Đồ án tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học: Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 4'-fluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất: Đồ án tốt nghiệp ngành Công nghệ kỹ thuật hóa học

TS HOÀNG MINH HẢO SVTH: HOÀNG THẢO NGUYÊN SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT 4'-FLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

GVHD: PGS TS HOÀNG MINH HẢO SVTH: HOÀNG THẢO NGUYÊN

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT 4'-FLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀM NĂNG NHẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ

α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT

4'-FLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU

CƠ CHẾ VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀM NĂNG NHẤT

SVTH: Hoàng Thảo Nguyên MSSV: 20128138

GVHD: PGS.TS Hoàng Minh Hảo

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ

α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT

4'-FLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU

CƠ CHẾ VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA

HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀM NĂNG NHẤT

SVTH: Hoàng Thảo Nguyên MSSV: 20128138

GVHD: PGS.TS Hoàng Minh Hảo

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2024

TÓM TẮT

Bệnh đái tháo đường tuýp 2 là một trong những bệnh mãn tính phổ biến và đang gia

tăng nhanh chóng trên toàn cầu Mặc dù các chất ức chế α-glucosidase hiện tại như

acarbose, miglitol, voglibose đã được sử dụng trong điều trị nhưng chúng thường gây ra các tác dụng phụ không mong muốn như đau bụng, đầy hơi và khó tiêu Để khắc phục

vấn đề này, đề tài “Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất

4'-fluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất.” đã được thực hiện Năm dẫn xuất 4'-fluorochalconoid bao gồm

NU05, NU06, PT10, PT11 và PT12 do hai anh chị sinh viên Phạm Thành Trung và Phạm Thị Ngọc Uyên K19 Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh

tổng hợp, được sàng lọc in vitro hoạt tính ức chế α-glucosidase và PT12 được xác định

là có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất (IC50 = 48,94 ± 0,19 μM), vượt trội hơn

so với acarbose (IC50 = 69,58 ± 2,04 μM) nên PT12 được chọn làm hoạt chất để nghiên

cứu cơ chế và động học ức chế α-glucosidase Kết quả nghiên cứu động học enzyme qua

việc xây dựng đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon cho thấy rằng PT12 ức chế

α-glucosidase theo cơ chế ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) với hằng số ức chế

Ki nhỏ cho thấy PT12 ức chế α-glucosidase mạnh Ki = (34,74 ± 0,28) × 10 -6 (M) Ngoài

ra, để hiểu sâu hơn về cách thức tương tác của PT12 với α-glucosidase, nghiên cứu đã

tiến hành phân tích động học dập tắt huỳnh quang Phân tích phổ phát huỳnh quang cho

thấy PT12 dập tắt sự phát huỳnh quang của α-glucosidase thông qua cơ chế dập tắt động

và tĩnh, trong đó cơ chế dập tắt tĩnh chiếm ưu thế với hằng số dập tắt lưỡng phân tử

kq = (3,38 ± 0,26) × 1012 (M-1s-1) Giá trị Ka (hằng số kết hợp) thu được là

Ka = (0,78 ± 0,08) × 10 4 (M-1) cho thấy PT12 có ái lực lớn với α-glucosidase và tỷ lệ (stoichiometric) tỷ lệ liên kết giữa enzyme và PT12 là 1:1 (n = 1,37 ± 0,03), trên mỗi

phân tử enzyme chỉ có một khoang gắn kết Để xác định tương tác giữa

α-glucosidase và chất ức chế PT12, khoá luận sử dụng 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS), một hợp chất có khả năng tạo phức [α-glucosidase–ANS] có khả năng phát

huỳnh quang thông qua tương tác kỵ nước Kết quả cho thấy cường độ phát huỳnh quang

của phức [α-glucosidase–ANS] giảm đáng kể khi tăng nồng độ PT12 Nghĩa là, PT12

tương tác với enzyme qua tương tác kỵ nước

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài: “Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất

4'-fluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất.” Tôi xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Hoàng Minh Hảo đã

hướng dẫn, hỗ trợ trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp Sự tận tâm và am hiểu của Thầy không chỉ giúp tôi nắm vững lý thuyết mà còn khuyến khích tôi phát triển

