin

- Pipet, dung tích 2 ml và 10 ml, với độ chính xác tối thiêu 0,5 %

- Cân phân tích, có thê cân đến 0,1 mg

- Cân kỹ thuật, có thê cân đến 0,01 g

- Xyranh microlit hoặc pipet microlit đã hiệu chuẩn, dung tích từ 25 wl dén 500 pl

- Bộ phân phối chân không, tùy chọn

6 Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa một lượng thích hợp (ví đụ 10 kg) quả hồ trăn, lạc và quá vá để thu được

hồ nhão, ví dụ: dùng máy nghiên tốc độ cao

6.2 Ôn định cột ái lực miễn nhiễm

Đề cột ái lực miền nhiễm đạt đên nhiệt độ phòng trước khi ôn định Nôi cột ái lực miễn

nhiễm với bộ phân phôi chân không và găn bâu chứa vào cột ái lực miễn nhiễm

30

Dé 6n dinh, chuyén 10 ml PBS sang đỉnh cột và đề chảy qua với tốc độ 2 ml/min đến 3 ml/min qua cột (ví dụ: bằng trọng lực) Đảm bảo rằng một phần nhỏ (0,5 ml) PBS được giữ lại trên cột cho đến khi dung dịch mẫu được sử dụng

Thực hiện các quy trình ổn định theo hướng dẫn của nhà sản xuất

6.3 Chiết

Yêu cầu chung

Sử dụng máy nghiền tốc độ cao cho quá trình chiết hồ nhão quả vả, bơ lạc và hỗ nhão quả hồ trăn, vì các sản phâm giàu béo (bơ lạc và hồ nhão quả hồ trăn) cần tạo dang nhũ tương đề phá vỡ lớp chất béo và đề chiết được hết Ngoài ra, hồ nhão quả vả cần được phá

vỡ trong đung môi, vì nêu sử dụng máy lắc thì sẽ không thực hiện được do hồ nhão rất sánh Bột ớt có thê chiết được bằng cách lắc (với điều kiện là bột nghiền có cỡ hạt đến 500 pum) dé

xử lý một số mẫu cùng một lúc và giảm nguy cơ lây nhiễm chéo

Quả va

Cân khoảng 50 g phần mẫu thử đồng nhất, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 500

ml hoặc bình trộn Thêm 5 g natri clorua và 300 ml dung môi chiết Trộn trong 3 min bằng máy nghiền tốc độ cao

Lọc dịch chiết qua giấy lọc Dùng pipet lấy 10,0 ml địch lọc trong cho vào cốc thủy tinh có mỏ 100 ml (hoặc tương tự) và pha loãng bằng 60 ml PBS Cho địch chiết mẫu đã pha

loãng vào bầu chứa được nối với cột ái lực miễn nhiễm đã ôn định và tiến hành

Có thê sử dụng khối hồ nhão hoặc các phần mẫu thử lớn hơn, với điều kiện là duy

trì đúng tỉ lệ (mẫu- dung môi cũng như thành phần dung môi đối với khối hỗ nhão)

Lạc

Cân khoảng 50 g phần mẫu thử đồng nhất, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 500

mÏ hoặc bình trộn Thêm 5 g natri clorua và 200 mÌ dung môi chiết và 100 ml n-hexan hoặc

xyclohexan Trộn trong 3 min bằng máy nghiền tốc độ cao

Lọc dịch chiết qua giấy lọc Trong trường hợp tách lớp đung môi thì tiến hành lọc pha dưới Dùng pipet lấy 10,0 ml địch lọc trong cho vào cốc thủy tính có mỏ 100 ml (hoặc tương tự) và pha loãng bằng 60 ml PBS Cho dịch chiết mẫu đã pha loãng vào bầu chứa được nối

với cột ái lực miễn nhiễm đã ổn định và tiền hành

Việc tách lớp dung môi không xảy ra nếu lọc ngay sau khi nghiền trộn

và n-hexan/xyclohexan sẽ được giữ lại trong bộ lọc Có thê sử dụng bộ tách pha, nếu cần

31

Có thê sử đụng phần mẫu thử lớn hơn với điều kiện duy trì được tỷ lệ dịch chiết mẫu -

dung môi

Quả hồ trăn

Cân khoảng 50 g phần mẫu thử đồng nhất, chính xác đến 0, g, cho vào bình nón 500

mÌ hoặc bình trộn Thêm 5 g natri clorua, 200 ml dung mdi chiết và 100 ml n-hexan hoặc

xyclohexan Trộn trong 3 min bằng máy nghiền tốc độ cao

Lọc dịch chiết qua giấy lọc Trong trường hợp tách lớp dung môi thì lọc pha dưới Dùng pipet lấy 10,0 ml địch lọc trong cho vào cốc thủy tỉnh có mỏ 100 ml (hoặc tương tự)

và pha loãng bằng 60 ml PBS Cho địch chiết mẫu đã pha loãng vào bầu chứa được nối với

