Luận án nghiên cứu tổng hợp và tính chất của một số hợp chất 1,2,3 triazol có chứa đồng thời vòng isatin và hợp phần monosaccharide bằng phản ứng click

MỞ ĐẦU Isatin (1HIndole2,3dione) là một indole nội sinh được tìm thấy trong não của loài động vật có vú, mô ngoại biên và dịch của cơ thể 1. Isatin và các dẫn xuất của nó là một trong rất nhiều dãy chất hữu cơ được nghiên cứu một cách hệ thống về mặt hóa học cũng như các tác dụng dược lí 2. Các tài liệu tham khảo 3 chỉ ra rằng isatin và các dẫn xuất của nó thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý, như hoạt tính chống ung thư 4, 5, kháng khuẩn 6, kháng nấm 7, chống co giật 8, chống lao 9, kháng HIV 10, chống oxy hoá 11, 12, chống viêm 13, 14, gây tê 14, chống trầm cảm 15, v.v…… Trong hóa học, isatin cũng là nguồn nguyên liệu để tổng hợp nên nhiều hợp chất dị vòng như quinoline, indole,… Vì thế, hiện nay hóa học về isatin là một lĩnh vực nghiên cứu phát triển, với nhiều dẫn xuất isatin đã được tổng hợp. Hoá học carbohydrate, đặc biệt là hoá học của các mono và disaccharide, đã và đang được nghiên cứu một cách rộng rãi 16. Nhiều kiểu chuyển hoá nhằm gắn các nhóm chìa khoá vào khung carbohydrate đã được phát triển khá mạnh mẽ. Nhiều loại phản ứng quan trọng của lớp hợp chất này được phát hiện và phát triển. Nhiều hợp chất của chúng đã được tổng hợp dựa trên các phản ứng này và trong số này có nhiều chất thể hiện hoạt tính sinh học rất đáng chú ý 17. Việc gắn kết các dị vòng vào phân tử carbohydrate hứa hẹn mang lại nhiều tính chất mới, đặc biệt là các tính chất sinh học. Các azide hữu cơ nhận được nhiều sự quan tâm đặc biệt trong việc tổng hợp và nghiên cứu, cùng với khả năng tiếp cận dễ dàng qua nhiều con đường tổng hợp 18. Hơn nữa, các azide hữu cơ có thể dễ dàng chuyển hoá thành các amine, isocyanate và các phân tử chứa nhóm chức khác, gần đây chúng còn nhận được sự quan tâm ngày càng tăng như là tác nhân phản ứng có giá trị và linh hoạt trong khái niệm về “Hoá học click” (click chemistry) 19. Sự cộng hợp vòng hoá 1,3lưỡng cực theo Huisgen được xúc tác bằng Cu(I) (HDC, Huisgen 1,3Dipolar Cycloaddition) của các azide và các alkyne cuối mạch để tạo thành các dẫn xuất 1,2,3triazole được sử dụng rộng rãi để tổng hợp nhân dị vòng này 20. Người ta đã thống kê rằng gần 100% các bài báo liên quan đến phản ứng click này có các ứng dụng trên nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng 21, như tổng hợp các phân tử sinh học (các amino acid không có nguồn gốc thiên nhiên), phân tách gel điện di hai chiều, tổng hợp các triazole thế1,4, biến đổi nhóm chức peptide với các triazole, biến đổi các sản phẩm thiên nhiên và dược phẩm thiên nhiên, khám phá các sản phẩm thiên nhiên, khám phá thuốc, tổng hợp các vòng lớn, biến đổi DNA và các nucleotide bằng nhóm kết nối triazole, sử dụng trong hoá học siêu phân tử (supramolecular chemistry) 22. Các dẫn xuất của dị vòng 1,2,3triazole được sử dụng rộng rãi trong chữa bệnh, và hiện nay, việc nghiên cứu tổng hợp và thăm dò hoạt tính sinh học của chúng là một trong những lĩnh vực quan trọng nhất trong nghiên cứu và phát triển thuốc 23, 24. Có những công trình nghiên cứu đã chứng tỏ rằng, triazole có khả năng kháng lao và chống nấm rất tốt, đặc biệt khả năng chống nấm bội nhiễm 25, căn bệnh khá phổ biến ở những nước có khí hậu nóng ẩm như Việt Nam. Với mục đích đóng góp thêm vào việc nghiên cứu tạo ra những hợp chất mới có hoạt tính sinh học, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài cho Luận án Tiến sĩ là “Nghiên cứu tổng hợp và tính chất của một số hợp chất 1,2,3triazol có chứa đồng thời vòng isatin và hợp phần monosaccharide bằng phản ứng click”.

1.2.4 Phương pháp tổng hợp theo Martinet 4

1.2.5 Phương pháp tổng hợp theo Stolle 5

1.2.6 Phương pháp tổng hợp theo Gassman 5

1.2.7 Phương pháp tổng hợp sử dụng phản ứng kim loại hóa dẫn xuất anilide 5

1.6.1 Khái quát chung về phản ứng click 15

1.6.2 Phân loại phản ứng click 16

1.6.3 Đặc điểm của phản ứng click 18

1.6.4 Ứng dụng của phản ứng click 19

1.6.5 Cơ chế phản ứng 21

1.7 Sử dụng siêu âm trong tổng hợp hữu cơ 22

1.8 Sử dụng vi sóng trong tổng hợp hữu cơ 23

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 25

2.1 Phương pháp nghiên cứu 25

2.1.1 Hóa chất và thiết bị 25

2.1.2 Phương pháp tổng hợp hữu cơ 25

2.1.3 Phương pháp tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết 26

2.1.4 Phương pháp chiết lỏng-lỏng 27

2.1.5 Phương pháp phân tích cấu trúc 27

2.1.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 28

2.6 Tổng hợp 1,2,3-triazole 17 từ các (N-propargyl)isatin thế và 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl azide (17) 68

2.7 Tổng hợp 1,2,3-triazole 18 từ các (N-propargyl)isatin thế và

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 91

3.1 Tổng hợp các hợp phần monosaccharide có chứa nhóm azido và propargyl 91

3.1.5 Tổng hợp propargyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (11) 98

3.2 Tổng hợp một số dẫn xuất 1-alkyne và azido của các isatin thế 99

3.4 Tổng hợp các hợp chất lai 1,2,3-triazole−isatin 17 từ các N-propargylisatin thế và 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl azide 131

3.5 Tổng hợp các hợp chất lai 1,2,3-triazole−isatin 18 từ các N-propargylisatin thế và 6-azido-6-deoxy-1,2,3,4-tetra-O-acetyl-α-D-glucose 138

3.6 Tổng hợp các hợp chất lai 1,2,3-triazole−isatin 19 từ các N-(ω-azidoalkyl)-isatin thế và 1,2:3,4-di-O-isopropylidene-6-O-(2-propynyl)-α-D-galacto-pyranose 146

3.7 Tổng hợp các hợp chất lai 1,2,3-triazole−isatin 20 từ các N-(ω-azidoalkyl)-isatin thế và propargyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside 156

3.8 Về đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất lai 1,2,3-triazole−isatin 161

3.8.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 161

3.8.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro 161

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 165

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN 167

TÀI LIỆU THAM KHẢO 168

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C NMR : 13C-Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence (Phổ tương tác xa 1H−13C) HRMS : High Resolution Mass Spectrometry (Phổ khối phân giải cao) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation (Phổ tương tác gần

IC50 : Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50 %) IR : Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

MIC : Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MS : Mass Spectrometry (Phổ khối lượng)

MW : Microwave (lò vi sóng) ppm : Part per million (phần triệu)

UV : Ultra violet (tử ngoại)

MBC : Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) MFC : Minimum Fungicidal Concentration (Nồng độ diệt nấm tối thiểu) Mont : Montmorillonite K10

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Dữ liệu vật lí của các hợp chất isatin thế 12a-m 100

Bảng 3.2 Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng tổng hợp N-propargylisatin 13a 101

Bảng 3.3 Kết quả tổng hợp các hợp chất N-propargylisatin (13a-m) 104

Bảng 3.4 Phổ HSQC và HMBC của hợp chất 13j 109

Bảng 3.5 Kết quả tổng hợp các N-(ω-bromoalkyl)isatin 14a-m 111

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát điều kiện tổng hợp hợp chất 15b4 115

Bảng 3.7 Kết quả tổng hợp các hợp chất N-(ω-azidoalkyl)isatin 15a-m 116

Bảng 3.8 Kết quả tổng hợp một số N-(ωω-azidoalkyl)isatin 15 bằng các phản ứng kiểu one-pot và phản ứng đa thành phần 118

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát các điều kiện phản ứng click của 1-alkyne 13a với azide 3 123

Bảng 3.10 Tổng hợp các hợp chất 1,2,3-triazole 16a-m 124

Bảng 3.11 Các tương tác gần và xa trong phổ HSQC và HMBC của 16d 129

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát điều kiện phản ứng click 1-alkyne 13a và azide 7

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát các điều kiện xúc tác cho phản ứng click của azide14a4 với 1-alkyne 4 147

Bảng 3.19 Kết quả tổng hợp các hợp chất lai 1,2,3-triazole−isatin 19 147

Bảng 3.20 Các tương tác gần và xa trong phổ HSQC và HMBC của 19b4 154

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát điều kiện phản ứng với chất đại diện 20g5 157

Bảng 3.22 Kết quả tổng hợp các hợp chất lai 1,2,3-triazole−isatin 20 158

Bảng 3.23 Phổ 2D NMR HSQC và HMBC của hợp chất 20g5 159

Bảng 3.25 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số hợp chất

thuộc dãy chất 17a-m 162

Bảng 3.24 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế đối với một số vi sinh vật kiểm định 164

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ PHẢN ỨNGSơ đồ 2.1 Các phản ứng được sử dụng trong luận án 33