tư duy nghiên cứu, tự chủ và sáng tạo trong công việc

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể các Thầy, Cô trong khoa Công nghệ Hoá học và Thực phẩm Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt tri thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài Cảm ơn sự đóng góp quan trọng của gia đình và các bạn sinh viên K20 đã hỗ trợ và thông cảm trong suốt quá trình thực nghiệm Nhờ có sự quan tâm, ủng hộ của những người thân yêu đã tạo nên động lực giúp tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Do kiến thức và kỹ năng của bản thân còn hạn chế nên nội dung khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý và chỉ dạy thêm từ quý Thầy, Cô Khoá luận tốt nghiệp là một cột mốc đánh dấu sự trưởng thành trong suốt bốn năm đại học tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, đây là sự chứng minh cho nỗ lực và những kiến thức tôi gặt hái được trong bấy lâu nay Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Hoàng Thảo Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là một kết quả nghiên cứu độc lập không có bất kì sự sao chép nào từ các công trình nghiên cứu của người khác, quá trình thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy PGS.TS Hoàng Minh Hảo Các số liệu và kết quả nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan chưa từng được công bố dưới hình thức nào Trong quá trình viết bài có tham khảo một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo quy định

Tp Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Hoàng Thảo Nguyên

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU xii

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Bệnh đái tháo đường 1

1.1.1 Khái niệm 1

1.1.2 Phân loại 1

1.1.3 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường 2

1.2 α-Glucosidase và chất ức chế α-glucosidase 2

1.2.1 Định nghĩa và vai trò sinh học của α-glucosidase 2

1.2.2 Chất ức chế α-glucosidase được sử dụng hiện nay 3

1.3 Tổng quan về chalcone và chalconoid 4

1.4 Nghiên cứu động học enzyme 5

1.4.1 Cơ chế xúc tác của enzyme 5

1.4.2 Các cơ chế ức chế enzyme 5

1.4.4 Đồ thị Dixon 11

1.5 Phổ phát huỳnh quang 14

1.5.1 Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang 14

1.5.2 Ứng dụng của phổ phát huỳnh quang 18

1.6 Phổ phát huỳnh quang của phức chất [α-glucosidase–ANS] khi không có và có chất ức chế 18

1.6.1 Tương tác kỵ nước giữa enzyme với 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (ANS) 20

1.6.2 Phổ kích thích của phức chất [α-glucosidase–ANS] 21

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 22

2.2 Thực nghiệm 24

2.2.1 Khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase 24

2.2.2 Thực nghiệm xác định cơ chế ức chế α-glucosidase của PT12 thông qua đồ thị Lineweaver-Burk và Dixon 29

2.2.3 Thực nghiệm động học dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi PT12 31

2.2.4 Xác định tương tác giữa α-glucosidase và PT12 thông qua phổ phát huỳnh quang của [α-glucosidase–ANS] và PT12 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

3.1 Kết quả khảo sát in vitro hoạt tính ức chế α-glucosidase 35

3.2 Kết quả thực nghiệm xác định cơ chế ức chế α-glucosidase của PT12 38

3.2.1 Kết quả đồ thị Lineweaver-Burk 38

3.2.2 Kết quả đồ thị Dixon 40

3.3 Kết quả động học dập tắt huỳnh quang α-glucosidase bởi PT12 42

3.4 Kết quả xác định tương tác giữa α-glucosidase và PT12 thông qua phổ phát huỳnh quang của [α-glucosidase–ANS] và PT12 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Hoá chất 22

Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị 24

Bảng 2.3: Bố trí trên đĩa 96 giếng thực nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidse 29

Bảng 2.4: Bố trí trên đĩa 96 giếng thực nghiệm Lineweaver-Burk, Dixon 31

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase 35

Bảng 3.2: So sánh cấu trúc hoá học giữa các dẫn xuất 4'-fluorochalconoid 37

Bảng 3.3: Thông số động học enzyme 39

Bảng 3.4: Hằng số ức chế của acarbose và PT12 41

Bảng 3.5: Giá trị IC50, thông số động học, số vị trí liên kết và cơ chế ức chế của PT12 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của acarbose, miglitol và voglibose 3

Hình 1.2: Cấu trúc cơ bản của chalcone 4

Hình 1.3: Cơ chế xúc tác của enzyme 6

Hình 1.4: Cơ chế ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) của chất ức chế 7

Hình 1.5: Cơ chế ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition) của chất ức chế 7

Hình 1.6: Cơ chế ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) của chất ức chế 7 Hình 1.7: Đồ thị Lineweaver-Burk 8

Hình 1.8: Đồ thị Lineweaver-Burk dùng để xác định cơ chế ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) 9

Hình 1.9: Đồ thị Lineweaver-Burk dùng để xác định cơ chế ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition) 10

Hình 1.10: Đồ thị Lineweaver-Burk dùng để xác định cơ chế ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) 11

Hình 1.11: Đồ thị Lineweaver-Burk dùng để xác định cơ chế ức chế hỗn hợp (mixed inhibition) 11

Hình 1.12: Đồ thị Dixon của ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) và ức chế hỗn hợp (mixed inhibition) 13