cột ái lực miễn nhiễm đã ồn định và tiền hành

Nếu xuất hiện lượng kết tủa đáng kế khi pha loãng với PBS, ding pipet lay 20 ml dich

lọc mẫu cho vào cốc thủy tinh có mỏ 250 ml (hoặc tương tự) và pha loãng với 140 ml PBS, sau đó lọc qua giấy lọc Trong trường hợp này cho 70 ml dịch chiết mẫu đã lọc vào bầu chứa

nối với cột ái lực miễn nhiễm đã ồn định và tiễn hành

Sự phân tách lớp đung môi không xảy ra nêu lọc ngay sau khi nghiền và n-

hexan/xyclohexan được giữ lại trong bộ lọc Sử dụng bộ tách pha loc, nêu cần

Có thê dùng phần mẫu thử lớn hơn nêu duy trì được tỷ lệ địch chiết mẫu-dung môi Bột ớt

Cân khoảng 50 g phần mẫu thử đồng nhất, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 500

ml hoặc bình trộn Thêm 5 g natri clorua và 300 m1 dung môi chiết Lắc kỹ bằng tay 15 s đến

30 s, sau đó lac 30 min bằng máy lắc Đối với các loại máy lắc khác nhau (ví dụ: máy lắc

ngang hoặc máy lắc đứng), cần điều chỉnh tốc độ đề đạt được việc khuấy trộn tối đa hỗn hợp

dịch chiết

Lọc dịch chiết qua giấy lọc Dùng pipet lấy 10,0 ml địch lọc trong cho vào cốc thủy tính có mỏ 100 ml và pha loãng bằng 60 mi PBS Cho địch chiết mẫu đã pha loãng vào bầu

chứa được nối với cột ái lực miễn nhiễm đã ồn định và tiễn hành

Có thê sử dụng các phần mẫu thử lớn hơn nêu duy trì được tý lệ dịch chiết-đung môi 6.4 Làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm

Cho dich loc đi qua cột với tốc độ dòng khoảng 3 ml/min (khoảng một giọt trên mỗi giây) Không vượt quá tốc độ 5 ml/min Rửa cột với khoảng L5 mÍ nước, mỗi phần khoảng 5

ml ở tốc độ tối đa 5 ml/min và làm khô bằng chân không khoảng 5 s đến 10 s hoặc dùng xyranh cho không khí qua cột ái lực miễn nhiễm trong khoảng 10 s

32

Rửa giải các aflatoxin bang quy trình hai budc Cho 0,50 ml metanol 1én cột và cho di

qua cột Thu dịch rửa giải vào bình định mức đã hiệu chuẩn 5 ml Đợi 1 min va dua phan thir

hai 0,75 ml metanol 1én cét Thu phần lớn phan dung môi rửa giải đã dùng bằng cách nén

không khí đi qua cột

Thêm nước vào bình đến vạch, lắc kỹ và chỉnh lại để thu được thê tích quy định Nếu dung dịch trong thì có thể sử dụng trực tiếp đề phân tích HPLC Nếu dung dịch không trong, lọc qua bỏ lọc dùng một lần trước khi bơm vào HPLC

CHÚ THÍCH: Các phương pháp nạp mẫu lên cột ái lực miễn nhiễm, rửa cột và rửa giải có

thê hơi khác nhau giữa các hãng sản xuất cột Cần tuân theo các hướng dẫn cụ thê của nhà cung cấp cột

6.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Đề đảm bảo độ chụm tối đa, việc bơm dung dịch chuan aflatoxin (thé tich bom 200 il)

và các dịch chiết mẫu đã tính sạch được thực hiện bằng phương thức lay day vong mau theo

hướng dẫn của nhà sản xuất công bơm hoặc van bơm Các aflatoxin được phân tách bằng HPLC pha đảo (RP-HPLC) ở nhiệt độ phòng với cột pha đảo và pha động thích hợp Tốc độ dòng khuyến cáo nên là l mlámin với cột có đường kính trong là 4,6 mm Do đó, tốc độ dòng có thể được điều chính theo kích thước cột Các aflatoxin rửa giải theo thứ tự G;, G¡, B; và Bị với thời gian lưu khoảng 6 min, 8 min, 9 min va 11 min tuong tmg va d6 phân giải đường nên tốt Pha động có thể được điều chỉnh bằng cách thêm nước, metanol hoặc axetonitril để có được độ phân giải pic và hiệu suất quả sắc ký tối đa (sắc ký đồ điển hình được nều trong Phụ lục A)

6.6 Tạo dẫn xuất sau cột

Khi sử dụng PBPB, gắn chi tiết chữ T và ống phản ứng, sau đó vận hành với các thông

SỐ sau:

- Tốc độ dòng 1,00 ml/min đối với pha động:

- Tốc độ dòng 0,30 ml/min đối với thuốc thử (tốc độ dòng có thể điều chỉnh đến tốc độ dòng