Sơ đồ 2.2 Con đường tổng hợp 1,2:3,4-di-O-isopropylidene-6-azido-6-deoxy-α-D

Sơ đồ 2.7 Con đường tổng hợp một số isatin thế (12a-l) từ aniline tương ứng 42

Sơ đồ 2.8 Con đường tổng hợp 5,7-dibromoisatin (12m) 44

Sơ đồ 2.9 Con đường tổng hợp (N-propargyl)isatin thế (13) 45

Sơ đồ 2.10 Con đường tổng hợp các hợp chất N-(ω-bromoalkyl)isatin (14) 49

Sơ đồ 2.11 Con đường tổng hợp các hợp chất N-(ω-azidoalkyl)isatin 15 56

Sơ đồ 2.12 Phản ứng click của các (N-propargyl)isatin thế (13) và

Sơ đồ 2.16 Phản ứng click của các azidoalkyl)isatin thế (15) và N-(ω-azidoalkyl)isatin và propargyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (8) 83

Hình 3.28 Phổ COSY của hợp chất 17a 136

Hình 3.29 Một phần phổ HSQC của hợp chất 17a (phần đường) 137

Hình 3.30 Một phần phổ HMBC của hợp chất 17a (phần đường) 137

Hình 3.31 Phổ ESI-MS của hợp chất đại diện 1,2,3-triazole 17a 138

Hình 3.44 Phổ HMBC giãn của hợp chất 19b4 (phần thơm) 153

Hình 3.45 Phổ HMBC giãn của hợp chất 19b4 (phần đường) 153

Hình 3.46 Phổ MS của hợp chất đại diện 19b4 156

MỞ ĐẦU

Isatin (1H-Indole-2,3-dione) là một indole nội sinh được tìm thấy trong não

của loài động vật có vú, mô ngoại biên và dịch của cơ thể [1] Isatin và các dẫn xuất của nó là một trong rất nhiều dãy chất hữu cơ được nghiên cứu một cách hệ thống về mặt hóa học cũng như các tác dụng dược lí [2] Các tài liệu tham khảo [3] chỉ ra rằng isatin và các dẫn xuất của nó thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý, như hoạt tính chống ung thư [4, 5], kháng khuẩn [6], kháng nấm [7], chống co giật [8], chống lao [9], kháng HIV [10], chống oxy hoá [11, 12], chống viêm [13, 14], gây tê [14], chống trầm cảm [15], v.v…… Trong hóa học, isatin cũng là nguồn nguyên liệu để tổng hợp nên nhiều hợp chất dị vòng như quinoline, indole,… Vì thế, hiện nay hóa học về isatin là một lĩnh vực nghiên cứu phát triển, với nhiều dẫn xuất isatin đã được tổng hợp.

Hoá học carbohydrate, đặc biệt là hoá học của các mono- và disaccharide, đã và đang được nghiên cứu một cách rộng rãi [16] Nhiều kiểu chuyển hoá nhằm gắn các nhóm chìa khoá vào khung carbohydrate đã được phát triển khá mạnh mẽ Nhiều loại phản ứng quan trọng của lớp hợp chất này được phát hiện và phát triển Nhiều hợp chất của chúng đã được tổng hợp dựa trên các phản ứng này và trong số này có nhiều chất thể hiện hoạt tính sinh học rất đáng chú ý [17] Việc gắn kết các dị vòng vào phân tử carbohydrate hứa hẹn mang lại nhiều tính chất mới, đặc biệt là các tính chất sinh học.

Các azide hữu cơ nhận được nhiều sự quan tâm đặc biệt trong việc tổng hợp và nghiên cứu, cùng với khả năng tiếp cận dễ dàng qua nhiều con đường tổng hợp [18] Hơn nữa, các azide hữu cơ có thể dễ dàng chuyển hoá thành các amine, isocyanate và các phân tử chứa nhóm chức khác, gần đây chúng còn nhận được sự quan tâm ngày càng tăng như là tác nhân phản ứng có giá trị và linh hoạt trong khái

niệm về “Hoá học click” (click chemistry) [19] Sự cộng hợp vòng hoá 1,3-lưỡngcực theo Huisgen được xúc tác bằng Cu(I) (HDC, Huisgen 1,3-DipolarCycloaddition) của các azide và các alkyne cuối mạch để tạo thành các dẫn xuất

1,2,3-triazole được sử dụng rộng rãi để tổng hợp nhân dị vòng này [20] Người ta đã thống kê rằng gần 100% các bài báo liên quan đến phản ứng click này có các ứng dụng trên nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng [21], như tổng hợp các phân tử sinh học (các amino acid không có nguồn gốc thiên nhiên), phân tách gel điện di hai

chiều, tổng hợp các triazole thế-1,4, biến đổi nhóm chức peptide với các triazole, biến đổi các sản phẩm thiên nhiên và dược phẩm thiên nhiên, khám phá các sản phẩm thiên nhiên, khám phá thuốc, tổng hợp các vòng lớn, biến đổi DNA và các nucleotide bằng nhóm kết nối triazole, sử dụng trong hoá học siêu phân tử

(supramolecular chemistry) [22].

Các dẫn xuất của dị vòng 1,2,3-triazole được sử dụng rộng rãi trong chữa bệnh, và hiện nay, việc nghiên cứu tổng hợp và thăm dò hoạt tính sinh học của chúng là một trong những lĩnh vực quan trọng nhất trong nghiên cứu và phát triển thuốc [23, 24] Có những công trình nghiên cứu đã chứng tỏ rằng, triazole có khả năng kháng lao và chống nấm rất tốt, đặc biệt khả năng chống nấm bội nhiễm [25], căn bệnh khá phổ biến ở những nước có khí hậu nóng ẩm như Việt Nam.

Với mục đích đóng góp thêm vào việc nghiên cứu tạo ra những hợp chất mới có hoạt tính sinh học, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài cho Luận án Tiến sĩ là

“Nghiên cứu tổng hợp và tính chất của một số hợp chất 1,2,3-triazol có chứađồng thời vòng isatin và hợp phần monosaccharide bằng phản ứng click”.

Các nhiệm vụ chính của luận án tiến sĩ như sau:

1 Tổng hợp một số các hợp phần monosaccharide chứa nhóm azide và

1-alkyne, như 1,2:3,4-di-O-isopropylidene-6-azido-6-deoxy-α-D-galactopyranose,1,2:3,4-di-O-isopropylidene-6-O-(2-propynyl)-α-D-galactopyranose,

2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl azide, 6-azido-6-deoxy-1,2,3,4-tetra-O-acetyl-α-D-glucose và propargyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside.

2 Tổng hợp các isatin thế bằng phản ứng Sandmeyer hoặc phản ứng thế electrophile vào vòng isatin và gắn nhóm cầu nối có độ dài mạch khác nhau vào vị trí N-1 của vòng isatin với nhóm 1-alkyne hoặc nhóm azido.

3 Thực hiện phản ứng click giữa isatin có chứa các cầu nối với các nhóm alkynyl hoặc azido đầu mạch với các hợp phần monosaccharide thích hợp ở mục 1.

5 Xác định cấu trúc của các hợp chất thu được bằng các phương pháp vật lí hiện đại như IR, NMR, MS.

6 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của một số dãy hợp chất 1,2,3-triazole.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Giới thiệu chung về isatin và dẫn xuất

Isatin (1H-indol-2,3-dione) là một dẫn xuất của nhóm indoline, là những hợp

chất chứa vòng pyrrolidine hợp nhất với benzene tạo thành 2,3-dihydroindole Isatin được biết đến lần đầu tiên vào năm 1841 [26, 27].

Trong tự nhiên, isatin được tìm thấy trong cây thuộc chi Isatis trong một loàiphong lan Clanthe discolor Lindl [28] và trong cây đầu lân Couroupita guianensis

Aublet [29], là thành phần của chất bài tiết từ tuyến mang tai của ếch [24] và ở người là một dẫn xuất để dẫn truyền adrenaline Các isatin thế cũng được tìm thấy trong thực vật, như các alkaloid melosatin (các methoxy phenylpentyl isatin) ở loài

Melochia tomentosa Hợp chất 6-(3′-methylbuten-2′-yl) isatin được phân lập từStreptomyces albus của loài vi khuẩn Chaetomium globosum [28] Isatin cũng có

mặt trong nhựa than đá [30].

1.2 Phương pháp tổng hợp các isatin thế

1.2.1 Phương pháp tổng hợp đi từ indigo

Năm 1841, hai nhà khoa học Erdman [26] và Laurent [27] đã nhận được isatin khi oxy hoá indigo bằng acid nitric và acid cromic Đây là phương pháp đầu tiên được sử dụng để tổng hợp isatin :

Phương pháp Sandmeyer là phương pháp lâu đời nhất và thông dụng nhất để tổng hợp isatin, bao gồm phản ứng của aniline (thế) với chloral hydrate và hydroxylamine hydrochloride trong dung dịch natri sulfate và sự vòng hoá isonitrosoacetanilide nhận được bằng acid sulfuric đặc Hiệu suất của quá trình tổng hợp isatin là >75% [31].

Phương pháp được sử dụng phổ biến do các tác nhân phản ứng rẻ tiền, có sẵn, cho hiệu suất khá cao (với các aniline chứa nhóm chức đẩy electron) Hiện nay, phương pháp Sandmeyer được cải tiến bằng sự kết hợp ethanol như là một đồng-dung môi Việc sử dụng lò vi sóng trong quá trình tổng hợp isatin theo Sandmeyer cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có thể sử dụng để tổng hợp convolutamydine A [32].

1.2.3 Phương pháp tổng hợp sử dụng nitroacetanilide

Nitroacetanilide nhận được từ phản ứng thủy phân 1-arylamino-1-methylthio-2-nitroethene trong môi trường kiềm và được đóng vòng thành isatin-3-oxime bằng acid sulfuric đậm đặc hoặc acid trifluoromethansulfonic ở nhiệt độ phòng với hiệu suất khá cao [33] Phương pháp gần giống với phương pháp Sandmeyer nhưng ít được sử dụng.