Hình 1.13: Đồ thị Dixon của ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition) 13

Hình 1.14: Đồ thị Dixon của ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) 14

Hình 1.15: Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang 15

Hình 1.16: Cơ chế dập tắt huỳnh quang động và tĩnh 16

Hình 1.18: Phổ hấp thụ (a) và phổ huỳnh quang (b) của ba amino acid tryptophan,

tyrosine và phenylalanine 19

Hình 1.19: Cấu trúc của 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (ANS) 20

Hình 1.20: Phổ kích thích của phức chất [α-glucosidase–ANS] 21

Hình 2.1: Phản ứng thuỷ phân p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) 25

Hình 3.1: Phần trăm ức chế α-glucosidase của acarbose 36

Hình 3.2: Phần trăm ức chế α-glucosidase của PT12 36

Hình 3.3: Đồ thị Lineaweaver-Burk của acarbose Vận tốc phản ứng (𝒗) được biểu thị bằng độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm 38

Hình 3.4: Đồ thị Lineaweaver-Burk của PT12 Vận tốc phản ứng (𝒗) được biểu thị bằng độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm 39

Hình 3.5: Đồ thị Dixon của acarbose Vận tốc phản ứng (𝒗) được biểu thị bằng độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm 40

Hình 3.6: Đồ thị Dixon của PT12 Vận tốc phản ứng (𝒗) được biểu thị bằng độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm 41

Hình 3.7: Phổ phát huỳnh quang của α-glucosidase khi không có và có PT12, ex = 295 nm, em = 300–450 nm 42

Hình 3.8: Đồ thị của phương trình Stern–Volmer (a) Đồ thị của phương trình (17) (b) 43

Hình 3.9: Quang phổ huỳnh quang phức [α-glucosidase–ANS] trong trường hợp không có và có PT12, ex = 375 nm, em = 400–600 nm 45

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ANS (C 6 H 5 NHC 10 H 6 SO 3 H): 8-Anilinonaphthalene-1-sulfonic acid

DMSO ((CH 3 ) 2 SO): Dimethyl sulfoxide

Trp: Tryptophan

Tyr: Tyrosine

MỞ ĐẦU

Lí do chọn đề tài

Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hoá được quan tâm hàng đầu trên thế giới, đặc trưng bởi lượng đường trong máu tăng cao Theo các nghiên cứu và thống kê y tế, khoảng 90-95% số ca mắc bệnh đái tháo đường tuýp 2 Đái tháo đường tuýp 2 xảy ra khi cơ thể kháng insulin hoặc không sản xuất đủ insulin, gây ra nhiều tổn thương nghiêm trọng về mắt, tim, thận, thần kinh…

Một trong những liệu pháp hiệu quả trong việc điều trị bệnh đái tháo đường tuýp 2 chính

là ức chế α-glucosidase, nhờ đó làm chậm quá trình chuyển hoá carbohydrate thành

glucose, giúp giảm lượng đường trong máu Do đó, việc tìm ra các chất ức chế

α-glucosidase mới, có hiệu quả cao đang là vấn đề mà các nhà nghiên cứu quan tâm

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các nhóm nghiên cứu đã, đang khảo sát các hợp chất hữu cơ được phân lập từ tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế hoạt động của

α-glucosidase Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng các dẫn xuất chalconoid có khả năng ức chế hoạt động của α-glucosidase với hiệu quả đáng kể Chính vì thế, khoá luận này chọn các dẫn xuất 4'-fluorochalconoid để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase Đồng thời,

nghiên cứu cơ chế ức chế, động học dập tắt huỳnh quang và tương tác kỵ nước của PT12

đối với α-glucosidase để cung cấp thêm thông tin cần thiết cho việc phát triển các loại

thuốc điều trị mới cho bệnh đái tháo đường tuýp 2

Vì các lí do trên, đề tài “Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất

4'-fluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất.” được chọn để nghiên cứu cho khoá luận tốt nghiệp

Mục tiêu nghiên cứu:

− Đánh giá hoạt tính ức chế của các dẫn xuất 4'-fluorochalconoid đối với

α-glucosidase: sàng lọc các chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase

− Hiểu rõ cơ chế tương tác giữa hoạt chất và α-glucosidase: giúp hiểu rõ hơn cơ chế

ức chế enzyme, từ đó cung cấp thông tin cần thiết cho việc thiết kế các chất ức chế mới

− Phân tích động học dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi hoạt chất: cung cấp

thông tin chi tiết về quá trình tương tác giữa chất ức chế và enzyme

− Phân tích tương tác giữa α-glucosidase và hoạt chất

Đối tượng nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, đối tượng được lựa chọn để nghiên cứu

là acarbose, các dẫn xuất 4'-fluorochalconoid và α-glucosidase

Phạm vi nghiên cứu:

− Sàng lọc in vitro hoạt tính ức chế α-glucosidase của dẫn xuất 4'-fluorochalconoid

− Nghiên cứu cơ chế ức chế của hoạt chất đối với α-glucosidase qua đồ thị

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và bàn luận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Bệnh đái tháo đường

1.1.1 Khái niệm

Bệnh đái tháo đường (Diabetes Mellitus–DM) là một trong những tình trạng khẩn cấp

về sức khỏe toàn cầu phát triển nhanh nhất trong thế kỷ 21 Theo báo cáo của Hiệp hội đái tháo đường thế giới (IDF Diabetes Atlas) vào năm 2021, ước tính trên toàn cầu có

537 triệu người mắc bệnh đái tháo đường và con số này dự kiến sẽ đạt 783 triệu người vào năm 2045 [1]

Bệnh đái tháo đường là một tình trạng sức khỏe mà cơ thể không thể sử dụng hoặc sản xuất insulin một cách hiệu quả, dẫn đến lượng đường trong máu tăng cao, gây ra nhiều tổn thương nghiêm trọng về mắt, tim, thận, thần kinh…[2]

là do tế bào trung gian T phá hủy các tế bào β trong tuyến tụy, nơi sản xuất insulin,

khiến cơ thể không sản xuất insulin dẫn đến tình trạng thiếu hụt insulin

− Đái tháo đường tuýp 2: còn được gọi là đái tháo đường không phụ thuộc insulin, thường gặp ở người lớn nhưng tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ em đang ngày càng gia tăng Đái tháo đường tuýp 2 xảy ra do kháng insulin và suy giảm chức năng tiết insulin

của tế bào β trong tuyến tụy Theo các nghiên cứu và thống kê y tế, đái tháo đường

tuýp 2 chiếm hơn 95% trên tổng số ca mắc bệnh đái tháo đường

− Đái tháo đường thai kỳ: xuất hiện trong thời kỳ mang thai, do các hormone thai kỳ làm giảm hiệu quả của insulin Đái tháo đường thai kỳ sẽ giảm dần hoặc biến mất hoàn toàn sau khi sinh

1.1.3 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường yêu cầu một kế hoạch điều trị để kiểm soát đường huyết và ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng được Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) khuyến cáo như sau [3, 4]:

Đối với cả bệnh nhân mắc đái tháo đường tuýp 1 và tuýp 2, thay đổi lối sống là yếu tố nền tảng và không thể thiếu trong việc quản lý bệnh Chế độ ăn uống lành mạnh, cân bằng, cũng như hoạt động thể chất một cách hợp lý để duy trì mức đường huyết ổn định

Điều trị đái tháo đường tuýp 1:

Vì cơ thể không thể sản xuất insulin nên điều trị đái tháo đường tuýp 1 chủ yếu dựa vào việc cung cấp insulin từ bên ngoài Bệnh nhân đái tháo đường tuýp 1 phải tiêm insulin theo phác đồ điều trị, việc điều chỉnh liều insulin dựa trên kết quả đo đường huyết và chế độ ăn uống, hoạt động hàng ngày của bệnh nhân

Điều trị đái tháo đường tuýp 2:

Đối với bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2, có nhiều loại thuốc được sử dụng để kiểm soát đường huyết, chia thành các nhóm:

− Nhóm thuốc kích thích bài tiết insulin: Bao gồm sulfonylurea và meglitinide,

giúp tăng cường tiết insulin từ tế bào β của tuyến tụy

− Nhóm thuốc làm tăng tác dụng insulin tại cơ quan đích và giảm đề kháng

insulin: Bao gồm metformin và thiazolidinedione Metformin giảm sản xuất

glucose tại gan và cải thiện độ nhạy insulin, trong khi thiazolidinedione giúp tăng cường hiệu quả của insulin tại các mô ngoại biên

− Nhóm thuốc ức chế α-glucosidase hấp thu glucose tại ruột: Bao gồm acarbose

và miglitol, làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate và hấp thu glucose tại ruột, giúp kiểm soát mức đường huyết sau ăn

1.2 α-Glucosidase và chất ức chế α-glucosidase

1.2.1 Định nghĩa và vai trò sinh học của α-glucosidase

Enzyme là các protein quan trọng đối với cơ thể sống, chúng làm giảm năng lượng hoạt