1.2.4 Phương pháp tổng hợp theo Martinet

Việc tổng hợp isatin theo Martinet bao gồm phản ứng của amine thơm, ester oxomalonate hoặc hydrate của nó khi có mặt của acid để cho dẫn xuất của acid 3-(3-hydroxy-2-oxindole)-carboxylic, mà sau khi oxy hóa-decarboxy hoá sẽ cho isatin tương ứng Phương pháp này được dùng để tổng hợp 5,6-dimethylisatin từ 4-aminoveratrole mà không nhận được khi đi từ 2,4-dimethoxyaniline Phương pháp này cũng dễ dàng được áp dụng cho tổng hợp dẫn xuất benzoisatin từ các dẫn xuất

1.2.5 Phương pháp tổng hợp theo Stolle

Đây là phương pháp quan trọng nhất để thay thế phương pháp Sandmeyer trong tổng hợp isatin Trong phương pháp này, các anilin phản ứng với oxalyl chloride để tạo thành chloro-oxalylanilide, sản phẩm trung gian này có thể được đóng vòng khi có mặt của acid Lewis, thường là AlCl3, TiCl4 hoặc BF3.Et2O [35] Phương pháp này được sử dụng để tổng hợp 1-aryl và isatin đa vòng có nguồn gốc từ phenoxazine, phenothiazine và dibenzoazepine cũng như indoline.

Acid Lewis: AlCl3, TiCl4, BF3.Et2O

1.2.6 Phương pháp tổng hợp theo Gassman

Một phương pháp khác được phát triển bởi Gassman để tổng hợp isatin [35] Phương pháp này bao gồm sự hình thành và oxy hóa tiếp theo của hợp chất trung gian 3-methylthio-2-oxindole hình thành isatin thế tương ứng với hiệu suất đạt từ 40-81% [36] Wright và cộng sự đã mô tả phương pháp cải tiến của Gassman để tổng hợp oxindole khi sử dụng sulfoxide có thể thay thế cho việc sử dụng sulfenyl

halide [37] Phương pháp của Gassman có thể được ứng dụng với loại hợp chất

1.2.7 Phương pháp tổng hợp sử dụng phản ứng kim loại hóa dẫn xuất anilide

Một phương pháp mới hiện nay được dùng để tổng hợp isatin trên cơ sở phản

ứng ortho-kim loại trực tiếp N-pivaloyl- và N-(t-butoxycarbonyl)aniline Các

dianion tương ứng được xử lí với diethyl oxalate và isatin thu được sau khi loại bỏ

nhóm bảo vệ và đóng vòng chất trung gian α-ketoester Phương pháp này có ưuđiểm là có tính chọn lọc để tổng hợp isatin thế ở vị trí 4 từ aniline thế meta [38].

Tổng hợp 5-azaisatin được thực hiện bằng phản ứng ortho-lithi hóa 4-aminopyridine t-butylcarbamate sau đó bằng phản ứng với lượng dư diethyl oxalate.

Xử lý nhiệt ester glyoxylic dưới chân không thu được 5-azaisatin.

Hiện nay, phương pháp trao đổi kim loại-halogen được mô tả để tổng hợp

isatin bằng phản ứng lithi hóa ortho-bromophenylureas, carbonyl hóa và đóng vòng

nội phân tử thu được sản phẩm với hiệu suất khá cao 71-79% [39].

Isatin kết tinh từ nước, rượu, hoặc acid acetic dưới dạng tinh thể hình kim màu đỏ, nóng chảy ở 200-201 oC [40] Nó tan được trong ethanol, acid acetic và benzene khi đun nóng nhưng ít tan trong ether, và cũng tan trong được dung dịch acid chlohydric và acid sulfuric đậm đặc Khi được hòa tan trong natri hydroxide hoặc dung dịch kali hydroxide thì muối natri hoặc kali của acid isatoic được tạo thành do sự mở vòng thành acid isatoic Sự đóng vòng xảy ra khi dung dịch được acid hóa và isatin kết tủa xuống.

1.4 Tính chất hóa học của isatin và dẫn xuất

Isatin có 3 trung tâm phản ứng: vị trí 1 (tấn công vào nguyên tử nitơ), vị trí C-5 và vị trí C-3 Nếu trong hệ vòng có chứa nhóm hút electron ở vòng benzene hoặc ở nguyên tử nitơ thì có thể tham gia phản ứng cả vào vị trí C-2.

Phản ứng N-alkyl hóa isatin thường được tổng hợp từ muối natri của isatin

với alkyl halide hoặc sulfate [41] Muối này được tổng hợp bằng phản ứng của isatin với NaH trong toluene hoặc DMF và đun hồi lưu [42], hoặc cũng có thể sử dụng kali carbonate khan trong DMF hoặc acetone [43] Việc sử dụng CaH2 trong

DMF đã được sử dụng để tổng hợp cả mono- và bis-N-alkylisatin [44, 45] Các hợp

chất này trước đó đã được tổng hợp sử dụng dihaloalkane và NaH trong dioxane [46, 47] hoặc DMF hoặc LiH Một phương pháp khác để tổng hợp 1-alkylisatin bao gồm phản ứng của isatin với alkyl halide trong hệ dung môi benzene-chloroform/50% aq KOH khi sử dụng tetrabutylammoni hydrogensulfate

như là chất xúc tác chuyển pha N-Propargylisatin thu được bằng phản ứng của

Radul O M và cộng sự sử dụng K2CO3 trong DMF để thực hiện phản ứng

N-alkyl hóa isatin bằng alkyl bromide và iodide và acyl chloride ở nhiệt độ phòng

và với alkyl chloride ở nhiệt độ cao hơn (70-80°C) mà không xảy ra phản ứng mở vòng.

Radul O M và cộng sự đã báo cáo kết quả tổng hợp N-alkylisatin bằng

phương pháp sử dụng xúc tác K2CO3 trong DMF.

Thực hiện phản ứng alkyl với dimethyl sulfate, alkyl bromide và iodide, acyl chloride trong 2-3h ở nhiệt độ phòng, thu được sản phẩm với hiệu suất cao.

1.4.2 Phản ứng N-aryl hóa

N-Arylisatin có thể thu được từ isatin với hiệu suất khá cao bằng phản ứng

với Ph3Bi(OAc)2/Cu(0) trong môi trường trơ hoặc aryl bromide và đồng oxide [48].

Tuy nhiên, cho đến hiện nay, phản ứng kiểu N-aryl hóa isatin rất ít được quan tâm

nghiên cứu.

1.4.3 Phản ứng N-methyleneamine hoá

Phản ứng Mannich được ứng dụng dễ dàng để chuyển hóa isatin Sản phẩm

của phản ứng này, N-aminomethylisatin (base Mannich), có thể thu được từ phảnứng của dẫn xuất N-hydroxymethyl bằng phản ứng với amine [49], hoặc phản ứngacetyl chloride thu được N-chloromethylisatin, tiếp tục xử lí với potassiumphthalimide hoặc alcohol thu được sản phẩm tương ứng là N-phthalimidomethylhoặc N-alkoxymethylisatin Phản ứng Mannich có thể được thực hiện với dẫn xuất

của isatin, chẳng hạn như isatin-3-hydrazone [50] và isatin-3-thiosemicarbazone.

1.4.4 Phản ứng N-acyl và N-sulfo hóa

Các N-acylisatin có thể được tổng hợp dưới các điều kiện phản ứng khác khi

sử dụng acyl chloride hoặc anhydride Acid perchloric trong benzene, triethylamine trong benzene, pyridine trong benzene [51] hoặc triethylamine trong chloroform có thể được sử dụng như là chất xúc tác Muối natri của isatin trong toluene phản ứng thế với acyl chloride khi đun nóng hồi lưu [31] Việc sử dụng diacyl chloride như oxalyl [52], octanedioyl hoặc nonanedioyl chloride [53] sẽ thu được bis-acylisatin Nỗ lực để sử dụng 2,2-dimethylmalonyl chloride để tổng hợp 2,2-dimethylmalonyl-bis-isatin thất bại và hình thành hợp chất 3 vòng bất thường, đã được xác định bằng phương pháp phổ và X-Ray.

Tương tự, dimer có thể được hình thành trong phản ứng acetyl hóa của indolylglyoxalate với anhydride acetic trong pyridine.

Việc xử lí isatin với natri hypochlorite trong acetic acid thu được 1-chloroisatin, một tác nhân oxy hóa trung bình để chuyển alcohol thành aldehyde và ketone [54] và indole thành 3-chloroindole mà không hình thành sản phẩm phụ

[55] N-Phenyl-iodo (III)-bis-isatin có thể nhận được từ dạng muối natri của isatin

với phenyl iodo (III)-bis-trifluoroacetate với hiệu suất 85%.

1.4.6 Phản ứng thế electrophile vào vòng thơm

Mặc dù các isatin thế bị tấn công vào vòng thơm thường được tạo thành từ các aniline tương ứng, chúng có thể được tổng hợp bằng phản ứng thế electrophile trong vòng thơm, đặc biệt khi muốn đưa các nhóm thế hút electron (như nhóm nitro) vào vòng thơm Sự nitro hóa isatin bằng hỗn hợp acid nittric-acid sulfuric sẽ tạo thành 5-nitroisatin [56] Nhiệt độ cần được kiểm soát tốt, nếu không một hỗn hợp các sản phẩm nitrate sẽ được tạo thành [57] Một số dẫn xuất khác của isatin có thể được tổng hợp bằng phản ứng thế electrophile Phản ứng brom hóa isatin trong alcohol thu được 5,7-dibromo-3,3-dialkoxyoxindole trong xúc tác acid [40] Dạng

monobromoisatin ở vị trí 5 có thể thu được bằng cách sử dụng N-bromoacetamide

trong acetic acid [58] Hiện nay, 4,6-dibromoisatin, một chất trung gian chìa khóa

trong tổng hợp convolutamydine A, được tổng hợp bằng phản ứng brom hóa dẫn xuất 5-aminoisatin trong ethanol [49].