được gọi là chất xúc tác sinh học [5] Đến nay, người ta đã phát hiện hàng ngàn loại

enzyme khác nhau từ việc khảo sát và nghiên cứu Trong đó, α-glucosidase

(E.C.3.2.1.20) là một loại enzyme thuộc nhóm glycoside hydrolase, nổi bật với vai trò quan trọng là xúc tác quá trình thuỷ phân các polysaccharide, oligosaccharide và

disaccharide thông qua việc cắt đứt liên kết α-1,4-glycoside thành monosaccharide, cụ thể là α-D-glucose Quá trình này diễn ra ở ruột non, các đơn vị glucose sinh ra sẽ được

hấp thụ vào hệ tuần hoàn máu thông qua đường tiêu hoá, cung cấp năng lượng cho cơ thể, duy trì mức đường huyết trong cơ thể ổn định [6]

1.2.2 Chất ức chế α-glucosidase được sử dụng hiện nay

Ức chế α-glucosidase là một trong những phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường

tuýp 2, giúp kiểm soát lượng đường trong máu bằng cách ngăn chặn quá trình thuỷ phân carbohydrate thành glucose trong hệ thống tiêu hóa, làm chậm quá trình thẩm thấu

glucose vào máu Chất ức chế α-glucosidase hiện nay được sử dụng acarbose, miglitol,

và voglibose có cấu trúc như Hình 1.1 [7]

Hình 1.1: Cấu trúc của acarbose, miglitol và voglibose

Trong đó, acarbose là chất ức chế α-glucosidase đã được sử dụng trong hơn 20 năm

trong việc kiểm soát bệnh đái tháo đường tuýp 2 Acarbose có cấu trúc tương tự với các

oligosaccharide tự nhiên, nhưng liên kết với α-glucosidase mạnh hơn nên có khả năng

ức chế α-glucosidase theo cơ chế ức chế cạnh tranh, làm chậm quá trình chuyển hoá các

polysaccharide và oligosaccaride thành glucose, từ đó giảm hấp thụ glucose từ thức ăn vào máu Tuy nhiên, acarbose có thể gây ra các tác dụng phụ như đau bụng, tiêu chảy, tổn thương gan…[8]

Do vậy việc tìm ra các chất ức chế mới để điều trị bệnh đái tháo đường tuýp 2 có hiệu quả cao và ít tác dụng phụ hơn là đang là vấn đề thu hút các nhà nghiên cứu quan tâm

1.3 Tổng quan về chalcone và chalconoid

Chalcone là ketone thơm có cấu trúc 1,3-diaryl-2-propen-1-one và được coi là tiền chất của flavonoid Trong cấu trúc của chalcone có 2 vòng thơm (A và B) được liên kết với

nhau qua mạch carbonyl bất bão hoà tại α, β (-CO-CH=CH), cấu trúc của chalcone được

thể hiện qua Hình 1.2

Hình 1.2: Cấu trúc cơ bản của chalcone

Chalcone thường được tìm thấy ở nhiều loài thực vật và có thể được tổng hợp qua các phương pháp khác nhau, trong đó phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt với xúc tác acid/base là một trong những phương pháp phổ biến nhất [9]

Trong cấu trúc của chalcone có chứa nhiều hydro có thể thay thế (trên vòng A và vòng B) thành các nhóm chức khác nhau như –OH, –OCH3, –NH2,… bằng cách sử dụng các phương pháp và quy trình khác nhau để tổng hợp nên các dẫn xuất của chalcone, được gọi là chalconoid Nhờ tính đa dạng về nhóm thế, chalconoid có khả năng tạo ra các dẫn xuất mang tính chất sinh học đa dạng và hoạt tính mạnh hơn chalcone

Chalcone và chalconoid đã được nghiên cứu và công nhận là các hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng như hoạt tính kháng oxy hoá, kháng vi khuẩn và kháng virus, kháng nấm, kháng ung thư, kháng viêm, kháng dị ứng,…bao gồm hoạt tính ức chế

α-glucosidase trong điều trị bệnh đái tháo đường [10]

1.4 Nghiên cứu động học enzyme

Động học enzyme là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, tập trung vào việc hiểu rõ tốc

độ và các cơ chế phản ứng của enzyme Các nghiên cứu động học enzyme sử dụng nhiều công cụ và phương pháp khác nhau để phân tích và mô tả các quá trình phản ứng

1.4.1 Cơ chế xúc tác của enzyme

Trong cấu trúc của enzyme có một phần nhỏ có vai trò quan trọng đối với hoạt tính của enzyme được gọi là khoang gắn kết Trước đây, Emil Fischer, một nhà hoá học người Đức đề xuất rằng chất nền và khoang gắn kết liên kết với nhau giống như chìa khoá và

ổ khoá (Fischer’s lock and key hypothesis) Vào cuối thế kỷ XIX, Fischer đề xuất rằng chất nền và khoang gắn kết có cấu trúc cứng và tĩnh, có hình dạng chính xác khớp với nhau, tương tự như một chiếc chìa khoá và ổ khoá Tuy nhiên, giả thuyết này không phù hợp khi một enzyme có thể xúc tác cho nhiều chất nền khác Do đó, thuyết

"Induced Fit" của Daniel E Koshland Jr., được đề xuất vào những năm 1950, chỉ ra rằng enzyme không phải là một cấu trúc cứng và tĩnh, mà nó có thể thay đổi hình dạng để liên kết với chất nền (Koshland’s theory of induced fit) [11]

Khi chất nền gắn vào khoang gắn kết của enzyme, nó liên kết thông qua các tương tác hoá học như liên kết ion, liên kết hydrogen, liên kết Van der Waals tạo thành phức chất [enzyme–chất nền] Enzyme xúc tác phản ứng, biến đổi cơ chất thành sản phẩm, sau đó giải phóng sản phẩm [12] Cơ chế xúc tác enzyme được miêu tả trong Hình 1.3

1.4.2 Các cơ chế ức chế enzyme

Chất ức chế có thể ức chế enzyme theo các cơ chế ức chế cạnh tranh (competitive inhibition), ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition), ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) và ức chế hỗn hợp (mixed inhibition)

1.4.2.1 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Chất ức chế cạnh tranh (competitive inhibitior) có cấu trúc tương tự với chất nền và vừa

chất nền trong việc liên kết với khoang gắn kết, kết quả là enzyme bị bất hoạt Cơ chế hoạt động của ức chế cạnh tranh được biểu diễn như Hình 1.4 [12]

1.4.2.2 Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition)

Chất ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibitior) hay chất ức chế allosteric (allosteric inhibitor) không liên kết với khoang gắn kết mà liên kết với vị trí allosteric (vị trí khác) của enzyme và do đó không cạnh tranh với chất nền Tuy nhiên, quá trình liên kết này khiến enzyme thay đổi hình dạng, sự thay đổi hình dạng đó khiến hình dạng của khoang gắn kết cũng thay đổi và chất nền không thể vào liên kết với khoang gắn kết Cơ chế hoạt động của ức chế không cạnh tranh được biểu diễn như Hình 1.5 [12]

1.4.2.3 Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) là một trường hợp ức chế rất hiếm gặp Chất ức chế liên kết với phức chất [enzyme–chất nền] tạo thành một phức chất [enzyme–chất nền–chất ức chế] Phức chất [enzyme–chất nền–chất ức chế] là một phức chất bền, vì vậy khiến cho quá trình tạo ra sản phẩm chậm lại Cơ chế hoạt động của ức chế kháng cạnh tranh được biểu diễn như Hình 1.6 [12]

1.4.2.4 Ức chế hỗn hợp (mixed inhibition)

Chất ức chế hỗn hợp (mixed inhibitior) có thể liên kết với cả enzyme tự do và phức chất [enzyme–chất nền] tạo thành phức chất [enzyme–chất nền–chất ức chế] nhưng với ái lực khác nhau Trong ức chế hỗn hợp, chất ức chế có thể tương tác với enzyme ở khoang gắn kết hoặc ở vị trí allosteric của enzyme [12]

Hình 1.3: Cơ chế xúc tác của enzyme

Hình 1.4: Cơ chế ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) của chất ức chế

Hình 1.5: Cơ chế ức chế không cạnh tranh

(noncompetitive inhibition) của chất ức chế

Hình 1.7: Đồ thị Lineweaver-Burk

Phương trình Michaelis-Menten, được Leonor Michaelis và Maud Menten đề xuất năm

1913, là một phương trình cơ bản được sử dụng để mô tả động học enzyme Phương trình được biểu diễn như sau [13] :

𝟏

Trong đó:

𝒗 là tốc độ của phản ứng

[𝑺] là nồng độ chất nền

𝑲𝒎 là hằng số Michaelis, xác định ái lực của chất nền với enzyme, là nồng độ của chất nền mà tại đó 𝒗 = 𝒗𝒎𝒂𝒙

𝟐 (𝑲𝒎 = [𝑺] khi 𝒗 = 𝒗𝒎𝒂𝒙

𝟐 ) Như vậy, nếu 𝑲𝒎 càng nhỏ thì enzyme

có ái lực càng lớn với chất nền và ngược lại

Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition)