Triazole là hợp chất dị vòng với công thức phân tử C2H3N3, là một dị vòng năm cạnh của hai nguyên tử carbon và ba nguyên tử nitơ [59].

Các 1,2,3-triazole được có thể được tổng hợp bằng cách sử dụng phản ứng azide-alkyne theo Huisgen, trong đó azide hữu cơ và alkyne trải

qua phản ứng cộng lưỡng cực-1,3 Đó là một cấu trúc có sự ổn định cao hơn so với các hợp chất hữu cơ khác với ba nguyên tử nitơ liền kề 1,2,3-Triazole được sử dụng trong nghiên cứu các hợp chất hóa học phức tạp hơn, bao gồm các dược phẩm như tazobactam.

1.5.1 Tính chất của 1,2,3-triazole

Từ dữ kiện về sự phân bố mật độ electron trong vòng 1,2,3-triazole đã cho thấy rõ tính “trơ” trên các nguyên tử carbon của nó đối với các tác nhân electrophil và về tính base yếu của nó (pKa=1,17) Bên cạnh tính base yếu, các 1,2,3-triazole cũng biểu hiện tính acid yếu.

Tuy nhiên vòng 1,2,3-triazole rất bền vững Nhiều dẫn xuất của nó được cất ở áp suất thường và nhiệt độ cao mà không bị phân hủy Khi đun nóng tới 250 oC thì 1-benzoyl-4,5-diphenyl-1,2,3-triazole chuyển hóa thành 2,4,5-triphenyl oxazole.

1.5.2 Tổng hợp 1,2,3-triazole

Do các ứng dụng rộng rãi của nó, hợp chất 1,2,3-triazole đã là một chủ đề nghiên cứu sâu rộng Một số phương pháp quan trọng được sử dụng để tổng hợp bao gồm sự cộng đóng vòng-1,3 theo Huisgen, sự cộng đóng vòng-1,3 được xúc tác bằng kim loại, sự cộng đóng vòng azide-alkyne cải tiến, và sự tổng hợp 1,2,3-triazole không-kim loại [60].

1.5.2.1 Cộng đóng vòng 1,3- theo Huisgen

Cộng đóng vòng-1,3 theo Huisgen là phương pháp đơn giản nhất và tiết kiệm nhất để tổng hợp 1,2,3-triazole Tuy nhiên, nhiệt độ phản ứng cao và độ chọn lọc kém (tạo ra hai đồng phân thế-1,4 và thế-1,5) làm cho phương pháp này không thích hợp để sử dụng rộng rãi.

1.5.2.2 Cộng đóng vòng 1,3- xúc tác kim loại

Sharpless và cộng sự đã đưa ra thuật ngữ hoá học click (click chemistry) vào

năm 2002 khi công bố kết quả về việc sử dụng chất xúc tác đồng cho kiểu phản ứng azide-alkyne theo Huisgen [61] Phản ứng này có nhiều ưu điểm như phạm vi sử dụng cơ chất rộng rãi, tiết kiệm chi phí, có tính chọn lọc tốt, có hiệu suất cao và các điều kiện phản ứng êm dịu.

Năm 2005, Fokin và cộng sự đã nghĩ ra phương án tiếp cận hiệu quả cho việc tạo ra sản phẩm 1,2,3-triazole thế-1,5 bằng cách sử dụng xúc tác dạng phức rutheni

Nhóm nghiên cứu của McNulty và cộng sự đã báo cáo kết quả nghiên cứu sử dụng xúc tác Ag(I) để tổng hợp 1,2,3-triazole thế 1,4- ở nhiệt độ phòng [64] Năm

Ngoài ra, Sun và cộng sự cũng đã báo cáo việc sử dụng xúc tác iridium cho phản ứng IrAAC đối với alkyne giàu electron [66].

1.5.2.3 Cộng đóng vòng azide-alkyne cải tiến

Mặc dù phản ứng click có nhiều ưu điểm trong tổng hợp hữu cơ, song việc sử dụng kim loại gây ra những vấn đề nghiêm trọng về hệ thống sinh học dẫn đến gây độc tế bào Nhóm của Bertozzi đã khám phá ra một qui trình thú vị gọi là cộng đóng vòng azide-alkyne cải tiến Phản ứng này xảy ra đối với một alkyne vòng lớn, tiến hành ở điều kiện thường mà không cần sử dụng xúc tác kim loại [67].

1.5.2.4 Tổng hợp 1,2,3-triazole chất xúc tác không-kim loại

Phản ứng sử dụng xúc tác hữu cơ thu hút sự quan tâm trong tổng hợp 1,2,3-triazole sử dụng enamine, enolate như là các dipolarophile Bên cạnh đó, alkene hoạt hóa cũng được sử dụng làm cơ chất hữu ích cho sự hình thành vòng 1,2,3-triazole Ramachary và cộng sự đã sử dụng xúc tác L-proline trong tổng hợp

1,2,3-triazole bằng phản ứng đóng vòng [3+2] thông qua enamine trung gian [68]

Wang và cộng sự sử dụng chất xúc tác hữu cơ diethylamine để tổng hợp 1,2,3-triazole thế từ azide và allyl ketone [70].

Ngoài ra, iodine cũng được sử dụng làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp 1,2,3-triazole thế 1,5- đã được báo cáo bởi Wan sử dụng amine bậc 1, enamine và

1.5.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất 1,2,3-triazole

Hợp chất 1,2,3-triazole ổn định và dễ dàng tạo liên kết hydro do đó tăng độ hòa tan, tạo điều kiện cho sự liên kết với các thụ thể sinh học Do các đặc tính độc đáo của chúng, 1,2,3-triazole rất thu hút đối với các nhà nghiên cứu về hóa dược

1.5.3.1 Hoạt tính chống ung thư

Ung thư là một bệnh nguy hiểm cho sức khỏe của cộng đồng, là nguyên nhân thứ hai gây tử vong toàn cầu Có rất nhiều các công trình công bố của Kallander, Odlo, Rangappa [72-74] cho thấy, các hợp chất có chứa vòng 1,2,3-triazole thể hiện khả năng chống ung thư rất tốt.

1.5.3.2 Hoạt tính kháng viêm

Nhóm tác giả Jung và cộng sự đã tổng hợp đưuọc 24 hợp chất dẫn xuất của

phenyl-1H-1,2,3-triazole có hoạt tính sinh học đáng chú ý Ở cùng mức liều 25 mg/

kg, có 9 hợp chất thể hiện khả năng chống viêm tốt hơn thuốc chống viêm hiện tại là diclofenac [75] Yar và cộng sự báo cáo rằng, các dẫn xuất của

indole-3-glyoxamide gắn với 1,2,3-triazole có khả năng chống viêm ở dạng in vivo tốt Có 2

hợp chất thể hiện khả năng chống viêm tuyệt với giá trị IC50 thấp (0,12 µM) [76].

1.5.3.3 Hoạt tính kháng lao

Bệnh lao là bệnh gây ra bởi vi khuẩn mycobacterium tuberculosis, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm đối với sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới Các tác giả Labadie, Boechat và các cộng sự đã báo cáo một số hợp chất dẫn xuất của 1,2,3-triazole có khả năng kháng vi khuẩn lao tốt hơn thuốc tiêu chuẩn, với giá trị MIC rất có ý nghĩa [77, 78] Kantevari và Zhang cũng đã tổng hợp được một số hợp chất lai giữa 1,2,3-triazole và các dị vòng khác cho thấy, có một số hợp chất

thể hiện khả năng chống lại M tuberculosis H37Rv với MIC=0,78 µg/mL [79, 80].

1.5.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn

Một số 1,2,3-triazole của chalcone và flavone thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể [81] Các theophylline chứa vòng 1,2,3-triazole với dẫn xuất nucleoside thể

hiện hoạt tính kháng khuẩn, chống lại B cereus, Escherichia coli và P aureoginosa

với giá trị MIC lần lượt là 0,0156; 0,03125 và 0,0625 mg/mL Một hợp chất khác có

giá trị MIC lần lượt là 0,0325; 0,0156 và 0,0625 mg/mL chống lại các chủng S.aureus, B cereus và Escherichia coli [82] Zhou và cộng sự báo cáo một dãy

1,2,3-triazole thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt Trong đó, một hợp chất có hoạt tính

kháng vi khuẩn Escherichia coli tốt hơn so với Norfloxacin và Chloromycin [83].1.5.3.5 Hoạt tính kháng virus

Boechat và cộng sự đã báo cáo kết quả tổng hợp các 1,2,3-triazole bắt chước theo cấu trúc của nucleoside ribacirin và nghiên cứu hoạt tính sinh học của chúng Có một hợp chất trong đó thể hiện khả năng kháng virus cúm A và virus HIV-RT với giá trị IC50 lần lượt là 14 và 3,8 µM [84] Hợp chất có cấu trúc bắt chước ribavirin (1,2,3-triazole nucleoside thế 4,5) được tổng hợp bởi Zeidler và cộng sự thể hiện hoạt tính đáng quí Hợp chất 5-ethynyl nucleoside thể hiện khả năng kháng virus cúm H1N1, H3N2 và H5N1, cúm B, virus sởi và virus hợp bào hô hấp [85].

Nhóm nghiên cứu của Ding và cộng sự nhắm mục tiêu vào nucleoprotein của

virus và tổng hợp dẫn xuất 1,2,3-triazole-4-carboxamide để phát triển thuốc chống virus cúm Họ đã tìm được một hợp chất ức chế sự sao chép của virus cúm A H3N2 và H1N1 với giá trị IC50 lần lượt là 0,5 và 4,6 µM [86].

1.6 Tổng quan về phản ứng click

1.6.1 Khái quát chung về phản ứng click

“Hóa học click” được K Barry Sharpless đặt ra vào năm 1998 và được Sharepless, Hartmuth Kolb và M.G Finn mô tả năm 2001 Theo đó, các phản ứng có năng suất cao, phạm vi rộng, chỉ tạo ra những sản phẩm phụ có thể loại bỏ được mà không cần sắc kí, đều có độ tinh khiết, đơn giản để thực hiện và có thể tiến hành dễ dàng là mục tiêu của Hóa học click Lĩnh vực nghiên cứu về phản ứng click gọi là Hóa học click, miêu tả các quá trình kết nối những cấu trúc nhỏ lại với nhau thành những cấu trúc lớn hơn bằng phản ứng hóa học.

Phản ứng click điển hình là phản ứng giữa một azide hữu cơ và một alkyne đầu mạch dẫn đến sự tạo thành của dị vòng 1,2,3-triazole thế Phản ứng được xúc tác bằng các chất xúc tác như đồng, từ Cu(0) đến các oxide của chúng hoặc ở dạng tự do, phức chất hoặc được mang trên các chất mang khác nhau.

Phản ứng click cổ điển là sự cộng hợp vòng hoá azide-alkyne được xúc tác

bằng Cu(I) (CuAAC, Cu(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition) giữa azide và

alkyne để tạo thành một dị vòng 5 cạnh, được A Michael được đầu tiên vào năm 1893 [22, 87] và được Huisgen phát triển [61] Quá trình phản ứng của các azide hữu cơ và các alkyne đầu mạch xảy ra theo sơ đồ phản ứng chung sau:

Sự xúc tác Cu(I) của phản ứng cộng hợp vòng hoá 1,3-lưỡng cực được hai phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ phát hiện đồng thời và độc lập, đó là nhóm của

V.V Fokin và K.B Sharpless ở Học viện Nghiên cứu Scripps (California, Mỹ) [61] và Morten Meldal ở Phòng thí nghiệm Carlsberg, Denmark [88] Phương pháp sử dụng chất xúc tác Cu(I) của phản ứng trên cho chỉ các đồng phân thế-1,4, trong khi đó, sự cộng hợp vòng hoá 1,3-lưỡng cực không được xúc tác của Huisgen cho cả hai đồng phân thế -1,4 và -1,5 và phản ứng chậm và đòi hỏi nhiệt độ cao (100°C).

Năm 2011, tác giả Leeber B W và cộng sự nghiên cứu một loại xúc tác mới sử dụng trong phản ứng click, đó là xúc tác sử dụng vật liệu MOFs Trong số các MOFs được quan tâm nghiên cứu thì Cu/MOF-5 được quan tâm nhất, xúc tác hiệu quả cho phản ứng click giữa azide với alkyne-1 Để chuẩn bị Cu/MOF-5, người ta tiến hành phản ứng của imidazole với dung dịch đồng (II) nitrate sau đó bổ sung thêm dung dịch NaOH Kết tủa thu được được lọc và rửa với ethanol, sấy khô thu được sản phẩm Cu/MOF-5.

Lĩnh vực nghiên cứu về phản ứng click miêu tả các quá trình kết nối những cấu trúc nhỏ lại với nhau thành những cấu trúc lớn hơn bằng phản ứng hóa học Giống như các chu trình tổng hợp trong tự nhiên, các phân tử lớn đều được hình thành từ những phần nhỏ hơn, đây chính là ý tưởng hình thành nên phản ứng click.

1.6.2 Phân loại phản ứng click

Các phản ứng click nói chung, được phân thành 4 loại chủ yếu [89]:

a Sự cộng hợp vòng hoá: Loại này chủ yếu là sự cộng hợp vòng hoá

1,3-lưỡng cực của các azide và alkyne-1, bao hàm cả cộng hợp vòng hoá Diels-Alder

b Sự mở vòng nucleophile: Chủ yếu các electron dị vòng có sức căng, như

aziridine, epoxide, sulfate vòng, ion aziridinium, ion episulfonium,

c Hoá học carbonyl có kiểu không-aldol: Các phản ứng bao gồm sự tạo

thành thioure, hydrazone, oxime, urea, ether, amide, các dị vòng thơm,…Các phản ứng carbonyl dạng aldol nói chung có các lực dẫn động nhiệt động học thấp, nên chúng có thời gian phản ứng dài hơn và cho các sản phẩm phụ, và do đó, không được coi là phản ứng click

d Sự cộng hợp vào các liên kết bội carbon-carbon: Các phản ứng bao hàm

các phản ứng oxy hoá như phản ứng epoxy hoá, sự arizidine hoá, sự cộng hợp nitrosyl halide, sự cộng hợp sulfenyl halide, và một số cộng hợp Michael

Trong số bốn kiểu chủ yếu này, sự cộng hợp vòng hoá, đặc biệt là sự cộng

hợp vòng hoá lưỡng cực Huisgen được xúc tác bằng Cu(I) (HDC, Huisgen

1,3-Dipolar Cycloaddition) của các azide và các alkyne cuối mạch để tạo thành các

1,2,3-triazole được sử dụng rộng rãi nhất

Kiểu cộng hợp vòng hoá 1,3-lưỡng cực Huisgen ở trên lại được phân loại thành các loại sau:

- Phản ứng cộng hợp vòng hoá azide-alkyne được xúc tác bằng Cu(I)

[CuAAC, Cu(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition] giữa azide và alkyne để tạothành một dị vòng 5 cạnh, 1,2,3-triazole thế 1,4-di thay vì gồm cả đồng phân thế1,5-di trong phản ứng cộng hợp 1,3-lưỡng cực dưới tác dụng của nhiệt của Huisgen.

- Phản ứng cộng hợp vòng hoá azide-alkyne được xúc tiến bằng sức căng

vòng (SPAAC, Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition), trong phản ứng loại

này, thay vì sử dụng Cu(I) để hoạt hoá alkyne, người ta sử dụng một alkyne có sức căng, như difluorocyclooctyne, trong đó các nhóm thế gem-difluor hút electron mạnh ở vị trí propargylic hoạt động cùng nhau với sức căng vòng để làm mất ổn định đáng kể alkyne

- Phản ứng cộng hợp vòng hoá alkyne-nitron được xúc tiến bằng sức căng vòng của các cyclooctyne thế diaryl có sức căng, bao gồm dibenzylcyclooctyne

(DIBO) đã được sử dụng để phản ứng với các 1,3-nitron (SPANC, StrainpromotedAlkyne Nitrone Cycloaddition) để cho các N-alkyl isoxazoline

- Phản ứng của các alkene có sức căng, chẳng hạn, các trans-cycloalkene (thường là các cyclooctene) và các alken có sức căng như oxanorbornadiene được sử dụng trong phản ứng click với một số tác nhân như các azide, tetrazine và tetrazole Loại phản ứng này bao hàm sự cộng hợp vòng hoá [3+2] của alkene và azide phản ứng Diels-Alder nghịch đảo của alkene và tetrazine và phản ứng quang hoá-click của alkene và tetrazole

Trong số các kiểu phản ứng “click” để tạo ra dị vòng 1,2,3-triazole thì phản

ứng của các alkyne đầu mạch với các azide, đặc biệt là các azide hữu cơ được các nhà tổng hợp hữu cơ quan tâm bởi vì sự dễ dàng xảy ra của phản ứng với hiệu suất

cao Ngoài các hợp chất kiểu O-, S- và N-glucoside của monosaccharide với các

amin dị vòng (indole, imidazole, quinoline, quinazoline, pyrimidine, pyridine ) [90] các glycosylamin đã được quan tâm nghiên cứu cả về mặt lí thuyết cũng như thực nghiệm Trong thời gian gần đây đã có một số công bố đề cập đến phản ứng click ở các monosaccharide, trong đó, natri azide được sử dụng làm hợp phần azide

thay vì azide hữu cơ thông thường, trong phản ứng với các O-propargyl glycoside

[91, 92].

1.6.3 Đặc điểm của phản ứng click

Phản ứng click có rất nhiều ưu điểm, bao gồm: Sử dụng nguyên liệu và thuốc thử có sẵn, điều kiện phản ứng đơn giản (không nhạy với oxy hay nước), phản ứng không cần dung môi hay dung môi ôn dịu (nước, methanol) hay dung môi dễ tách loại sau phản ứng, cô lập sản phẩm dễ dàng bằng kết tinh hay lọc, phản ứng bền

trong điều kiện sinh lí [89] Yêu cầu để một phản ứng được gọi là “click” là phản

ứng được ứng dụng linh động trong phạm vi rộng, cho hiệu suất phản ứng cao, chỉ tạo ra sản phẩm phụ không độc hại và dễ tách loại, phản ứng có tính chọn lọc lập thể.

Cơ chất alkyne và azide sử dụng trong phản ứng click ảnh hưởng nhiều đến khả năng phản ứng Điều đáng quan tâm là các azide phân tử có trọng lượng phân tử thấp có thể gây nguy hiểm trong thực nghiệm, đặc biệt là có đôi khi sản phẩm không thể phân lập được từ dung môi Một số dẫn xuất được tạo ra bởi phản ứng SN2 từ halide hữu cơ hoặc arylsulfonate và natri azide trước khi xảy ra phản ứng click [93].

Ảnh hưởng của nhóm thế đối với phản ứng click là rất đáng được quan tâm nhưng phản ứng CuAAC nói chung thuận lợi đối với nhiều azide và alkyne Matyaszewski và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm thế đến tốc độ phản ứng và kết luận rằng, phản ứng nhanh nhất đối với các azide có nhóm hút electron [94, 95] Alkyne với nhóm carbonyl ở vị trí alpha hoạt động mạnh hơn cho phản ứng Huisgen Họ đã chỉ ra rằng, độ tan của cơ chất là yếu tố quyết định đến hiệu suất phản ứng Tuy nhiên, phản ứng Huisgen không sử dụng xúc tác giữa alkyne và azide diễn ra trong nước ở nhiệt độ phòng với cơ chất không tan trong trường hợp alkyne thiếu electron như carboxyethyl-acetylene [96].

Dung môi sử dụng cho phản ứng CuAAC rất đa dạng, là một trong những điểm đáng chú ý nhất của phản ứng này [88] Các dung môi có thể sử dụng bao gồm: toluene, chloroform, dichloromethane, THF, pyridine, dioxane, acetone, MeCN, DMF, DMSO, alcohol và hỗn hợp dung môi như nước với alcohol, acetone, THF, MeCN, DMSO, dioxane hoặc có thể là hỗn hợp 3 dung môi CuSO4 và natri ascorbate và xúc tác Cu(0) được sử dụng với nhiều loại dung môi, trong khi đó xúc tác Cu(I) được sử dụng trong dung môi không chứa nước trong hầu hết các trường

hợp Dung môi DMF là một dung môi tối ưu để tiến hành phản ứng click sử dụng xúc tác CuBr mà không cần gắn thêm phối tử Trong sự có mặt của phối tử polyamine, toluene sử dụng cho hiệu suất tốt bởi nó giúp hòa tan tốt cả xúc tác và cơ chất mà không ức chế sự kết hợp Phản ứng của propargyl alcohol với benzyl azide sử dụng phức alkynyl-Cu(I) với 0,1% khối lượng, tiến hành trong lò vi sóng thu được triazole với hiệu suất 72% [97].

1.6.4 Ứng dụng của phản ứng click

Phản ứng click có tính ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực.

1.6.4.1 Tổng hợp hữu cơ

Phản ứng CuAAC được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ bao gồm nhiều loại đại phân tử Các nhà hóa hữu cơ đã nghiên cứu mở rộng phản ứng CuAAC khi hợp với các loại phản ứng khác, chẳng hạn như chuyển hóa allyl với xúc tác Pd(0), phản ứng Heck với xúc tác Pd(OAc)2 [98] Một số phản ứng được sử dụng để tổng hợp hợp chất spiro có liên quan đến phản ứng aldol, Wittig, Knoevenagel, cộng Michael và Diels-Alder sau đó là phản ứng CuAAC [99].

Triazole là kiểu chất bắt chước các liên kết peptide có thể cung cấp khả năng ức chế tức thời đối với protease của động vật có vú, vi khuẩn và virus [100] Các sản phẩm tự nhiên và thuốc được biến tính với triazole để tăng độ hòa tan và sinh khả dụng nhằm mục đích đa dạng hóa cấu trúc của thuốc [93, 95] Mặc dù vòng đại phân tử (từ 8 đến 14 nguyên tử) là cực kỳ khó để tạo thành, tuy nhiên lại rất đơn giản với phản ứng CuAAC.

Sự hình thành triazole là hữu ích để cố định xúc tác Liên kết triazole cho phép tổng hợp calixarene có chứa nhóm chức carbohydrate [101] và để liên hợp với tryptophane để liên kết với 129Xe và theo dõi NMR [102] Sự hình thành triazole được sử dụng để tổng hợp rotaxanes [103, 104] Triazole có thể biến tính đường với

nhóm hữu cơ hình thành dạng “cluster”, liên kết tạo đa phân tử và tạo ra

glycopeptide và oligosaccharide [88].

1.6.4.2 Dendrimera Tổng hợp dendrimer

Tổng hợp dendrimer bằng phản ứng CuAAC đã xuất hiện trong thời gian gần đây, bao gồm các phản ứng tổng hợp vật liệu hữu cơ bằng click Năm 2004, Wu và cộng sự [105] đã báo cáo phản ứng tổng hợp dendrimer với triazole ở các điểm

phân nhánh Nguyên tử ở nhánh được chuyển hóa thành azide bằng phản ứng với natri azide, sau đó chuyển hóa thành triazole bằng phản ứng click.

b Tạo các nhóm chức trên bề mặt dendrimer

Cấu trúc phân kỳ có thể được tạo thành từ dendrimer ban đầu bằng cách lặp lại các phản ứng như trong sơ đồ dưới đây Các phản ứng đều được tiến hành bằng CuAAC Cấu trúc phân kỳ của các dendrimer là rất hữu ích trong việc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực [106] Chúng cho phép phân tử mang một lượng lớn các đoạn phân tử đến các vị trí mong muốn Các hợp chất tổng hợp bằng click cho thấy có hoạt tính sinh học đáng chú ý như dendrimer peptide [107], glycodendrimer [108, 109].

Việc đưa các chất xúc tác vào phản ứng click đã được khảo sát ở một số trường hợp [110, 111] Caminade-Majoral và cộng sự đã ghép tới 48 phối tử azabis(oxazoline) vào alkyne tạo thành dendrimer chứa hợp phần azide [112].

1.6.4.3 Polymer

a Polymer tạo thành từ phản ứng click

Từ năm 2004, lĩnh vực polymer đã khai thác phần lớn các phản ứng CuAAC nhằm biến tính polymer [95] Điều kiện phản ứng CuAAC dễ dàng hơn nhiều so với các loại phản ứng truyền thống khác, vật liệu thu được sạch hơn, tinh chế dễ dàng hơn và các phản ứng không hoàn toàn xảy ra ít hơn Các polymer mạch thẳng, bao gồm polymer đa khối, liên kết ngang đã được tổng hợp bởi CuAAC.

b Phản ứng click với dendrimer để liên hợp sinh học trong đại phân tử

Sự liên hợp sinh học của các dendrimer sử dụng hóa học click là một lĩnh vực hứa hẹn và đang rất được quan tâm hiện nay [113, 114] Cầu triazole ổn định về mặt sinh học và đã có nhiều đại phân tử sinh học được tổng hợp thành công [115] Dendrimer dẫn thuốc đã được nghiên cứu, chẳng hạn acid folic gắn kết với dendrimer và fluorescein isothocyante gắn kết với dendrimer Hai module dendrimer khác nhau được ghép với nhau thông qua phản ứng CuAAC của hợp phần alkyne trên dendrimer này với hợp phần azide của dendrimer kia [22].

c Phản ứng click trong polymer dendritic và polymer tuyến tính

Polymer “dendritic star” là cấu trúc lai giữa dendrimer và polymer “star” Chúng mang đặc tính của cả thành phần tạo nên nó ở cả tính chất vật lí và hóa học Chúng có tiềm năng ứng dụng làm chất ổn định cho keo, giải phóng DNA, sắc kí mao quản điện động học [].

1.6.5 Cơ chế phản ứng

Phản ứng Huisgen azide-alkyne xảy ra theo cơ chế cộng đóng vòng 1,3-lưỡng cực Phản ứng này tỏa nhiệt nhiều nhưng do hàng rào năng lượng hoạt hóa cao dẫn đến phản ứng xảy ra rất chậm mặc dù tiến hành ở nhiệt độ cao Một nhược điểm khác là phản ứng sinh ra hai đồng phần với tỷ lệ xấp xỉ 1:1 (kiểu thế 1,4 và 1,5) [61]

Bên cạnh đó, xúc tác rutheni cũng được sử dụng hiệu quả trong phản ứng click (RuAAC), nhưng thay vì tạo ra sản phẩm thế 1,4- thì việc sử dụng xúc tác rutheni tạo ra sản phẩm thế 1,5- Hơn nữa, sử dụng xúc tác rutheni có thể tiến hành phản ứng click giữa azide với alkyne không chứa nối 3 đầu mạch [116].

Cơ chế phản ứng click khi sử dụng chất xúc tác đồng diễn ra như sau [117]:

1.7 Sử dụng siêu âm trong tổng hợp hữu cơ

Các phương pháp truyền thống để thực hiện các phản ứng tổng hợp hữu cơ phải đối mặt với những hạn chế như thời gian phản ứng, hiệu suất không đạt yêu cầu, sử dụng nhiều dung môi hơn, cần nhiệt độ cao Việc sử dụng các hệ thống không đồng nhất làm phát sinh các vấn đề kháng chuyển khối tùy thuộc vào số lượng và loại pha có mặt, cũng như dẫn đến sự kết tụ của các hạt, làm giảm diện tích bề mặt và cuối cùng làm chậm tốc độ phản ứng Để khắc phục các vấn đề này thì việc sử dụng siêu âm là một phương pháp hiệu quả về chi phí, để tăng cường các phản ứng khác nhau, chẳng hạn như phản ứng đồng thể trong nước và dung môi không-nước, phản ứng dị thể, phản ứng chuyển pha, khung kim loại-hữu cơ, enzyme sinh học, v.v… [118].

Siêu âm, với tần số giữa 20 kHz cho đến vài gigahertz, có lợi để tăng tốc các phản ứng hóa học bằng cách cải thiện hiệu suất, làm giảm thời gian phản ứng cũng như tăng tính chọn lọc [119] Vì thế, siêu âm là một cách tiếp cận mới trong tổng hợp hữu cơ trong vài thập kỷ qua Hơn nữa, việc sử dụng siêu âm có lợi cho các hoạt động qui mô phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ cũng như cho mục đích thương mại [119] Trong sản xuất dược phẩm, siêu âm giúp làm tăng hiệu suất và dễ dàng sử dụng cho một hệ thống lớn trong công nghiệp Trong lĩnh vực phát triển xúc tác, siêu âm tạo ra được bề mặt có diện tích lớn vì thế làm tăng hoạt tính của chất xúc tác Siêu âm còn tạo ra vật liệu với những đặc tính đặc biệt nhiệt độ cao và áp suất lớn, kết hợp với tốc độ làm lạnh nhanh cho phép những nhà nghiên cứu tổng

hợp được những chất rắn đặc biệt mà không thể điều chế được bằng những con đường khác [118].

1.8 Sử dụng vi sóng trong tổng hợp hữu cơ

Việc sử dụng bức xạ có bước sóng cực ngắn đang trở thành một phương pháp làm nóng ngày càng thông dụng để thay thế phương pháp đun nóng cổ điển [120, 121] Ưu điểm chính của phương pháp này là rẻ, sạch và thuận tiện, mang lại hiệu suất cao hơn và thời gian phản ứng ngắn Hiện nay, nó đã được mở rộng tới hầu hết các lĩnh vực của hoá học, tuy nhiên trong hoá học carbohydrate thì chậm hơn [122, 123].

Trong lò vi sóng, tác nhân kích hoạt là sự bức xạ của các tia sóng cực ngắn Phản ứng hoá học sử dụng vi sóng dựa trên hiệu ứng nhiệt của vật liệu và hiệu ứng nhiệt điện môi vi sóng Hiện tượng này phụ thuộc vào khả năng hấp thụ năng lượng vi sóng và chuyển hoá nó thành nhiệt (dung môi hoặc tác nhân) Khả năng một chất chuyển hoá năng lượng điện từ thành nhiệt ở một tần số và nhiệt độ được xác định

bằng số phần tử bị mất gọi là tan δ [124], được diễn tả như sau: tan δ = ε′/ε, trong

đó: ε′ là đại lượng điện môi mất đi, đại diện cho hiệu suất bức xạ chuyển thành nhiệt; ε là hằng số điện môi, biểu thị khả năng các phân tử bị phân cực trong trường điện từ Trong đa số các trường hợp, tốc độ phản ứng được thúc đẩy là do ảnh hưởng của động năng đến nhiệt độ Nhiệt độ này có thể đạt được khá nhanh khi vật liệu phân cực bức xạ trong trường sóng ngắn Tốc độ phản ứng được đẩy mạnh khi so sánh giữa phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng với nhiệt độ đun hồi lưu cách dầu và quá trình nhiệt trong lò vi sóng Dựa vào định luật Arrhenius:

k=A.exp(-Ea/RT) người ta thấy rằng cần 68 ngày để đạt được 90% chuyển hoá ở

nhiệt độ 27°C nhưng để đạt độ chuyển hoá tương đương trong 1,61 giây thì phải thực hiện ở nhiệt độ 227°C.

Ngoài nhiệt độ, một vài ảnh hưởng khác là có thể Các tác động ngoài nhiệt là kết quả của việc tương tác trực tiếp giữa trường điện với các phân tử, đặc biệt trong môi trường phản ứng Sự có mặt của điện trường gây ra ảnh hưởng định hướng của các phân tử lưỡng cực và do đó làm thay đổi năng lượng hoạt hoá (đại lượng entropy) trong phương trình Arrhenius Một tác động tương tự xảy ra với cơ chế phản ứng có cực, ở đây, sự có cực tăng lên từ trạng thái đầu tới trạng thái chuyển tiếp, dẫn đến làm thúc đẩy sự hoạt hóa nhờ việc giảm năng lượng hoạt hoá.

Các lĩnh vực khác của hoá học carbohydrate như là tổng hợp monosaccharide có chứa nhân dị vòng không no hoặc các nhóm halogen cũng được đề cập đến Việc tạo thành các chất quang hoạt, polysaccharide, methanol phân và thuỷ phân các saccharide, việc hình thành các gốc từ tương tác của đường với các acid amin cũng xảy ra Trong nhiều trường hợp, so sánh kết quả cho thấy phương pháp dùng lò vi sóng cho kết quả tốt hơn [125, 126].

Ngày nay, công nghệ không dùng dung môi là rất phổ biến trong các phản ứng tổng hợp hữu cơ được thực hiện trong lò vi sóng do có độ an toàn cao khi tiến hành phản ứng trong bình mở Ngoài ra, xúc tác chuyển pha cũng được ứng dụng rộng rãi trong kĩ thuật tiến hành phản ứng trong lò vi sóng [127].

Từ những nghiên cứu tổng quan ở trên ta rút ra một số nhận xét sau:

- Isatin (1H-Indole-2,3-dione) và các dẫn xuất của nó có nhiều tính chất dược

lý quan trọng như kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, chống phân bào, ức chế men MAO, kháng lao.

- Monosaccaride đã và đang được nghiên cứu rộng rãi Việc gắn kết các dị vòng vào phân tử monosaccaride hứa hẹn mang lại nhiều tính chất mới, đặc biệt là các tính chất sinh học.

- Các hợp chất dị vòng 1,2,3-triazole có khả năng kháng lao và chống nấm rất tốt, đặc biệt khả năng chống nấm bội nhiễm.

- Việc kết nối bằng hóa học click giữa vòng isatin và hợp phần monosaccaride mang các nhóm chức thích hợp qua cầu nối là vòng 1,2,3-triazole hứa hẹn có thể mang lại các hoạt tính sinh học đáng chú ý cho các phân tử đích.

- Trên cơ sở đó, chúng tôi dự kiến sẽ tổng hợp một số dẫn xuất 1-alkyne và azido của isatin, từ đó thực hiện phản ưng click sử dụng xúc tác Cu(I), dung môi đa dạng bằng các phương pháp như khuấy cách thủy, siêu âm, vi sóng để tìm ra phương pháp tối ưu.

- Cấu trúc sản phẩm sẽ được xác nhận bằng các dữ liệu phổ IR, NMR và MS - Hoạt tính của một số sản phẩm sẽ được lựa chọn trên cơ sở nghiên cứu các tài liệu tham khảo.

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Hóa chất và thiết bị

2.1.1.1 Hóa chất và dung môi

Các hóa chất được sử dụng trong luận án được mua từ các công ty hóa chất thương mại như Merck (Đức), Sigma Aldrich (Merck KgaA, Mĩ), Xilong Scientific

(Trung Quốc), bao gồm isatin không thế, p-methylaniline, 2,3-dimethylaniline, 2,4-dimethylaniline, o-methylaniline, p-ethylaniline, p-isopropylaniline, 5-chloro-2-methylaniline, p-fluoroaniline, p-chloroaniline, p-bromoaniline, p-iodoaniline,

glucose, galactose, tosyl chloride, propargyl bromide, alkyl dibromide (với các

chiều dài mạch carbon là n = 2, 3, 4, 5, 6 và 8 nguyên tử carbon), natri azide, natri

hydride, natri sulfate, kali carbonate, chloral hydrate, hydroxylamine hydrochloride,

acid sulfuric,… Các dung môi sử dụng cho phản ứng bao gồm tert-BuOH, EtOH,

DMF, acetone, acetonitrile, DMSO Các dung môi sử dụng cho sắc kí cột bao gồm

n-hexane, ethyl acetate, dichloromethane (Trung Quốc) 2.1.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Điểm nóng chảy được đo trên thiết bị đo điểm nóng chảy STUART SMP3 (BIBBY STERILIN-UK) Phổ IR được đo trên phổ kế Impact 410 FT-IR Spectrometer (Nicolet, USA) ở dạng viên ép với KBr Phổ 1H NMR và 13C NMR được đo trên phổ kế NMR Avance Spectrometer AV500 (Bruker, Germany) ở

500,13 MHz và 125,77 MHz tương ứng, trong dung môi DMSO-d6 và dùng chất

chuẩn nội TMS hoặc trên thiết bị NMR Avance NEO (Bruker, Germany) ở 600,36 MHz và 150,97 MHz tương ứng Phổ khối lượng được ghi trên máy LTQ Orbitrap XLTM (Thermo Scientific, USA), dung môi dùng để hoà tan mẫu là methanol.

2.1.2 Phương pháp tổng hợp hữu cơ

Các hợp chất đã nhận được trong luận án được tổng hợp dựa theo các nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hoá học hữu cơ với ba phương pháp gia nhiệt cho hỗn hợp phản ứng như sau [128]:

+ Phương pháp đun nóng hồi lưu truyền thống: Phương pháp này thường sử

dụng một lượng lớn dung môi và thời gian phản ứng kéo dài (từ vài giờ cho đến vài ngày).

+ Phương pháp gia nhiệt cho phản ứng nhờ lò vi sóng: Phương pháp này chỉ

sử dụng một lượng dung môi tối thiểu, với việc thực hiện phản ứng ở các khoảng thời gian gián đoạn, cho phép rút ngắn thời gian phản ứng Tuy nhiên, với những hợp chất hoặc tác nhân kém bền nhiệt thì không thể sử dụng phương pháp này, hoặc nếu sử dụng thì cần phải lưu ý đến khoảng thời gian chiếu xạ vi sóng.

+ Phương pháp siêu âm: Phương pháp này có nhiều ưu điểm như rút ngắn

thời gian phản ứng, tiến hành phản ứng dễ dàng, phản ứng xảy ra chọn lọc và việc cô lập sản phẩm dễ dàng hơn.

Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau, trong quá trình làm thực nghiệmcác phương pháp nêu trên đã được khảo sát để đạt được hiệu quả tổng hợp cao (về thời gian phản ứng, hiệu suất sản phẩm).

2.1.3 Phương pháp tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết

- Nhiệt độ nóng chảy được đo bằng phương pháp đo mao quản trên máy điểm

nóng chảy STUART SMP3 (BIBBY STERILIN - Anh) [128].

- Phương pháp kết tinh lại được thực hiện trong các dung môi thông thường

(như ethanol, methanol, toluene) Trong một số trường hợp, các hệ dung môi được

sử dụng, như ethanol:toluene, n-hexane:ethyl acetate,… nhằm cải thiện độ tan của

sản phẩm chính và của tạp chất.

- Sắc kí lớp mỏng (TLC, Thin-Layer Chromatography): Là một phương pháp

quan trọng trong tổng hợp hữu cơ, dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế

bằng cách kết tinh lại hoặc phân lập bằng sắc kí cột [128] Sắc kí lớp mỏng được

tiến hành trên lớp mỏng silica gel tráng sẵn Silufol 60 F254 (Merck, Đức), được hoạt

hoá trong tủ sấy ở 110°C trong 30 phút Hệ dung môi (là hỗn hợp của n-hexane và

ethyl acetate với các tỉ lệ thể tích khác nhau) dùng để triển khai phụ thuộc vào đặc điểm cấu trúc của từng dãy chất Mẫu thử được hoà tan trong dung môi thích hợp (thường là dichloromethane do hầu hết các hợp chất nghiên cứu của luận án đều tan tốt trong dung môi này)

- Sắc kí cột (CC, Column Chromatography): Là một trong những phương

pháp hữu ích nhất để phân tách và tinh chế cả chất rắn lẫn chất lỏng khi thực hiện các thí nghiệm ở qui mô vi lượng Các hợp chất phân cực sẽ tương tác với silica gel mạnh hơn với các hợp chất không phân cực nên sẽ đi ra khỏi cột (hoặc rửa giải) sau

các hợp chất không phân cực Khi một mẫu có chứa các hợp chất có độ phân cực tương tự nhau, việc phân tách chúng ở các phần nhỏ và thu hồi mẫu sạch sẽ rất khó

hợp (n-hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol, acetone, ) hoặc hỗn hợp giữa

chúng [128].

2.1.4 Phương pháp chiết lỏng-lỏng

Là phương pháp được thực hiện dựa trên cơ sở sự phân bố (hay hòa tan) khác nhau của chất phân tích vào trong 2 pha (2 dung môi) không trộn lẫn vào nhau Tức là các chất phân tích tan tốt trong dung môi này nhưng lại không tan tốt trong dung môi kia, nhờ đó mà chất phân tích được lấy ra khỏi pha mẫu ban đầu, chuyển nó vào pha thứ hai (dung môi) Vậy, yếu tố quyết định hiệu quả chiết là hệ số phân bố của chất phân tích trong 2 pha, khi hệ số phân bố lớn sẽ có hiệu suất chiết cao [1].

2.1.5 Phương pháp phân tích cấu trúc

Các phương pháp phổ hiện đại (IR, NMR và MS) đã được sử dụng để xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp được.

2.1.5.1 Phổ IR

Phổ IR được đo trên máy phổ Nicolet Magna 760 FTIR Spectrometer hoặc Nicolet Impact 410 FTIR Spectrometer (NICOLET, Mỹ) bằng phương pháp đo phản xạ trên mẫu bột KBr và phương pháp ép viên với bột KBr Phổ được ghi trong vùng 4000−500 cm−1, độ phân giải 4 cm−1 Phổ IR cho phép ta xác định sự có mặt của các nhóm chức trong phân tử hợp chất đã tổng hợp, từ đó giúp cho việc xác định các nhóm chức thay đổi như thế nào trong quá trình chuyển hoá các hợp chất [129].

2.1.5.2 Phổ NMR

Phổ 1H NMR và 13C NMR được đo trên máy phổ ADVANCE AV500 (Bruker,

Đức) có tần số máy 500 MHz và ADVANCE NEO (Bruker, Đức) có tần số máy

600 MHz, dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội TMS ở nhiệt độ phòng (300 K) Phổ

1H NMR được đo ở tần số máy 500,13 MHz/600,36 MHz và phổ 13C NMR được đo ở tần số máy 125,76 MHz/150,97 MHz tương ứng Phổ 1H NMR được lấy đến số thập phân thứ hai và phổ 13C NMR được lấy đến số thập phân thứ nhất Một số hợp chất đại diện trong từng dãy chất đã tổng hợp đã được đo phổ 2D NMR (bao gồm

phổ COSY, HSQC, và HMBC) [129, 130] Phổ 1H NMR cho biết trong phân tử hợp chất có bao nhiêu loại proton

Phổ 1H NMR cung cấp các dữ liệu về độ chuyển dịch hoá học H (ppm) tỉ lệ cường độ giữa các tín hiệu cộng hưởng, độ bội và dạng tín hiệu cộng hưởng, hằng

số ghép cặp J (Hz), sự tương quan giữa các hằng số ghép cặp này, từ đó giúp cho

việc khẳng định khung cấu trúc và vị trí của các nhóm thế trong phân tử Phổ 13C NMR cho biết trong phân tử hợp chất có bao nhiêu loại nguyên tử carbon, độ chuyển dịch hoá học C và bậc của các nguyên tử carbon, và được sử dụng cùng với phổ 1H NMR để xác định cấu trúc của hợp chất cũng như vị trí của các nhóm thế [129, 130].

2.1.5.3 Phổ MS

Phổ MS được ghi trên một số loại máy phổ, khác nhau về phương pháp ion hoá (EI hoặc ESI) Phổ MS cho biết số khối của ion phân tử hoặc ion “giả phân tử” ([M+H]+, [M+Na]+, [M-H]-) để từ đó xác định được trọng lượng phân tử của hợp chất đã được ghi phổ có phù hợp với trọng lượng phân tử của hợp chất dự kiến được tổng hợp hay không [129] Trong một số trường hợp, sự phân mảnh trong phổ MS còn giúp cho việc khẳng định cấu trúc hợp chất đã tổng hợp Các máy phổ MS đã

được sử dụng trong luận án là LTQ OrbiTrap XL (Thermo Scientific, Mĩ) và LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies, Mĩ), sử dụng phương pháp ion hoá ESI (phunmù điện) Máy phổ có độ phân giải R = 60.000 Các ion có số khối m/z được ghi

nhận tới số thập phân thứ 2 Tuỳ theo phương thức phá mẫu (ESI+ hoặc ESI−) mà ion ghi nhận được là ion dương hoặc ion âm Do năng lượng bắn phá nhỏ nên sự phân mảnh là không đáng kể, song pic ion phân tử (M+) hoặc pic “giả phân tử” ([M+H]+ , [M+Na]+ hoặc [M−H]−) thường có cường độ tương đối khá lớn.

2.1.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của một số hợp chất được nghiên cứu theo phương pháp

kháng vi sinh vật kiểm định trên một số vi khuẩn điển hình (xem Phần 2.1.6.1) tại

Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên/Viện Hàn lâm KH-CN Việt Nam và hoạt

tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô và ung thư gan (xem Phần

2.1.6.2) tại Phòng Hóa sinh Ứng dụng/Viện Hóa học/Viện Hàn lâm KH-CN Việt Nam.

2.1.6.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định1) Nguyên tắc của phép thử

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane & Kandel (1996).

2) Các chủng vi sinh vật kiểm định

a Những vi khuẩn và nấm tiêu biểu cho thử nghiệm bao gồm:

- Bacillus subtilis (ATCC 11774): là trực khuẩn Gram-(+), sinh bào tử,

thường không gây bệnh.

- Staphylococcus aureus (ATCC 11632): cầu khuẩn Gram-(+), gây mủ vết

thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và cơ quan nội tạng.

- Escherichia coli (ATCC 25922): vi khuẩn Gram-(−), gây một số bệnh về

đường tiêu hóa như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923): vi khuẩn Gram-(−), trực khuẩn

mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Candida albicans (ATCC 7754): nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ

em và các bệnh phụ khoa.

- Saccharomyces cerevisiae (SH 20): nấm men, được sử dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực.

- Aspergillus niger (439): là một loại nấm sợi, có khả năng gây nhiễm trùng.- Fusarium oxysporum (M42): là một loại nấm sợi, gây bệnh cho cây.

b Môi trường thử nghiệm:

- Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB-Sigma) cho nấm men và nấm mốc Trypcase Soya Broth (TSB-(SDB-Sigma) cho vi khuẩn.

- Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.

3) Phương pháp tiến hành

- Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng theo tiêu chuẩn McFarland rồi tiến hành thí nghiệm.

- Các phiến thí nghiệm để trong tủ ấm 37 oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30 oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.

4 Xử lý kết quả

- Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu: Các mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ mà ở đó vi sinh vật bị ức chế gần như hoàn toàn.

- Nồng độ ức chế 50% vi sinh vật (IC50) của mẫu có hoạt tính: Các mẫu có tính hoạt tính được pha loãng theo 10 thang nồng độ Gía trị IC50 được xác định bằng chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển của vi sinh vật và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.

- Đánh giá hoạt tính: dịch chiết có IC50 < 100 µg/mL; chất sạch có IC50 < 25 µM Hoặc mẫu thô có MIC ≤ 200 µg/mL ; chất sạch có MIC ≤ 50 µg/mL.

Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp.

- Chứng âm tính: Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử Việc thăm dò hoạt tính sinh học được thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên/Viện Hàn lâm KH-CN Việt Nam Các kết quả về thăm dò hoạt

tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro được trình bày ở Phần 3.8.1.2.1.6.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro

1) Nguyên tắc của phương pháp

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (là tên viết tắt của hợp chất 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl )-2,5-diphenyltetrazoli) được mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosman, 1983 [131] Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể Sản

phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm Giá trị thể hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển củatế bào) [132].

2) Chuẩn bị thí nghiệm

Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC) gồm: Ung thư biểu mô biểu mô KB (CCL-17TM), ung thư gan Hep G2 (HB-8065TM) Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37 oC, vô trùng tuyệt đối) Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.

Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/ mL Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2560, 640, 160, 40 và 10 µg/mL Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128, 32, 8, 2 và 0,5 µg/mL Chất tham chiếu Ellipticine được pha trong DMSO với nồng độ 0,01 mM.

3) Tiến hành thí nghiệm

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 1-3x104 tế bào/mL tùy theo từng dòng tế bào) Lấy vào mỗi giếng 10 µL chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µL dung dịch tế bào Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn Sau 72 giờ mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 µL MTT (5 mg/mL) trong 4h Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 µL DMSO 100%.

Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Biotek Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

4) Xử lí kết quả thực nghiệm

Giá trị IC50 được xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata.

% ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (−)) x 100% IC50 = HighConc - (HighInh% - 50) x (HighConc - LowConc)

HighInh% - LowInh%

(Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp; HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp).

5) Đánh giá hoạt tính

Giá trị IC50 ≤ 20 µg/mL (với dịch chiết thô) và IC50 ≤ 4 µg/mL (với chất sạch) được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào Các kết quả hoạt tính gây độc tế

bào in vitro được trình bày ở Phần 3.8.2.