Quan sát Hình 1.8, khi tăng nồng độ chất ức chế, sự tương tác giữa chất nền và enzyme giảm, dẫn đến giá trị 𝑲𝒎 tăng Nhưng khi tăng nồng độ chất nền đến khi vượt qua ức chế, tốc độ cực đại của phản ứng 𝒗𝒎𝒂𝒙 không bị thay đổi Do đó, trên đồ thị, các đường

có cùng một giá trị 𝒗𝒎𝒂𝒙, 𝑲𝒎 tăng dần khi tăng nồng độ chất ức chế [14, 15]

Ức chế không cạnh tranh (Noncompetitive inhibition)

Quan sát Hình 1.9, vì chất ức chế kết hợp với enzyme ở một vị trí khác ngoài khoang gắn kết của enzyme, do đókhông có sự thay đổi đáng kể về ái lực của chất nền đối với enzyme, nghĩa là 𝑲𝒎 không đổi Tác động chính của ức chế không cạnh tranh nằm ở việc giảm tốc độ cực đại của phản ứng enzyme (𝒗𝒎𝒂𝒙) do chất ức chế làm thay đổi hình dạng của enzyme, dẫn đến khoang gắn kết của enzyme bị thay đổi hình dạng và chất nền không thể liên kết được, tức là ngăn chặn sự hình thành sản phẩm [14, 15]

Hình 1.8: Đồ thị Lineweaver-Burk dùng để xác định cơ chế ức chế cạnh tranh

Hình 1.9: Đồ thị Lineweaver-Burk dùng để xác định cơ chế ức chế không cạnh tranh

(noncompetitive inhibition)

Ức chế kháng cạnh tranh (Uncompetitive inhibition):

Chất ức chế kháng cạnh (uncompetitive inhibition) không có ái lực với enzyme tự do

mà thay vào đó chúng chỉ liên kết với phức chất [enzyme–chất nền] tạo thành phức chất [enzyme–chất nền–chất ức chế] ngăn cản việc tạo thành sản phẩm, điều này khiến cho tốc độ phản ứng cực đại 𝒗𝒎𝒂𝒙 giảm Bên cạnh đó, việc chất ức chế liên kết với phức chất [enzyme–chất nền] cũng khiến cho số lượng phức chất [enzyme–chất nền] giảm đi,

do đó làm giảm 𝑲𝒎 Quan sát Hình 1.10, khi tăng nồng độ chất ức chế, đường thẳng trên đồ thị Lineweaver-Burk sẽ có độ dốc cao hơn, biểu thị rằng cả 𝒗𝒎𝒂𝒙 và 𝑲𝒎 đều giảm

Ức chế hỗn hợp (Mixed inhibition):

Ức chế hỗn hợp ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng và ái lực của chất nền đối với enzyme nên cả 𝒗𝒎𝒂𝒙 và 𝑲𝒎 đều thay đổi, nó khiến 𝒗𝒎𝒂𝒙 giảm trong khi 𝑲𝒎 có thể tăng hoặc giảm hoặc không đổi Hình 1.11 bên dưới biểu diễn đồ thị Lineweaver-Burk dùng để xác định cơ chế ức chế hỗn hợp [14, 15]

Hằng số ức chế Ki là một tham số quan trọng trong nghiên cứu động học enzyme, có thể

được xác định bằng cách xây dựng đồ thị Dixon Đồ thị Dixon biểu diễn tốc độ phản ứng 1

𝑣 trên trục y phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế [I] trên trục x

Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition)

Hằng số ức chế Ki là thông số động học mô tả hằng số phân ly giữa enzyme, chất ức chế

và phức chất enzyme–chất ức chế

𝑬 + 𝑰 ⇄ [𝑬𝑰], 𝑲𝒊 =[𝑬][𝑰]

Ki càng nhỏ, chất ức chế tương tác càng mạnh với enzyme, ức chế càng hiệu quả

Hằng số ức chế Ki thường thu được bằng cách tính toán dựa theo phương trình Michaelis

Đối với chất ức chế cạnh tranh, khi dựng đồ thị 1

𝑣 theo nồng độ chất ức chế [I] với nồng

độ chất nền [S] không đổi, thu được hai hoặc nhiều đường thẳng khi tăng nồng độ chất nền [S] (ví dụ, trường hợp Hình 1.12, [S2] < [S1]), các đường này sẽ cắt nhau tại một

điểm nằm bên trái trục tung, toạ độ x tại điểm đó là giá trị -Ki [13]

Tại điểm giao nhau của 2 đường sẽ cho cùng một giá trị 1

𝑣 và [I], thay vào phương trình (5), ta có:

𝑲𝐦[𝐒𝟏]+ 𝟏 +

𝑲𝐦[𝐈]

[𝐒𝟏]𝑲𝐢 =

𝑲𝐦[𝐒𝟐]+ 𝟏 +

𝐊𝐦[𝐈]

𝟏[𝑺𝟏](𝟏 +[𝑰]

𝑲𝒊) = 𝟏

[𝑺𝟐](𝟏 +[𝑰]

Đường 1 là nồng độ chất nền 1 [S1], đường 2 là nồng độ chất nền 2 [S2], [S2] < [S1]

Hình 1.12: Đồ thị Dixon của ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

và ức chế hỗn hợp (mixed inhibition)

Đường 1 là nồng độ chất nền 1 [S1], đường 2 là nồng độ chất nền 2 [S2], [S2] < [S1]

Hình 1.13: Đồ thị Dixon của ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition)

Đối với chất ức chế hỗn hợp, đồ thị xác định Ki tương tự với chất ức chế cạnh tranh nên

không thể sử dụng phương pháp này để phân biệt chất ức chế cạnh tranh và chất ức chế

hỗn hợp Ngoài ra, phương pháp này không thể sử dụng để xác định hằng số phân ly Ki

của phức chất [enzyme–chất nền–chất ức chế] [16] Đồ thị Dixon của ức chế kháng cạnh

tranh (uncompetitive inhibition) được thể hiện dưới Hình 1.14

Đường 1 là nồng độ chất nền 1 [S1], đường 2 là nồng độ chất nền 2 [S2], [S2] < [S1]

Hình 1.14: Đồ thị Dixon của ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

1.5 Phổ phát huỳnh quang

1.5.1 Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang

Phát huỳnh quang là hiện tượng mà một phân tử (thường gọi là chất phát huỳnh quang

F hay fluorophore) hấp thu năng lượng từ ánh sáng kích thích hay bức xạ điện từ sau đó

chuyển từ trạng thái cơ bản (F) S0 lên trạng thái kích thích (F*) mức năng lượng cao S2

Phân tử ở mức năng lượng cao rất không bền vững, có xu hướng hồi phục về trạng thái

có mức năng lượng thấp hơn S1, năng lượng được giải phóng ra dưới dạng nhiệt, thông

qua các dao động nội phân tử và tương tác với các phân tử lân cận F * với mức năng lượng S1 có thể quay về trạng thái cơ bản F thông qua quá trình phát xạ và/hoặc quá

trình phi phát xạ Nếu trong dung dịch có phân tử dập tắt huỳnh quang Q thì ngoài hai quá trình phát xạ và phi phát xạ thì F * có thể quay về trạng thái cơ bản F thông qua quá

trình dập tắt huỳnh quang Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang được biểu diễn theo Hình 1.15

Hình 1.15: Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang

Tốc độ quá trình phát xạ được xác định bởi phương trình (8):

(Trong đó: kf là hằng số tốc độ quá trình phát xạ)

Tốc độ quá trình phi phát xạ được xác định bởi phương trình (9):

(Trong đó: kt là tổng các hằng số tốc độ của các quá trình phi phát xạ)

Trong điều kiện kích thích liên tục thì tốc độ hình thành F * và tốc độ giảm hoạt F * → F

là như nhau Nồng độ F * được xác định bởi phương trình (10):

Khi có mặt của chất dập tắt huỳnh quang Q thì quá trình dập tắt chất phát huỳnh quang

F * bởi Q có thể xảy ra theo hai cơ chế: dập tắt huỳnh quang động (dynamic quenching),

dập tắt huỳnh quang tĩnh (static quenching) hoặc xảy ra theo cả hai cơ chế [18] Hình 1.16 mô tả cơ chế dập tắt huỳnh quang động và tĩnh như sau:

Δ là năng lượng được giải phóng dưới dạng nhiệt

Hình 1.16: Cơ chế dập tắt huỳnh quang động và tĩnh

Cơ chế dập tắt huỳnh quang động: Quá trình dập tắt bắt nguồn từ sự khuếch tán và va

chạm giữa F * và Q khiến F * ở trạng thái kích thích mất đi năng lượng kích thích và trở lại trạng thái cơ bản, dẫn đến sự dập tắt huỳnh quang Quá trình dập tắt này không phát

xạ và làm thay đổi thời gian sống của F * [19]

Cơ chế dập tắt huỳnh quang tĩnh: F và Q tương tác hình thành phức chất [FQ] ở trạng

thái cơ bản và phức chất này không phát huỳnh quang Quá trình này không làm thay

đổi thời gian sống của F * [19]

Phương trình Stern–Volmer là một công cụ được sử dụng để phân biệt cơ chế dập tắt huỳnh quang và được xây dựng như sau [20]: